Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

Dit protocol is ontworpen om ervoor te zorgen dat problemen die vaak worden ondervonden tijdens tijdopgenomen seriële kristallografische experimenten de kwaliteit van de gegevens niet in gevaar brengen. Een groot voordeel van deze methode is het aanpassingsvermogen aan individuele kristalsystemen. De high speed camera extrusie test stelt ons ook in staat om direct extrusie stabiliteit te meten.

Laad eerst 50 microliter kristallecoololeine op basis van LCP in een 100 microliterspuit ongeveer 30 minuten voor de injectie. Voor injectie in een vacuümomgeving, laad vijf microliters van MAG 7.9 en vijf microliter van vloeibare paraffine in de rug van een tweede spuit. Houd de spuit verticaal vast, verdring de luchtbellen uit de spuit.

Sluit de spuit aan met MAG 7.9 en paraffine op een standaard spuitkoppeling. En zuiver de lucht van de koppeling door zachtjes op de zuiger te drukken totdat een klein volume van het mengsel zichtbaar is aan het uiteinde van de koppelingsnaald. Sluit de monsterspuit aan op de spuitkoppeling die de auto neemt om geen lucht in het monster te introduceren.

Meng de lipide en paraffine door het monster meerdere keren door de koppeling te laten gaan. Laad vervolgens 20 microliter voorgemengde LCP in nog eens 100 microliterspuit. Haal de lege spuit uit de koppeling en bevestig de voorgemengde LCP aan het kristal met spuit met behulp van een standaard spuitkoppeling.

Geef het monster vervolgens 100 keer door de koppeling. Om het monster in de kubieke fase te brengen, voeg drie microliter monoolein toe en meng 50 keer. Herhaal deze procedure totdat een transparante fase is gevormd om een overmaat aan monoolein te voorkomen.

Als een voorlopige test voor monster stijfheid en extrudabiliteit, los de lege spuit van de spuit koppeling, en het houden van de spuit verticaal, knijp een kleine hoeveelheid sampler door de koppeling. Als het geëxtrudeerde monster een rechtopstaande cilinder vormt, is het monster klaar voor extrusietests. Pas het totale volume van het monster aan op 100 microliters door meer voorgemengde LCP toe te voegen.

Bevestig de monsterspuit en twee lege spuiten aan de driewegspuitenkoppeling. Meng ten minste 50 keer door de helft van het monster in de tweede spuit te laten passeren en druk vervolgens tegelijkertijd op beide helften van het monster in de derde spuit. Plaats de spuit met het gemengde monster onder een stereomicroscoop om een homogene verdeling van kristallen te verifiëren.

Zuiver een HPLC-pomp en alle waterleidingen om ervoor te zorgen dat de stroomsnelheden nauwkeurig zijn. Zuiver vervolgens de hydraulische fase van de injector. Schakel vervolgens de camera in en sluit de camera aan op de meegeleverde software.

Met een live video die wordt uitgevoerd voor visuele feedback, plaatst u de nozzle-tip in het midden van het frame en brengt u deze in beeld met de drieassige fase. Stel de framesnelheid op de camera in op 1.000 frames per seconde. Stel vervolgens de resolutie in op 512 bij 512 pixels.

Als de belichtingstijd nu is ingesteld door de framesnelheid, past u het verlichtingsniveau aan totdat het mondstuk zichtbaar is. Plaats de nozzle-tip zo dat deze gecentreerd naar links naar rechts en zich in het bovenste derde deel van het frame bevindt. Stel de camera in timelapse-modus in.

Stel het interval in op 30 seconden en de herhalingen op 40 keer. Stel de triggermodus in op willekeurig. En voer het aantal frames in om op te nemen tot 1.000.

Laad nu het reservoir met 20 microliter van het testmonster en bevestig de capillaire mondstuk. Bevestig het gevulde reservoir aan de injector. Bevestig vervolgens de gasleiding aan de haven op het mondstuk en start de gasstroom.

Start hierna tegelijkertijd de pomp en de camera-opname. Controleer de extrusie totdat de pompdruk scherp opvoert in de buurt van de verwachte eindtijd. Stop vervolgens met opnemen, schakel de pomp uit en ontlucht de systeemdruk door de hulpklep te openen.

Open hierna het videobestand met de analysesoftware en kalibreer de meettools. Zoek een frame in de video waar er een traceerbare functie zichtbaar is in de extrusie. Neem het framenummer op.

Vervolgens u de video verplaatsen naar een frame waarin dezelfde functie zichtbaar is, maar in de vorige stap van zijn positie is verwijderd. Neem het framenummer op. Met behulp van het meetinstrument rechte lijn meet je de afstand tot het begin- en eindpunt van de functie via een analysemeting.

Herhaal de vorige stappen een paar keer voor elk segment van de video. Tot slot, plot de data-serie. Het ideale uitgangsmateriaal voor de hier beschreven procedure is hoge dichtheden van microkristallen opgenomen in een viskeuze drager medium voor de injector.

Eiwitkristallen werden gebruikt om TRSFX-gegevens te verzamelen over de protonpomped bacteriën rhodopsine, die de ultrasnelle veranderingen die optreden na fotonabsorptie onthuld. Na monstervoorbereiding met behulp van een driewegkoppeling, toont visuele inspectie van het materiaal in de spuit monsterhomogeniteit. Microscoopbeelden kunnen de dichtheid van de kristallen bevestigen.

Het monster bevindt zich in de kubieke fase wanneer het leveringsmedium helder en stroperig is. Troebelmengsels zijn een aanwijzing dat het monster zich in een spons- of lamellenfase bevindt, maar niet overtuigend is omdat een hoge kristaldichtheid de helderheid van de LCP kan verdoezelen. Een lagedruktest om de sponsfase te identificeren kan worden uitgevoerd door de spuitzuiger uit de buurt van het monster te trekken.

Tijdens de straaltest moet het monster een lange continue kolom van LCP extruderen die met een bijna constante snelheid beweegt. Monsters die in een druipmodus worden uitgevoerd, geven aan dat de viscositeit te laag is. Gegevens uit monsters die een kolom vormen, moeten aantonen dat de extrusie boven een minimumsnelheid blijft die wordt bepaald door de experimentele parameters.

Na optimalisatie met behulp van dit protocol kunnen seriële kristallografische gegevens worden verzameld in een expertfaciliteit. Dit zal onthullen de conformatie veranderingen in het hele eiwit als het zijn functie vervult.