Name: Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Leer fagocytose-analyse van alveolaire macrofagen in muizen met in vitro en in vivo technieken voor Pseudomonas aeruginosa. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van bacteriële klaring in longen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt ondersteund door de toekenning van R01HL116826 aan X. Zhao.

Dit protocol volgt de richtlijnen van de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Oost-Virginia Medical School.
1. fluorescerende kralen fagocytose
<ol><li>Euthanaseren van de muisknop (C57BL/6J, 6 weken oud, vrouwelijke) door CO2 verstikking per IACUC protocollen voor de ethische euthanasie van dieren.</li>
	<li>Leg de muis belly-up op een bord van de dissectie bedekt met papieren handdoeken. Pins zijn poten naar beneden met haar ledematen spread-eagle en haak een tekenreeks krachtens haar voortanden te trekken van haar hoofd terug, zodat de luchtpijp is rechtstreeks geplaatst en niveau.</li>
	<li>Natte keel, borst en buik met 70% ethanol te ontsmetten en te voorkomen dat de vacht kleven aan de tools van de muis.</li>
	<li>Met behulp van reguliere pincet, trek de huid op de middellijn van het lichaam, en snijd met een chirurgische schaar van de middellijn naar de top van de keel.</li>
	<li>Met het botte uiteinde van standaard chirurgische scharen, zorgvuldig opzijschuiven van de spier- en bindweefsel bij de keel en voorjaar schaar (microscissors) gebruiken om de luchtpijp bloot te stellen.</li>
	<li>Een ring van kraakbeen met de pincet greep zorgvuldig maken een kleine snede (~1.5 mm), met behulp van microscissors, op het gezicht van de hartkamer van de luchtpijp en invoegen van een canule 18 G in de luchtpijp.</li>
	<li>Zachtjes lavage 3 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), 1 mL tegelijkertijd. Telkens wanneer zachtjes trekken de vloeistof in de spuit en reinfuse het terug in de Long, 3 x achter elkaar. Na het verzamelen van de BALF, cervicale dislocatie om euthanasie uit te voeren. De verzamelde PBS (~2.8 mL), oftewel bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF), overbrengen in een buis, centrifuge op 1.000 x g gedurende 10 minuten, en het verzamelen van de pellet. Voeg 1 mL verse PBS aan de buis en centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten voor het wassen van het puin en verzamelen de Ingehuld alveolaire macrofagen.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 2 mL zuiver Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% nonheat-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en cultuur primaire alveolaire macrofagen in de dezelfde media voor 2 dagen op een glazen-bodem schotel bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.</li>
	<li>De oude media gecombineerd, wassen met PBS 1 mL en voeg toe 2 mL verse media. Voeg FITC kralen (carboxylate latex kralen, 2 µm in diameter, 50 kralen/cel) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer.</li>
	<li>Uitgebreid wassen met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) te verwijderen van extracellulaire kralen. Willekeurig beeld van 100 cellen en cellen met intracellulaire kralen tellen (488 nm). Opmerking: Phagocytic indexen zijn het aantal geconsumeerde kralen gedeeld door het totale aantal macrofagen; het percentage fagocytische cellen is het getal van de macrofagen die ten minste één parel gedeeld door het totale aantal macrofagen16inslikken.<ol>
<li>Uitwijkmogelijkheid, na een 1 uur incubatie met kralen, wassen van de cellen met 3 mL PBS en verwerken voor stroom cytometry voor de kwantificering van fagocytose. Op dezelfde manier verwerken als AMs kralen als onbevlekt cellen of cellen. Berekenen de percentage-positiviteit en betekenen van de intensiteit van de fluorescentie, softwarematig stroom cytometry, door deze opties te selecteren in de software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. FcγR - en CR-gemedieerde fagocytose
<ol><li>Incubeer voor de opsonization, 2 x 108 schapen rode bloedcellen (SRBCs) met 50 µL konijn anti-SRBC-IgM of 50 µL konijn anti-SRBC-IgG gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur11.</li>
	<li>Incubeer IgM-opsonized SRBCs met 50 µL van C5-deficiënte (C5D) menselijk serum gedurende 30 minuten bij 37 ° C om op te lossen de aanvulling fragmenten C3b en C3bi op IgM beklede SRBCs.</li>
	<li>Zaad lymfkliertest macrofaag cellen (MH-S cellen) (10.000 cellen per putje) in een 96-wells-plaat en 's nachts om een samenloop van ~ 70% uit te broeden. Voeg 100 µL van 1 x 107/mL opsonized SRBCs aan elk putje van MH-S cellen en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Wash unbound SRBCs zeer snel (~ 1 min) met 100 µL van ammoniumchloride-kalium (ACK) lysis-buffermengsel.</li>
	<li>Lyse de cellen met 0,1% SDS en voeg 50 µL van 2,7-diaminofluorene (DAF) met 3% waterstofperoxide en 6 M ureum. Meet de extinctie van de vorming van hemoglobine-gekatalyseerde fluoreen blauw op 620 nm.</li>
	<li>Bepaal het aantal SRBCs met behulp van een standaard curve op 620 nm extinctie waarden met een bekende aantal SRBCs. Evenzo proces MH-S cellen geïncubeerd met nonopsonized SRBCs om te gebruiken als negatieve controles.</li>
</ol>3. PRR-gemedieerde fagocytose
<ol><li>Volg stappen 1.1-1.9 voor de isolatie en het kweken van de muis primaire alveolaire macrofagen.</li>
	<li>Na 2 dagen, verwijder het medium, wassen van de cellen met 1 mL PBS en voeg 500 µL van verse medium met Alexa Fluor-488-geconjugeerd zymosan-A bioparticles (100 deeltjes/schotel).</li>
	<li>Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C. Stop de fagocytose door 500 µL van ijskoude PBS toe te voegen.</li>
	<li>Wassen van de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten). Het herstellen van de cellen met de 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de cellen uitgebreid met PBS (1 mL tegelijk, voor een totaal van vijf wasbeurten) en houden van de cellen in 500 µL van PBS.</li>
	<li>Afbeelding van de cellen onder de differentiële interferentie contrast en een fluorescerende kanaal op 488 nm. AMs zymosan-A bioparticles met tellen en bepalen van het percentage van fagocytose.</li>
</ol>4. in Vivo fagocytose door alveolaire macrofagen
Opmerking: P. aeruginosa GFP worden geënt op een plaat nutriëntagar en Incubeer de plaat bij 37 ° C's nachts. Op de volgende dag, de één kolonie aan nutriënten Bouillon 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts.
<ol><li>De volgende dag, anesthetize muizen met een intraperitoneale toediening van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine. Juiste afstomping via een gebrek aan respons op de teen snuifje bevestigen.</li>
	<li>Leg de muis op een plat bord met een elastiekje over de bovenste snijtanden en plaats deze in de positie van een semirecumbent (45°) met het ventrale oppervlak en de tribune naar boven gericht. De tong met gebogen pincet, gedeeltelijk worden ingetrokken. Met behulp van een microsprayer, intratracheally 50 µL (5 x 106 kolonie-vormende eenheden [CFU])17 van P. aeruginosa GFP in de longen van de narcose muizen beheren.</li>
	<li>Na 1 h van besmetting, stappen 1.1-1,7.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in PBS en cytocentrifuge hen (1.000 x g, 1 minuut bij kamertemperatuur) op een glasplaatje.</li>
	<li>Differentieel vlek de cytospin dia's voor alveolaire macrofagen en neutrofielen lymfocyten, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Willekeurig selecteren 100 AMs, tellen de AMs met intracellulaire bacteriën en bepalen van het percentage van fagocytose.</li>
</ol>5. in Vivo bacteriën met behulp van Clearance P. aeruginosa
<ol><li>P. aeruginosa op een P. aeruginosa isolatie agarplaat beënten en incuberen de plaat bij 37 ° C's nachts. De één kolonie lysogenie Bouillon (LB) 2 mL beënten en groeien de bacteriën bij 37° C's nachts. De CFU, met de volgende formule worden berekend. CFU/mL (aantal kolonies x verdunningsfactor) = / volume van de cultuur-plaat. De cultuur met PBS te krijgen de gewenste CFU/mL verdund.</li>
	<li>In proef 1, intratracheally injecteren een subletale dosis ~2.5 x 105 CFU/mL P. aeruginosa narcose wild-type (WT) en TRIM72KO muizen, zoals in stap 4.2. Meten van het lichaamsgewicht dagelijks voor 6 dagen.</li>
	<li>In proef 2, door een tweede dosis van P. aeruginosa (5 x 105 van CFU/mL) te injecteren in de muizen die overleefde in trial 1 en meten van het lichaamsgewicht voor 4 dagen.</li>
	<li>In proef 3, gebruik van een andere set van muizen, injecteren WT en TRIM72KO muizen met een dodelijke dosis (3 x 107 CFU/mL) P. aeruginosa en opnemen van de sterfte binnen 2 dagen na de injectie. Dieren tekenen van ernstige stress zoals significante lichaam gewichtsverlies, zal gebogen rug, anorexia of kortademigheid worden beoordeeld door de behandelende dierenartsen. Onbehandelbaar dieren zullen onmiddellijk worden opgeofferd.</li>
	<li>Bij dood of na euthanasie op dag 2 na de injectie, verzamelen het gehele longweefsel voor de kwantificering van de Long bacteriële lasten op piek infectie.</li>
	<li>Testen van de Long bacteriële last, 200 µL van normale zout toevoegen aan de weefsels van de longen en meng ze, met behulp van een eerder geteste instelling op een elektronische homogenizer die volledig het longweefsel verstoort zonder verbreking van de bacteriën. Het totale volume van de Long homogenaat naar 1 mL en plaat 100 µL van Long lysate op Pseudomonas isolatie agar platen in 10-fold seriële verdunningen.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur en tellen de bacteriële kolonies en controleer de kve per hele Long.</li>
</ol>6. statistische analyse
<ol><li>Gebruik van de Student t-test om te bepalen van de statistische significantie van het verschil tussen de twee groepen. Overwegen een verschil statistisch significant wanneer p < 0.05. Alle gegevens worden gepresenteerd zoals betekent ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM).</li>
</ol>

<ol><li>Hussell, T., Bell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+plasticity+in+a+tissue-specific+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context.</a> Nature Reviews Immunology. 14, 81-93 (2014).</li>
<li>Belchamber, K. B. R., Donnelly, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Dysfunction+in+Respiratory+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Results+and+Problems+in+Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Macrophage Dysfunction in Respiratory Disease.</a> Results and Problems in Cell Differentiation. 62, 299-313 (2017).</li>
<li>Broug-Holub, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+are+required+for+protective+pulmonary+defenses+in+murine+Klebsiella+pneumonia%3A+elimination+of+alveolar+macrophages+increases+neutrophil+recruitment+but+decreases+bacterial+clearance+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages are required for protective pulmonary defenses in murine Klebsiella pneumonia: elimination of alveolar macrophages increases neutrophil recruitment but decreases bacterial clearance and survival.</a> Infection and Immunity. 65, 1139-1146 (1997).</li>
<li>Knapp, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+have+a+protective+antiinflammatory+role+during+murine+pneumococcal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages have a protective antiinflammatory role during murine pneumococcal pneumonia.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 171-179 (2003).</li>
<li>Bhatia, M., Zemans, R. L., Jeyaseelan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+chemokines+in+the+pathogenesis+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of chemokines in the pathogenesis of acute lung injury.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46, 566-572 (2012).</li>
<li>Marriott, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+regulates+CXCL8+release+and+influences+disease+outcome+in+response+to+Streptococcus+pneumoniae%2C+defining+intercellular+cooperation+between+pulmonary+epithelial+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages.</a> Infection and Immunity. 80, 1140-1149 (2012).</li>
<li>Greenlee-Wacker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+neutrophils+and+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic neutrophils and resolution of inflammation.</a> Immunological Reviews. 273, 357-370 (2016).</li>
<li>Haslett, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+apoptosis+and+its+role+in+the+resolution+and+control+of+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Granulocyte apoptosis and its role in the resolution and control of lung inflammation.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160, 5-11 (1999).</li>
<li>Cox, G., Crossley, J., Xing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+engulfment+of+apoptotic+neutrophils+contributes+to+the+resolution+of+acute+pulmonary+inflammation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage engulfment of apoptotic neutrophils contributes to the resolution of acute pulmonary inflammation in vivo.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 12, 232-237 (1995).</li>
<li>Groves, E., Dart, A. E., Covarelli, V., Caron, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+phagocytic+uptake+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammalian cells.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65, 1957-1976 (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Opsonic+Phagocytosis+via+Fc%CE%B3+Receptors+and+complement+receptors+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Measuring Opsonic Phagocytosis via Fcγ Receptors and complement receptors on macrophages.</a> Current Protocols in Immunology. , CHAPTER: Unit-14.27 (2011).</li>
<li>He, J. Q., Wiesmann, C., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+of+macrophage+complement+receptor+CRIg+in+immune+clearance+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role of macrophage complement receptor CRIg in immune clearance and inflammation.</a> Molecular Immunology. 45, 4041-4047 (2008).</li>
<li>Nagre, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Complement+Receptor+CRIg+by+TRIM72+Polarizes+Innate+Immunity+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Complement Receptor CRIg by TRIM72 Polarizes Innate Immunity of the Lung.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 58 (6), 756-766 (2018).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Method+to+Determine+the+Engulfment+of+Apoptotic+Cells+by+Macrophages+using+pHrodo+Succinimidyl+Ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Novel Method to Determine the Engulfment of Apoptotic Cells by Macrophages using pHrodo Succinimidyl Ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Su, H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+exercise+enhances+phagocytosis+by+murine+bronchoalveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Severe exercise enhances phagocytosis by murine bronchoalveolar macrophages.</a> Journal of Leukocyte Biology. 69, 75-80 (2001).</li>
<li>Amiel, E., Lovewell, R. R., O'Toole, G. A., Hogan, D. A., Berwin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa.+evasion+of+phagocytosis+is+mediated+by+loss+of+swimming+motility+and+is+independent+of+flagellum+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa. evasion of phagocytosis is mediated by loss of swimming motility and is independent of flagellum expression.</a> Infection and Immunity. 78, 2937-2945 (2010).</li>
<li>Giannoni, E., Sawa, T., Allen, L., Wiener-Kronish, J., Hawgood, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+Proteins+A+and+D+Enhance+Pulmonary+Clearance+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Surfactant Proteins A and D Enhance Pulmonary Clearance of Pseudomonas aeruginosa.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 704-710 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Tijdens het uitvoeren van een gas uitwisseling functie, confronteert de Long hardnekkig lichaamsvreemde deeltjes, pathogenen en allergenen. AMs zijn de eerste verdedigingslinie uit hoofde van hun belangrijkste functie, namelijk fagocytose. AMs ook coördineren met andere immuuncellen in het vernietigen van de ziekteverwekkers en in de resolutie van de ontsteking. Hier, beschreven we methoden voor de beoordeling van specifiek fagocytose door AMs geïsoleerd van de muis Long. Het protocol gepresenteerd in dit manuscript verk...

AMs zijn de grote resident fagocyten in de longblaasjes in de rust stadium en één van de belangrijke spelers van aangeboren immuunresponsen door de erkenning en de internalisering van de geïnhaleerde ziekteverwekkers en lichaamsvreemde deeltjes1,2. Er werd gemeld dat AMs essentieel voor de snelle goedkeuring van de vele pulmonaire ziekteverwekkers zoals P. aeruginosa en Klebsiella longontsteking3,4, zijn dus een tekort aan AM fagocytose vaak in respiratoire resulteert infecties, zoals acute longontsteking, waardoor hogere mortaliteit en morbiditeit tarieven.
AMs ook aangeboren inflammatoire reacties in de longen door de productie van cytokines en chemokines zoals TNF-α en IL-1β, welke Overspraak met andere cellen van de alveolaire milieu te produceren chemokines en werven van inflammatoire neutrofiele granulocyten, monocyten, starten en adaptieve immune cellen in de longen5. Bijvoorbeeld, helpt IL-1β, geproduceerd door AMs om de vrijlating van de neutrofiele chemokine CXCL8 van epitheliale cellen6prime. Bovendien, AMs bijdragen aan de fagocytose van apoptotic polymorfonucleaire leukocyten (PMNs), niet van die leidt tot de aanhoudende lekkage van intracellular enzymen uit PMNs het omgevende weefsel, wat resulteert in weefselschade en langdurige ontsteking 7 , 8 , 9.
Fagocytose door de AMs is bemiddeld door een directe erkenning van pathogen-geassocieerde moleculaire patronen aan het oppervlak van de ziekteverwekker door de patroon erkenning receptoren (PRRs) van de AMs of door de binding van opsonized pathogenen met immuun effector receptoren van de AMs 10. voor het laatste, AMs herkent de doelstellingen opsonized met immunoglobuline (IgG) via hun Fcγ receptoren (FcγR) of de ziekteverwekkers bekleed met aanvulling fragmenten, C3b en C3bi, door hun aanvulling receptoren (CR),11. Onder aanvulling receptoren, de CR van de immunoglobuline superfamilie (CRIg) wordt selectief uitgedrukt in weefsel macrofagen12, en een recente bevinding benadrukte de rol van de CRIg in AM fagocytose in het kader van P. aeruginosa longontsteking 13.
Veel originele studies methoden gebruiken om te evalueren van de macrofaag fagocytose om te beschrijven van de moleculaire mechanismen van macrofaag functie14,15. Methoden zoals in vivo fagocytose vereisen echter een precieze kwantificering van fagocytose. Hier, we vatten een gedetailleerde methodologie voor zowel in vitro en in vivo fagocytose met fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-glazen kralen en P. aeruginosa groen fluorescente proteïne (GFP), respectievelijk. Verder, verklaren wij de methode van differentiëren tussen PRR-, CR- en FcγR-gemedieerde fagocytose. Tot slot melden wij een methode te karakteriseren van bacteriële mijnen in muis met betrekking tot P. aeruginosa longontsteking.

<table><tbody><tr><td>18-G Naald</td><td>Nipro Medical</td><td>CI+1832-2C</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>2,7-diaminofluoreen (DAF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D17106</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>18C27B</td><td>Analytische kwaliteit</td></tr><tr><td>96-wells plaat</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>ACK lyseringsbuffer</td><td>Life Technologies</td><td>A10492</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Z23373</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>C5-deficiënt serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1163</td><td>Biochemisch reagens</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C0160-R</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A78300101 Issue 11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Celkweekmedium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo Software</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Dumont</td><td>0508-SS/45-PS-1</td><td>Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>FITC-gecarboxyleerde latexbeadles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4530</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>GFP-P. aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>101045GFP</td><td>Geschikt voor celinfectie assays</td></tr><tr><td>Glazen bodemschaal</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Hogedrukspuit</td><td>Penn-Century</td><td>FMJ-250</td><td>Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Omni International</td><td>TH-01</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Analytische kwaliteit</td></tr><tr><td>Omgekeerde fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>CA-2904</td><td>Farmaceutische kwaliteit</td></tr><tr><td>Shandon Kwik-Diff Kleurstof</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>9990700</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>MicroSprayer Aerosolizer</td><td>Penn-Century</td><td>IA-1C</td><td>Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Reagenskwaliteit</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>Celbiologie kwaliteit</td></tr><tr><td>konijn anti-SRBC-IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>Geschikt voor immuno-assays</td></tr><tr><td>konijn anti-SRBC-IgM</td><td>Cedarline Laboratories</td><td>CL9000-M</td><td>Geschikt voor immuno-assays</td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Miltex</td><td>5-2</td><td>Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>Kleine dieren laryngoscoop</td><td>Penn-Century</td><td>LS-2</td><td>Geschikt voor gebruik bij laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>Natrium Dodecyl Sulfaat (SDS)</td><td>BioRad</td><td>1610301</td><td>Analytische kwaliteit</td></tr><tr><td>Vedermes (Med)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>Vedermes (klein)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td>Geschikt voor dissectie van laboratoriumdieren</td></tr><tr><td>schapen rode bloedcellen (SRBCs)</td><td>MP Biomedicals</td><td>55876</td><td>Gewassen, geconserveerde SRBCs</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td>Moleculair biologie kwaliteit</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-110-20</td><td>Farmaceutische kwaliteit</td></tr></tbody></table>

alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice

Alveolaire macrofagen (AMs) bewaken de alveolaire ruimte van de longen. Fagocytose door AMs speelt een cruciale rol in de verdediging tegen invasie ziekteverwekkers, het verwijderen van dode cellen of lichaamsvreemde deeltjes, en in de resolutie van de inflammatoire reacties en weefsel remodeling, verwerkt die worden bemiddeld door verschillende oppervlakte receptoren van de AMs. Hier, rapporteren we methoden voor de analyse van de fagocytische functie van AMs met behulp van in vitro en in vivo tests en experimentele strategieën om te differentiëren tussen de patroon erkenning receptor - aanvulling receptor- en Fc gamma receptor-gemedieerde fagocytose. Tot slot bespreken we een methode om te stellen en een model van de longontsteking P. aeruginosa bij muizen te beoordelen van bacteriële goedkeuring in vivo karakteriseren. Deze testen vormen de meest voorkomende methoden te evalueren AM functies en kunnen ook worden gebruikt om te studeren macrofaag functie en bacteriële mijnen in andere organen.

We voor het eerst uitgevoerd het experiment te analyseren van fagocytose door muis primaire AMs. In alle analyses vergeleken we AMs geïsoleerd van WT en TRIM72KO muizen. Zoals blijkt uit Figuur 1A, onthuld fluorescentie microscopie dat fagocytose van FITC-glasparels door muis primaire AMs treedt op na 1 uur incubatie. Figuur 1 B toont de analyse van fagocytose door stroom cytometry. De...

Wij rapporteren hier gemeenschappelijke methoden voor het analyseren van de fagocytische functie van lymfkliertest alveolaire macrofagen en bacteriële klaring van de Long. Deze methoden bestuderen in vitro fagocytose van fluoresceïne isothiocyanaat kralen en in vivo fagocytose van Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Ook beschrijven we een methode voor het ontruimen van P. aeruginosa bij muizen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Alveolar macrophages (AMs) guard the alveolar space of the lung. Phagocytosis by AMs plays a critical role in the defense against invading pathogens, the ...

Pseudomonas aeruginosa is een BSL-2 niveau pathogene. Vergeet niet om alle BSL-2 niveau veiligheidspraktijken te volgen bij het hanteren van dit organisme. Hier zullen we primaire celisolatie, in vitro fagocytose en fagocytische trajectanalyse en in vivo fagocytose en bacteriële klaringsbeoordeling bij muizen demonstreren.Succesvolle intratracheale levering vereist de praktijk onder de knie te krijgen. Zorg ervoor dat de microsprayer goed is geladen, de naald zich tussen de twee vocale plooien bevindt en dat de zuigersnelheid goed wordt geregeld. Begin met het vastzetten van de muis in de supine positie met de ledematen verspreid op een dissectie bord bedekt met papieren handdoeken en het aansluiten van een string onder de voortanden om het hoofd in te trekken, zodat de luchtpijp is recht en vlak geplaatst.Desinfecteer de muis met 70% ethanol en gebruik regelmatig tangen om de huid op de middellijn van het lichaam op te trekken. Gebruik chirurgische schaar om de huid te snijden van de buik naar de top van de keel. Gebruik het stompe uiteinde van de standaard chirurgische schaar om zorgvuldig ontleden de keelspier en bindweefsel.Open de buikwand onder de ribbenkast. Snijd het midden

alveolar-macrophage-phagocytosis-and-bacteria-clearance-in-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hierin beschrijven we protocollen voor het oogsten van muizen-alveolaire macrofagen, die aangeboren immuunsysteem cellen woonachtig zijn in de longen, en de behandeling van hun activering in reactie op de co-cultuur met polyanhydride nanodeeltjes.

Oogsten Murine alveolaire macrofagen en evalueren van cellulaire activatie geïnduceerd door polyanhydride Nanodeeltjes

Macrofagen spelen een centrale rol in homeostase en pathologie in vele weefsels. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft methoden voor uitputting van...

Uitputting en reconstitutie van macrofagen in Muizen

Source: Nagre, N., et al. Alveolar Macrophage Phagocytosis and Bacteria Clearance in Mice. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the assessment of complement receptor-mediated phagocytosis using sheep red blood cells opsonized with IgM and complement, followed by their uptake by mouse macrophages. The extent of phagocytosis is quantified by measuring a blue chromogenic product formed through hemoglobin-catalyzed oxidation of diaminofluorene.

Modeling Complement-Mediated Phagocytosis Using Opsonized Red Blood Cells In Vitro

Take an adherent culture of murine macrophages.Treat the test well with a buffer containing Wnt5A, a signaling molecule, and the control with buffer only.Infect with a bacterial pathogen and incubate.In the test cells, Wnt5A activates a signaling cascade that enhances cytoskeletal reorganization to boost bacterial uptake into phagosomes, whereas control cells lacking this signaling internalize fewer bacteria.Wash to remove non-internalized bacteria, then incubate with a medium containing...

Wnt5A-Mediated Enhancement of Bacterial Clearance in Murine Macrophages

Een werkwijze om het vermogen van geïsoleerde muis alveolaire macrofagen om de groei van Aspergillus gefagociteerde sporen bedienen door confocale microscopie evalueren.

Evaluatie anti-schimmel activiteit van geïsoleerde alveolaire macrofagen door confocale microscopie

Terwijl in vitro studie van gastheer-pathogeen interacties de karakterisering van specifieke immuunresponsen mogelijk maakt, zijn in vivo modellen vereist om de effecten van complexe responsen te observeren. Door gebruik van Candida albicans blootstelling gevolgd door Pseudomonas aeruginosa-gemedieerde longinfectie, hebben we een muismodel gevestigd van microbiële interacties betrokken bij de pathogeniteit van ventilateur-geassocieerde pneumonie.

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Hier beschrijven we het model en de aanpak om functies van pulmonaire alveolaire macrofagen in kankermetastase te bestuderen. Om de rol van deze cellen in metastase te demonstreren, werd het syngene (4T1) model van borstkanker gebruikt in combinatie met de depletie van alveolaire macrofagen met clodronat liposomen.

Het bestuderen van de rol van alveolaire macrofagen in de uitzaaiing van borstkanker

Verscheidene werkwijzen zijn beschreven in de literatuur voor het modelleren van bacteriële pneumonie bij muizen. Hierin beschrijven we een niet-invasieve, goedkope, snelle werkwijze voor het induceren via aspiratie pneumonie (bijvoorbeeld inhalatie) van een bacterieel inoculum gepipetteerd in de orofarynx. Downstream methoden voor de beoordeling van de pulmonaire aangeboren immuunrespons zijn ook gedetailleerd.

Een niet-invasieve en Technisch Niet-intensieve methode voor Inductie en fenotypering van experimentele bacteriële longontsteking in Muizen

Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bepalen of blootstelling aan ozon, een criterium luchtverontreinigende stof, in vivo alveolaire macrofaag-efferocytose belemmert. Dit protocol maakt gebruik van veelgebruikte reagentia en technieken en kan worden aangepast aan meerdere modellen van long letsel om de effecten op alveolaire macrofaag efferocytose te bepalen.

In vivo beoordeling van alveolaire macrofaag Efferocytose na blootstelling aan ozon

Dit protocol beschrijft de isolatie van pulmonale interstitiële macrofagen (IM's) en hun adoptieve overdracht na IL-33 stimulatie van de longblaasjes in een muismodel, wat de in vivo studie van idiopathische longfibrose (IPF) kan vergemakkelijken.

Adoptieve overdracht van IL-33-gestimuleerde macrofagen naar bleomycine-geïnduceerde muismodellen om hun effect op idiopathische longfibrose in vivo te bestuderen

Leer fagocytose-analyse van alveolaire macrofagen in muizen met in vitro en in vivo technieken voor Pseudomonas aeruginosa. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van bacteriële klaring in longen.

Alveolaire macrofaag fagocytose en bacteriën mijnen in muizen

Meer video's verkennen