Name: Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Ontdek hoe Anti-c-fms antilichaam osteoclastvorming beïnvloedt bij muizen. Dit protocol toont botmergextractie en twee methoden voor osteoclastogenese met RANKL of TNF-alpha.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door een JSPS KAKENHI verlenen uit hoofde van de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (nr. 16K 11776 aan H. K., No. 17K 17306 aan K. S., No. 16K 20637 aan K. K., No. 16K 20636 naar M. S., No. 18K 09862 tot I. M.).

Alle dierlijke procedures en verzorging van de dieren werden uitgevoerd volgens Universiteit Tohoku regels en voorschriften.
1. lymfkliertest stuk dissectie en behandeling
<ol><li>Voordat de dissectie, vul een plaat met ongeveer 50 mL α-MEM afhankelijk van de grootte van de container en plaats deze op het ijs. Dit zal dienen als een collectie container totdat de dissectie van alle beenderen voltooid is. Voor deze en latere experimenten, α-MEM met 10% foetale runderserum (FBS), 100 IU/mL penicilline G en 100 μg/mL streptomycine gebruiken.</li>
	<li>C57Bl/6J muis bij inademing met een overdosis van 5% Isofluraan euthanaseren.</li>
	<li>Corrigeer de muis in een liggende positie met behulp van pennen doorboord door de palmen en de voeten en de spray grondig met 70% ethanol.</li>
	<li>Een insnijding van de huid met behulp van steriele chirurgische schaar en pincet op het niveau van de heup te maken en uit te breiden tot de voeten bloot van de spieren.</li>
	<li>Snij de pees van de quadriceps spier koppelen en de pees verbonden zijn de hamstring spier aan het bot. Schil weg de spieren bloot zowel heup-en knie. Lokaliseren van deze pezen zal verlichten vrijmaken van beide spieren van hun bijlagen zonder weke tags. Niet gesneden in het bot.</li>
	<li>Plaats de schaar tussen de kop van het dijbeen en de gewrichtsruimte en snijd in het vrijmaken van het dijbeen, maar het bot intact te houden. Hierdoor zal het detachement van de botten zonder het risico van blootstelling van het beenmerg.</li>
	<li>Ook knippen weg de spieren die verbonden zijn aan het scheenbeen. Gesneden het scheenbeen vrij van zijn gehechtheid aan het enkelgewricht houden van het bot intact om verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Schraap eventuele resterende weke delen van het bovenbeen en onderbeen met behulp van de schaar messen en kimwipe en plaats deze in een bord met α-MEM geplaatst op ijs.</li>
</ol>2. lymfkliertest stuk beenmerg isolatie
<ol><li>Vul een 30 G naald-spuit met α-MEM.</li>
	<li>Het verbreken van het scheenbeen en het dijbeen uit de buurt van het kniegewricht.</li>
	<li>Snij de uiteinden van de lange beenderen van beide zijden met behulp van schaar.</li>
	<li>Houd het bot van de schacht met pincet, plaats de naald in de ruimte van het merg van het bot en langzaam het spoelen van de inhoud van het beenmerg in een 6 cm cultuur schotel. Het bot zal verschijnen witte, met vermelding van de winning van alle inhoud van het beenmerg. Herhaal voor alle botten.</li>
	<li>Stam het beenmerg uitpakken met behulp van een 40 μm nylon cel zeef in een tube van 50 mL conische centrifuge en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder het supernatant, wassen met 5 mL van α-MEM en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. Repeat wassen voor een totaal van 2 keer.</li>
	<li>
Resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM en het uitvoeren van een telling van de cel met behulp van een hemocytometer als volgt:
	<ol>
<li>Een verdunning van 1:1 van de celsuspensie maken door toevoeging van 10 μL van celsuspensie aan 10 μL van 0,4% trypan blauw in een tube van 1,5 mL en Pipetteer eens.</li>
		<li>Bedek de hemocytometer kamer met een dia cover en breng de kleurstof de hemocytometer. Het is belangrijk niet te overvulling of underfill van de kamer en de schorsing te vullen van de kamer door capillaire werking.</li>
		<li>Plaats de hemocytometer in het werkgebied van een microscoop. Met 10 x doelstelling, focussen op het center-plein. Graaf alle cellen 3 regels gebonden. Om ervoor te zorgen dat cellen niet twee keer worden geteld, tellen de bovenste en juiste hoeken van elk vierkant. Dode cellen verschijnt donkerblauw, deze zijn uitgesloten van de graaf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Afhankelijk van de stroomafwaartse toepassing, zaad de cellen in een vaartuig van de juiste cultuur. Volg voor deze bijzonder experiment, sectie 3.</li>
</ol>3. productie van BMM
<ol><li>Zaad 1 x 107 cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen.</li>
	<li>Na 3 dagen, het verwijderen van het kweekmedium, wassen van de cellen krachtig met 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tweemaal naar niet-aanhanger cellen verwijderen, voeg 5 mL van de kamertemperatuur 0,02% trypsine-EDTA in PBS en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 5 min.</li>
	<li>Loskoppelen van de cellen door grondige pipetteren. Zorg ervoor dat de cellen hebben zijn losgemaakt door het observeren van de cultuur onder een microscoop (de cellen moeten verschijnen afgeronde en zwevend in de media). Als de cellen aangesloten blijven, herhaal pipetteren grondig als u wilt loskoppelen van hen. Wanneer de cellen hebben zijn vrijstaand, voeg 5 mL van α-MEM naar de inactivering van de reactie.</li>
	<li>De cellen in een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant verzamelen en wassen met 5 mL van α-MEM.</li>
	<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 10 mL α-MEM.</li>
	<li>Het uitvoeren van een aantal van de cellen zoals hiervoor is beschreven in stap 2.7.1.</li>
	<li>Zaad 1 x 106 cellen/10 mL in een 10 cm schotel cultuur en voeg M-CSF 100 ng/mL. De uiteindelijke concentratie van M-CSF is 100 ng/mL gestolde voedingsbodem. Incubeer de cultuur bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen.</li>
</ol>4. generatie van osteoclasten van BMM als Osteoclast precursoren
<ol><li>Na 3 dagen, de gekoppelde cellen die BMM als osteoclast precursoren vertegenwoordigen, stappen 3.2-3.7 na de oogst.</li>
	<li>Zaad BMM op 5 x 104 cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. Toevoegen RANKL voor een eindconcentratie van 50 ng/mL of TNF-α voor een eindconcentratie van 100 ng/mL. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.</li>
	<li>Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) aan elk putje.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 4 dagen. Wijzigen van media om de andere dag voor 4 dagen.</li>
</ol>5. tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) vlek
<ol><li>Na 4 dagen incubatie, gecombineerd zachtjes het kweekmedium van elk putje. Was nou eenmaal met 200 μL van kamertemperatuur 1 x PBS.</li>
	<li>Voeg 200 μl van 10% formaline aan elk putje voor fixatie en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De formaline gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg toe 200 μL van 0,2% Triton X-100 in PBS aan elk goed voor permeabilization en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De Triton X-100 gecombineerd en elk goed 3 keer wassen met gedeïoniseerd water.</li>
	<li>Voeg 200 l TRAP vlek oplossing aan elk putje. Visualiseer de vlek onder de Microscoop. Het duurt van 10-30 min voor de vlek goed ontwikkelen.</li>
	<li>Gecombineerd de vlek en wassen elk goed met gedeïoniseerd water 3 keer, en droge lucht. Bewaren bij kamertemperatuur te gebruiken in verdere observatie.</li>
</ol>6. verspreiding Assay
<ol><li>Zaad BMM als osteoclast precursoren op 5 x 103 cellen/200 μL van α-MEM in een 96 goed bord. M-CSF voor een eindconcentratie van 100 ng/mL toevoegen aan elk putje.</li>
	<li>Toevoegen van anti-c-fms antilichaam (eindconcentraties van 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 3 dagen middellange ongewijzigd.</li>
	<li>Na 3 dagen, wassen de cellen met 1 x PBS. Voeg 100 μl van α-MEM toe aan elk putje.</li>
	<li>10 μL van cel tellen kit oplossing toevoegen en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 voor 2 h en bepalen van de extinctie van elk putje bij 450 nm met behulp van een microplate-lezer.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie onderzochten we het effect van anti-c-fms antilichaam RANKL-geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α-geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde osteoclast voorloper proliferatie. We vonden dat de effectieve hoeveelheid anti-c-fms antilichaam voor de remming van de osteoclastogenesis tussen RANKL geïnduceerde osteoclast vorming, TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming en M-CSF-geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren anders is.
RANKL bemiddelt osteoclastogenesi...

Osteoclasten zijn gespecialiseerde cellen, en ze onderscheiden van hematopoietische stamcellen door de fusie van meerdere osteoclast precursoren. Ze zijn essentieel voor het remodelleren van gezond bot en bijdragen aan de pathologische bot resorptie osteolytic ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis en Parodontitis1is gekoppeld.
Osteoclastogenesis en osteoclast functie worden gemedieerd door twee belangrijke factoren; macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-kappa-B ligand (RANKL). Zowel M-CSF en RANKL zijn belangrijk voor osteoclast differentiatie2. Een andere factor die heeft aangetoond voor het opwekken van osteoclast vorming van beenmerg macrofagen in vitro is Tumornecrosefactor alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α gemedieerde osteoclast vorming is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor osteolyse in destructieve bot ziekten zoals reumatoïde artritis6, parodontitis7en postmenopauzale osteoporose8.
C-fms is de receptor membraan van M-CB en bemiddelt haar optreden. De rol van c-fms is goed gedocumenteerd in de literatuur, zoals het werd aangetoond dat de administratie van een antilichaam tegen c-fms (anti-c-fms antilichaam) volledig osteoclastogenesis in een artritis model gearresteerd, alsook in TNF-α geïnduceerde bot erosies terwijl osteoclastogenesis verre van het ontstoken gewricht was nog steeds robuust9. Toediening van anti-c-fms antilichaam geremd osteoclast vorming en bot resorptie geïnduceerd door lipopolysaccharide (LPS) in muis calvariae10 zo goed zoals in LPS-geïnduceerde parodontitis model11. Bovendien, anti-c-fms antilichaam geremd mechanische stress-geïnduceerde wortel resorptie tijdens orthodontische tand verkeer12, evenals orthodontische tand verkeer en bot resorptie orthodontische tand verkeer13zijn gekoppeld.
M-CSF heeft gemeld dat de andere functies die essentieel voor de immuunrespons van de gastheer zijn. Het ontbreken van M-CB in op/op muizen met bacteriële longontsteking leiden tot de toename van bacteriële belasting en bacteriële verspreiding aan de lever met hepatische necrose14. M-CSF is daarom belangrijk voor immunologische reactie op het gebied van de bescherming tegen infectie.
Deze studie toont het effect van anti-c-fms antilichaam op M-CSF en RANKL of TNF-α geïnduceerde osteoclast vorming in vitro en M-CSF geïnduceerde proliferatie van osteoclast precursoren. Dit protocol toont het isolement van lymfkliertest beenmergcellen van lange beenderen en de stappen voor het genereren van beenmerg macrofagen (BMM), die worden beschouwd als osteoclast precursoren en voor het opwekken van de differentiatie van de BMM in multinuclear osteoclasten door twee methoden; RANKL of TNF-α. Het protocol vergelijkt ook de arrestatie van osteoclastogenesis in beide methoden met behulp van anti-c-fms antilichaam.
Het proces waarbij het beenmerg is geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor het genereren van osteoclast precursoren is betrouwbaar in het produceren van grote hoeveelheden van pure osteoclast culturen die kunnen worden gebruikt in meerdere downstream toepassingen zoals drug testen. Het gebruik van RANKL of TNF-α ertoe osteoclastogenesis in dit protocol onderscheidt osteoclastogenesis als een fysiologische proces (RANKL) van osteoclastogenesis als een pathologische proces (TNF-α), dat op zijn beurt twee alternatieve procedures biedt te begeleiden de beslissing waarvan één is superieur in termen van de reagentia om in downstream toepassingen worden gebruikt. Dit protocol biedt ook een methode waarmee we een geschikte concentratie van anti-c-fms-antilichaam dat veilig kan worden gebruikt voor latere studies deelnemen aan bot resorptie en osteolytic ziekten kunnen bepalen.

<table><tbody><tr><td>Anti-c-Fms antibody</td><td></td><td></td><td>AFS98, een rat monoclonal, antimurine, c-Fms-antilichaam (IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alpha;</td><td></td><td></td><td>Recombinant muur muis TNF-&alpha; bereid in ons laboratorium. TNF-&alpha; cDNA-fragment geklond door RT-PCR en gekloneerd in een pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) om een GST-fusie-eiwit te genereren. GST-TNF-&alpha; werd tot expressie gebracht in Escherichia coli BL21 cellen (Stratagene, La Jolla, CA). De cellen werden onder niet-denaturerende omstandigheden gelyseerd en GST-TNF-&alpha; werd gezuiverd over een glutathion-Sepharose kolom. GST werd afgesneden door PreScission Protease (Amersham Biosciences) volgens de richtlijnen van de fabrikant en verwijderd door een glutathion-Sepharose kolom.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Recombinant Muur muis sRANK Ligand, Bron: E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Recombinant menselijke M-CSF. 1/10 vol van CMG14&ndash;12 cellijn cultuur supernatant bij 5x106&nbsp;cellen in een 10 cm suspensiecultuur schaal.</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>met L-Glutamine en fenolrood</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Fetal Bovine Serum Franse Oorsprong</td></tr><tr><td>Cultuur schaal</td><td>Corning</td><td></td><td>100 mm x 20 mm stijl schaal</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta oppervlak</td></tr><tr><td>Celtelling kit-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cel zeef</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu;m Nylon</td></tr><tr><td>Centrifugebuis</td><td>Corning</td><td></td><td>50 mL CentriStar dop</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polyoxyethyleen (10) Octyfenylether</td></tr></tbody></table>

effect van anti-c-fms antilichaam op osteoclast vorming en verspreiding van osteoclast voorloper in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Het remodelleren van het bot is een complex proces en het gaat om perioden van afzetting en resorptie. Bot resorptie is een proces waarbij bot door osteoclasten in reactie op verschillende stimuli afgebroken wordt. Osteoclast precursoren differentiëren in multinuclear osteoclasten in reactie op macrophage kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL). Onder pathologische omstandigheden, het profiel van cytokine is anders en gaat om een mengsel van inflammatoire cytokines. Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) is één van de belangrijkste cytokines zoals het vlindertje gebieden betrokken bij inflammatoire osteolyse in grote hoeveelheden. Het doel van dit protocol is bedoeld als een methode waarmee lymfkliertest beenmerg is geïsoleerd voor het genereren van de osteoclasten door inductie met M-CSF en RANKL of TNF-α, die vervolgens zal worden geremd doordat doses anti-c-fms antilichaam, de receptor voor M-CB. Dit experiment wijst de therapeutische waarde van anti-c-fms antilichaam in ziekten van inflammatoire bot resorptie.

Het doel van dit protocol is te evalueren van het effect van anti-c-fms antilichaam op osteoclast vorming in aanwezigheid van RANKL of TNF-α en voor het bepalen van het effect van M-CSF op osteoclast precursoren proliferatie. In dit protocol, die wij hebben verstrekt een betrouwbaar proces watergasproces waarbij grote hoeveelheden pure osteoclast culturen zijn gegenereerd. Wij hebben ook een manier om te testen de geschikte concentratie anti-c-fms antilichaam voor remming van osteoclast v...

Dit protocol omvat dissectie van lymfkliertest lange botten en beenmerg isolatie, voor het genereren van beenmerg macrofagen en produceren van de osteoclasten met behulp van macrofaag kolonie stimulerende factor (M-CSF) en receptor activator van nuclear factor-Kappa-B ligand (RANKL) of Tumornecrosefactor alfa (TNF-α) en hun arrestatie door anti-c-fms antilichaam, M-CSF receptor.

Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Dit experiment benadrukt de therapeutische waarde van Anti-c-fms-antilichaam bij ziekten van ontstekingsbotverstoring, zoals reumatoïde artritis en parodontitis. Het proces waarbij beenmerg wordt geëxtraheerd en gebruikt om osteoclast precursoren te genereren, levert grote hoeveelheden pure osteoclasten op, die kunnen worden gebruikt in meerdere downstreamtoepassingen. Dit protocol biedt twee alternatieve methoden van osteoclastogenese, hetzij met behulp van RANKL ligand of TNF alpha.Daarnaast geeft deze methode inzicht in het effect van Anti-c-fms antilichaam op osteoclastogenese. Visuele demonstratie van deze procedure maakt de onderzoeker vertrouwd met het proces van dissectie en het verkrijgen van beenmergcellen in grote hoeveelheden. Om te beginnen vullen een plaat die zal dienen als een collectie container met ongeveer 50 milliliter van alfa MEM, afhankelijk van de grootte van de container, en plaats het op ijs.Gebruik pinnen te doorboren door de handpalmen en voeten van een geëuthanaseerde muis om het te repareren in supine positie, en spray grondig met 70%ethanol. Gebruik steriele chirurgische schaar en pincet om een huid incisie te maken op het niveau van de heup en uit te breiden tot aan de voeten, het blootstellen van de spieren. Zoek en snijd de pees bevestiging van de quadriceps spier.Pel de spier weg en snijd deze op het niveau van de heup. Zoek dan de pees die de hamstringspier aan het bot bevestigt. Schil de spieren bloot het bot, en de hamstring te bevrijden van de bevestiging, zorg ervoor dat niet te snijden in het bot.Plaats de schaar tussen het hoofd van het dijbeen en de gewrichtsruimte. Snijd in het bevrijden van het dijbeen, maar het houden van het bot intact, die het mogelijk maakt detachement van de botten zonder risico van het blootstellen van het beenmerg. Cutaway de spieren aan het scheenbeen op een soortgelijke manier.Snijd vervolgens het scheenbeen vrij van zijn bevestiging aan het enkelgewricht, terwijl het bot intact blijft om besmetting te voorkomen. Gebruik de schaarbladen en labdoekjes om het resterende zachte weefsel van het dijbeen en scheenbeen te schrapen en leg ze in de geprepareerde plaat met alfa-MEM op ijs. De dissectie moet zorgvuldig worden uitgevoerd om verontreiniging te minimaliseren.Dat is de reden waarom grondige weke delen verwijderen en bot lokalisatie zijn van cruciaal belang. Vul een naaldspuit van 30 meter met alfa-MEM. Koppel het scheenbeen en dijbeen los van het kniegewricht en snijd de uiteinden van het lange bot van beide kanten met een schaar.Gebruik een pincet om het bot uit de schacht te houden. Steek de naald in het merg ruimte aan het bot en langzaam spoelen de inhoud van het merg in een zes centimeter cultuur schotel en herhaal voor alle botten. Het bot wordt wit, wat wijst op de extractie van alle beenmerginhoud.Gebruik een 40 micrometer nylon cel zeef om het beenmerg extract stam in een 50 milliliter conische centrifuge buis. Centrifuge de buis op 300 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg.Om te wassen, voeg vijf milliliter van alfa MEM aan de pellet. Pipette de cellen om ze los te maken, centrifuge, en herhaal de was voor een totaal van twee keer. Na het tellen van deze geïsoleerde cellen, zoals beschreven in het manuscript, zaad 10 miljoen cellen per 10 milliliter, in een 10 centimeter cultuur schotel, en voeg M-CSF aan de cellen.Broed de cultuur op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide gedurende drie dagen. Verwijder het medium na drie dagen en was de cellen twee maal krachtig met 10 milliliter PBS om niet-loodhoudende cellen te verwijderen. Voeg vijf milliliter kamertemperatuur 0,02% trypsin-EDTA en PBS, en incubeer bij 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende vijf minuten.Grondig pipette de cellen om ze los te maken. Observeer de cultuur onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen zijn losgemaakt en lijken afgerond en zwevend in de media. Wanneer de cellen zijn losgemaakt, activeer de reactie door vijf milliliter van het alfa-MEM toe te voegen.Verzamel de cellen in een 50 milliliter conische buis en centrifuge op 300 keer G gedurende vijf minuten. Na het weggooien van de supernatant, wassen met vijf milliliter van alfa MEM, en centrifuge weer op 300 keer G gedurende vijf minuten. Stel de pellet opnieuw op in 10 milliliter alfa-MEM.Zaad 1 miljoen cellen per 10 milliliter in een 10 centimeter cultuur schotel, en voeg M-CSF. Broed de cultuur op 37 graden Celsius, 5% kooldioxide gedurende drie dagen. Oogst de bijgevoegde cellen, die BMMs vertegenwoordigen als osteoclast precursoren na drie dagen, zoals eerder gedaan tijdens de generatie van BMMs.Zaad de BMMs op 50.000 cellen per 200 micro liter alfa-MEM in een 96 putplaat per put. Voeg aan elke bron de gewenste stimuli toe. En voeg dan M-CSF toe voor een laatste concentratie van 100 nanogram per milliliter.Voeg anti-c-fms antilichaam aan elke put. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius, 5%kooldioxide gedurende vier dagen, terwijl het veranderen van media om de andere dag voor vier dagen. En ga dan verder met vlekken en testen, zoals beschreven in het manuscript.De osteoclast vorming in M-CSF en RANKL behandelde cultuur, met Anti-c-fms antilichaam, werd geëvalueerd. Met 101,000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam werd een significante daling van het aantal osteoclasten waargenomen in vergelijking met controle. Terwijl, met een op de 10 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam, was er geen significante daling.Vervolgens werd de osteoclastvorming in M-CSF en TNF alpha behandelde cultuur, met Anti-c-fms antilichaam, geëvalueerd. Met 10, 100, 1.000 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam werd een significante afname van het aantal osteoclasten waargenomen in vergelijking met controle, zonder significante afname bij één nanogram per milliliter. En de M-CSF cultuur met 1, 10, 100 nanogram per milliliter Anti-c-fms antilichaam, was er geen significante daling van het aantal osteoclast precursoren in vergelijking met controle.Echter, bij 1.000 nanogram per milliliter, was er een significante daling van het aantal osteoclast precursoren, wat aangeeft dat een concentratie zo hoog als 1,000 nanogram per milliliter nodig is om de proliferatie van osteoclast precursoren aanzienlijk te remmen. Zorg ervoor dat de banden vrij te maken, terwijl het bot intact, die de kans op besmetting zal minimaliseren.

effect-anti-c-fms-antibody-on-osteoclast-formation-proliferation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the effect of different anti-c-fms antibody concentrations on osteoclastogenesis, which is the process of osteoclast formation from osteoclast progenitors.

Effect of the Anti C-fms Antibody on Osteoclastogenesis in Mouse Bone Marrow Cells In Vitro

De differentiatie van precursorcellen in osteoclasten wordt gereguleerd door cytokinen en groeifactoren. Hier worden een nieuwe genoverdrachtstechniek voor differentiatie van osteoclasten in vivo en celkweekprotocollen voor het differentiëren van precursorcellen in osteoclasten in vitro beschreven als een methode om de effecten van cytokinen op osteoclastogenese te bestuderen.

A Novel In vivo Gene Transfer Techniek en In vitro Cel-gebaseerde testen voor de studie van botverlies bij musculoskeletale aandoeningen

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

Notch-signalering is een vorm van cellulaire communicatie die afhankelijk is van direct contact tussen cellen. Om Notch-signalering goed te induceren in vitro, moeten Notch-liganden aan cellen worden gepresenteerd in een geïmmobiliseerde toestand. Dit protocol beschrijft methoden voor in vitro stimulatie van Notch-signalering in voorlopers van muizenosteoclasten.

Stimulatie van Notch signalering in Mouse osteoclastvoorlopers

Dit manuscript wordt beschreven van een protocol bij isolaat en cultuur osteoclasten in vitro uit beenmerg van de muis, en te bestuderen van de rol van het zoogdier/mechanistische doelwit van rapamycin complexe 1 in osteoclast vorming.

Een RANKL gebaseerde Osteoclast cultuur Assay van muis beenmerg te onderzoeken van de rol van mTORC1 in Osteoclast vorming

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Hier presenteren we een eenvoudige en effectieve testprocedure voor resorptieputtests met behulp van met calciumfosfaat gecoate celkweekplaten.

Een eenvoudig pittestprotocol om osteoclastische resorptie in vitro te visualiseren en te kwantificeren

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Dit artikel beschrijft de procedure voor de vorming en visualisatie van een bacteriële biofilm gegroeid binnen een 8-well kamer...

In vitro biofilmvorming in een 8-well Kamer Dia

De onderhavige methode biedt een manier om functioneel effectieve cardiotropic auto-antilichamen te detecteren in het plasma van patiënten met gedilateerde cardiomyopathie, ongeacht de specifieke antigen, door analyse van het effect van geïsoleerde patiënt immunoglobuline op cellulaire verkorten en intracellulair calcium transiënten in geïsoleerde cardiomyocyten van de rat.

Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Ontdek hoe Anti-c-fms antilichaam osteoclastvorming beïnvloedt bij muizen. Dit protocol toont botmergextractie en twee methoden voor osteoclastogenese met RANKL of TNF-alpha.

Effect van Anti-c-fms antilichaam op Osteoclast vorming en verspreiding van Osteoclast voorloper In Vitro

Meer video's verkennen