Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Grotdieren bieden een overtuigend systeem voor het onderzoeken van diverse morfologische, ontwikkelings- en gedragskenmerken. Maar een van de beperkende factoren bij het opzetten van dit modelsysteem is een gebrek aan genetische hulpmiddelen die ons in staat zouden stellen om de genfunctie te manipuleren. Hier tonen we drie verschillende benaderingen om de genfunctie te manipuleren in de Mexicaanse grotvis, Astyanax mexicanus.

Deze instrumenten zullen het onderzoek mogelijk maken van de genen die ten grondslag liggen aan natuurlijke variaties tussen oppervlaktevissen en grotvissen en hoe ze zich verhouden tot fenotypes. Bethany Stahl, een getalenteerde postdoc in mijn laboratorium zal deze procedure aantonen. Voordat u met de procedure begint, vult u een petrischaaltje van 100 milliliter met warme 3%-agarose die is opgelost in het water van het vissysteem en plaats u voorzichtig een eispuitvormer in de agarose in een hoek van 45 graden, voordat u de mal langzaam in de agarose verlaagt om te voorkomen dat er lucht onder de mal wordt gevangen.

Wanneer de agarose is gestold, verwijder voorzichtig de mal dan bewaar de plaat op vier graden Celsius voor maximaal een week. Trek vervolgens naalden uit borosilicaat glas haarvaten en een elektrode naald trekker volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik op de dag van de injectie een glazen pipet om eencellige eieren in de injectieplaat over te brengen en tot vijf rijen van de injectieplaat te vullen met 30 tot 40 eieren per rij.

Houd de eieren gehydrateerd met een kleine hoeveelheid vissysteem water. Ontdooi Morpholino op ijs en bereid de injectieoplossing voor zodat 400 picogrammen Morpholino per ei worden geïnjecteerd met behulp van een lange Microloader pipetpunt of het toevoegen van een twee tot vier microliter bolus aan het einde. Wanneer alle naalden zijn geladen, gebruik tangen om de overtollige lengte van de injectie naald tips trimmen en monteer de eerste naald in een micromanipulator aangesloten op een picoliter microinjector.

Plaats vervolgens de injectieschotel onder een ontledende microscoop en gebruik de micromanipulator om elk ei met de naald binnen te dringen voordat u een nanoliter Morpholino-injectieoplossing rechtstreeks in de dooier injecteert. Voor CRISPR-injectie meng je 25 picogrammen van gidsRNA met 300 picogrammen van CRISPR-geassocieerd eiwit 9 messenger RNA en injecteer je twee nanoliters van de resulterende RNA-oplossing in elk embryo, zoals aangetoond. Voor Tol2 transposase en Tol2 geflankeerde plasmide injectie, combineren 25 nanogram per microliter van Tol2 messenger RNA met 25 nanogram per microliter van Tol2 plasmid construeren en fenol rood in RNase-vrij water.

Injecteer dan een nanoliter oplossing in elk embryo zoals net aangetoond. Om de door Morpholino geïnjecteerde dieren te screenen op vier dagen na injectie, afhankelijk van het gen van belang, visualiseren de vislarven onder een stereomicroscoop om het fenotype van de geïnjecteerde dieren of video-record te observeren om gedrag te meten. Om te screenen op CRISPR-indels, breng je CRISPR-geïnjecteerde embryo's over in PCR-buizen en haal je het DNA eruit volgens de standaard DNA-extractieprotocollen voor polymerasekettingreactie of PCR-analyse.

Om te beoordelen op mutagenesis, draaien vijf microliters van het PCR-product op een 3%agarose gel op 70 volt gedurende drie uur. Wild-type, niet-mutagenized DNA zal resulteren in een aparte band, terwijl mutant DNA zal resulteren in een smeary band. Grot Een mexicanus geïnjecteerd met een controle Morpholino vertoont aanzienlijk meer bewegingsactiviteit en verminderde slaap gedurende een periode van 24 uur, in vergelijking met oppervlaktevissen geïnjecteerd met een roerei Morpholino.

De injectie van de hypocretine orexin Morpholino heeft weinig effect op de slaap in oppervlaktevissen in vergelijking met controle-geïnjecteerde vissen. Hypocretine ofexine-knockdown via Morpholino-injectie heeft daarentegen een significant effect op de slaap in grotvissen, waardoor een direct verband wordt gelegd tussen hypocretine ofexinexpressie en slaapverlies. CRPSR-gemedieerde mutagenese van het albinismegen OCA2 in oppervlaktevissen resulteert in sommige individuen homozygoot voor het wilde OCA2-positieve allel, en wordt geassocieerd met het herbergen van pigmentatie, terwijl individuen die twee kopieën van het CRISPR-gemuteerde OCA2-negatieve allel hebben albino zijn, wat een direct verband legt tussen het gemuteerde OCA2-gen en albinisme in grotvissen.

Selecteer F0's positief voor de Tol2 verzonden transgene terug kruis naar het wilde type om stabiele F1 lijnen te genereren. Dit maakt levende calcium beeldvorming voor het blootleggen van verschillen in neuronale activiteit, bemiddelen gedragsveranderingen in de grot omgeving, het leggen van de basis voor de expressie van vele extra transgenes te karakteriseren en te manipuleren genfunctie in A mexicanus. De belangrijkste dingen om te onthouden zijn om de eieren goed te laden op de plaat, om de naald goed te trimmen, en om de microinjectie te optimaliseren.

Na een succesvolle genetische knockdown, transgene integratie, of CRISPR-gemedieerde genbewerking, kunnen deze vissen worden gebruikt voor ontwikkelings-, gedrags- en hersenactiviteitsanalyses.