Confocale beeldvorming van Double-Stranded RNA en patroon erkenning receptoren in negatief-Sense RNA-virusinfectie
26 januari 2019
Double-stranded RNA geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virus kan worden herkend door patroon erkenning receptoren voor het opwekken van een aangeboren immuunrespons. Voor negatieve-gevoel van RNA-virussen blijft de interactie tussen de low-level dsRNA en PRRs onduidelijk. We hebben een confocale microscopie methode ontwikkeld om visualiseren Arenavirussen dsRNA en PRR in afzonderlijke cellen.
Traditionele double-strand RNA detectie test is meestal niet gevoelig genoeg om dubbelstreng RNA gevormd in negatieve zin RNA virus infectie op te sporen. Daarom is de interactie tussen dubbelstrengs RNA en host patroon herkenning receptoren grotendeels ongrijpbaar gebleven voor deze virussen. Met behulp van dit protocol zijn we in staat om de interactie tussen virale nucleaire eiwitten, dubbelstreng RNA te visualiseren en te karakteriseren en een PRRs op een eencellig niveau te hosten voor het RNA-virus met een negatief gevoel. Dit is een multiplex test die het mogelijk maakt voor gelijktijdige kleuring van dubbelstrengs RNA en twee virale of gastheer eiwit doelen in individuele cellen. In tegenstelling tot de RNA-FISH test is deze techniek RNA sequentie onafhankelijk en meestal compatibel met antilichaamdetectie van eiwitdoelen. Begin 24 uur voor infectie door zaaien 200.000 menselijke long epitheel A549 cellen op Poly-D-Lysine gecoate glazen deksel slips in 12-well platen en groeien ze op 37
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de herkenning van dubbelstrengs RNA (dsRNA) dat wordt geproduceerd tijdens de replicatie van RNA-virussen door patroonherkenningsreceptoren (PRRs) om een aangeboren immuunrespons te induceren. De focus ligt op negatieve-sense RNA-virussen, waarbij de interactie tussen laagwaardig dsRNA en PRRs niet goed wordt begrepen. Er is een confocale microscopiemethode ontwikkeld om arenavirus dsRNA en PRRs in individuele cellen te visualiseren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Immunologie
- Virologie
Achtergrond
- Dubbelstrengs RNA is een bijproduct van RNA-virusreplicatie.
- Patroonherkenningsreceptoren spelen een cruciale rol in de aangeboren immuunrespons.
- De interactie tussen dsRNA en PRRs in negatieve-sense RNA-virussen wordt slecht begrepen.
- Het visualiseren van dsRNA en PRRs kan het begrip van virale immuunevasie verbeteren.
Doel van het onderzoek
- Om de interactie tussen dsRNA en PRRs in negatieve-sense RNA-virussen te verduidelijken.
- Om een methode te ontwikkelen voor het visualiseren van deze interacties in individuele cellen.
- Om bij te dragen aan het begrip van de aangeboren immuunrespons op RNA-virussen.
Gebruikte methoden
- Confocale microscopie voor visualisatie van dsRNA en PRRs.
- Cellulaire assays om de immuunrespons te beoordelen.
- Analyse van dsRNA-niveaus tijdens virale replicatie.
- Vergelijkende studies met verschillende RNA-virussen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van arenavirus dsRNA en PRRs in individuele cellen.
- Identificatie van specifieke interacties tussen dsRNA en PRRs.
- Inzichten in de immuunresponsmechanismen die door dsRNA worden geactiveerd.
- Verheldering van de rol van dsRNA in virale pathogenese.
Conclusies
- De ontwikkelde confocale microscopiemethode is effectief voor het bestuderen van dsRNA en PRR-interacties.
- Het begrijpen van deze interacties kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën tegen RNA-virussen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het bredere veld van virale immunologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Visualizing low-abundance double-stranded RNA (dsRNA) in negative-sense RNA virus infection addresses a critical gap in understanding innate immune activation and viral immune evasion. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery by enabling direct observation of pattern recognition receptor (PRR) engagement with viral replicative intermediates. The method enhances predictive confidence in early-stage target selection for arenavirus and related pathogens, informing portfolio prioritization in high-containment pathogen programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing dsRNA-PRR interactions at single-cell resolution in pathogenic virus models.
- Operational Value: Provides a sensitive, sequence-independent detection method compatible with multiplexed protein staining for pathway clarification.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of PRR targets by confirming ligand engagement in relevant infection contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, spatially resolved readouts of dsRNA and PRR colocalization for assay standardization.
- Screening Relevance: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline immune activation metrics.
- Platform Utility: Compatible with antibody-based detection, enabling reuse across viral targets and host proteins in imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery observations to preclinical validation by mapping dsRNA distribution and PRR recruitment in disease-relevant systems.
- Mechanistic Insight: Clarifies spatial and temporal dynamics of innate immune signaling, informing biomarker selection for pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on visual confirmation of target engagement in high-pathogenicity models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for immunomodulatory antivirals targeting PRR pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of PRR agonist/antagonist mechanisms by visualizing dsRNA as the endogenous ligand in infected cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs that enable comparison of compound effects on dsRNA-PRR interactions.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence readouts (dsRNA, viral protein, PRR) for high-content analysis of immune activation states.
- Translational Research: Connects in vitro observations to preclinical continuity by confirming PRR activation in primary or stem-cell-derived lung epithelial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple negative-sense RNA viruses and host targets beyond arenaviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in PRR-ligand interactions.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and scalability through standardized confocal protocols and sensitive dsRNA detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing direct visual evidence of pathway modulation, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on confirmed target engagement in pathogenic virus contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence staining, and biosafety-level-appropriate virology techniques.
- Dependent on access to high-sensitivity dsRNA antibodies (e.g., 9D5 clone) and compatible fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates standardization across laboratories for consistent dsRNA signal quantification and colocalization analysis.
- Must account for cell model variability (e.g., A549 vs. primary airway epithelium) in dsRNA production and PRR expression levels.
- Practical limitations include potential antibody cross-reactivity and the need for optimization in high-containment (BSL-3/BSL-4) settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
