Spore adsorptie als een Nonrecombinant Display systeem voor enzymen en antigenen

Levende bacteriële sporen met antigeen of enzymen zijn functioneel actieve nanodeeltjes die kunnen worden gebruikt als mucosale vaccins of biokatalysten. In principe kan elk eiwit efficiënt worden geadsorbeerd op sporen. Deze techniek is eenvoudig en vereist geen genetische manipulatie.

Daarom is er geen sprake van het vrijkomen van recombinante organismen in het milieu. Naast mucosale vaccinologie voor mens en dier kunnen sporen met enzymen worden ontwikkeld als herbruikbare biokatalyzers. Begin met het labelen van twee keer 10 tot de negende B.subtilis wild-type gezuiverde sporen met twee-vijf-of 10-microgram concentraties van model RFP in 200 microliter van bindende buffer aangevuld met 50-millimolar natriumcitraat gedurende een uur op 25 graden Celsius op een schommelende shaker.

Aan het einde van de incubatie, pellet de bindende mengsels door centrifugatie, en breng de supernatants in nieuwe conische buizen voor latere adsorptie-efficiëntie analyse. Was vervolgens de sporenpellets twee keer met 200 microliterbindbuffer per wasbeurt, waarbij de pellets na de tweede wasbeurt opnieuw worden toegewezen in 100 microliters met verse bindingsbuffer. Voeg voor oppervlakte-eiwitextractie 50 microliter van elke geadsorbeerde sporentractie toe aan 50 microliter 2x natriumdodium dodecylsulfaat-dithiothreitol om de oppervlaktesporeneiwitten op te lossen.

Na 45 minuten bij 65 graden Celsius, verzamel de mengsels door centrifugatie, en lopen 10 microliter van elk volume van geëxtraheerde eiwitten supernatant op een westelijke vlek, met behulp van een monoklonale anti-Zijn antilichaam herkennen van de Zijn tag aanwezig op de N-terminus van mRFP om de gelabelde oppervlakte-eiwitten te identificeren. Om de geadsorbeerde moleculen te lokaliseren en te kwantificeren door fluorescentiemicroscopie, voeg vijf microliters van de adsorbeerde sporensteun toe aan 95 microliter pbs en voeg vijf microliter van elke resulterende suspensie toe aan individuele microscoopdia's. Plaats een poly-L-lysine-behandelde coverslip op elke dia, en plaats een dia op een fluorescentie microscoop stadium.

Sla vervolgens voor elk veld de fasecontrast- en fluorescentiemicroscopiebeelden op. Open voor beeldanalyse de fluorescentiemicroscopieafbeeldingen in ImageJ en selecteer Afbeelding en tekst om te bevestigen dat alle afbeeldingen in een indeling van acht bits zijn. Selecteer in het menu Analyseren de optie Metingen instellen en bevestig dat Gebied, Geïntegreerde dichtheid en Gemiddelde grijswaarde zijn geselecteerd.

Gebruik een teken- of selectiegereedschap om een lijn rond de interessesporen te tekenen en selecteer Meten in het menu Analyseren. Er verschijnt een pop-upvak met een stapel waarden voor het geselecteerde spore. Nadat ten minste 50 sporen zijn geselecteerd, selecteert u verschillende regio's zonder sporen en herhaalt u de meting om een meting voor de achtergrondfluorescentie te verkrijgen.

Nadat u verschillende achtergrondmetingen hebt verkrijgt, kopieert u alle gegevens in het venster Resultaten in een spreadsheet en berekent u het gemiddelde van de geïntegreerde dichtheid in het gebied van de geselecteerde sporen en de achtergrondfluorescentiewaarden om de gecorrigeerde fluorescentie per cel te verkrijgen. Voor de evaluatie van de indirecte adsorptie-efficiëntie moet zes tweevoudige seriële verdunningen van gezuiverde mRFP uitvoeren bij een concentratie van 0,5 nanogram per microliter tot een eindvolume van 250 microliter per verdunning in bindende buffer en een passend experimenteel aantal tweevoudige seriële verdunningen van 100 microliter van elk gereserveerd supernatant monster dat de niet-gebonden mRFP-fractie van de adsorptiereactie bevat met 100 microliterbinden van bindende buffer per verdunning. Snijd vervolgens een nitrocellulosemembraan met een afknipper van 0,45 micrometer tot een grootte van negen bij 10 centimeter, om een vijf-monster-bij-zes-dots-van-verdunning gebied te dekken zonder zich uit te breiden tot voorbij de rand van de pakking van de stip vlek apparaat.

Plaats het pre-natte membraan in het dot blot-apparaat. Controleer de juiste grootte van het membraan en verwijder eventuele luchtbellen die vast zitten tussen het membraan en de pakking. Monteer het puntvlekapparaat zoals beschreven door de fabrikant en bedek het ongebruikte gedeelte van het apparaat om te voorkomen dat lucht door die putten beweegt.

Wanneer het apparaat klaar is, laadt de norm in de twee meest externe rijstroken en de monsters in de middelste rijstroken met 100 microliter van elke geschikte verdunning per put. Wanneer alle monsters zijn geladen, schakelt u de vacuümpomp twee minuten in, voordat u het vacuüm stopt en de monsters door het membraan door de zwaartekracht laten filteren. Na 10 minuten, was elk goed met 100 microliter PBS.

Voer de vacuümpomp nog vijf minuten uit. Wanneer de wasbuffer volledig uit het apparaat is afgevoerd, terwijl het vacuüm aan staat, maak je de schroeven los en open je het puntvlekapparaat voorzichtig. Verwerk het membraan vervolgens volgens de standaard western blot-protocollen.

Open ImageJ en omtrek elke stip voor densitometrische analyse van het filter om de geïntegreerde dichtheid te meten met behulp van de opdracht Analyseren, Meten zoals aangetoond. Als u een achtergrondcorrectie van de afbeelding wilt aanbrengen, tekent u een cirkel in een leeg gebied en meet u de geïntegreerde dichtheid zoals aangetoond. Correleer de geïntegreerde dichtheid van de standaardstippen met de hoeveelheid geladen eiwit om een kalibratielijn te verkrijgen en gebruik de kalibratiecurve om de concentratie van mRFP van elke monsterstip te extrapoleren.

De concentratie van het mRFP dat in de niet-gebonden breuken blijft, kan vervolgens worden berekend. De aanwezigheid van eiwitten van de verwachte grootte alleen in de rijstroken geladen met een extract van de geadsorbeerde sporen is indicatief voor een succesvolle adsorptiereactie. Directe evaluatie van de adsorptie-efficiëntie is afhankelijk van het heterologe eiwit dat is gebruikt en kan worden uitgevoerd door fluorescentiemicroscopie en cytofluorimetrie van de pelletfractie na de fractionering van de adsorptiereactie.

Kwantificering van de fluorescerende signalen aanwezig op sporen kan vervolgens worden uitgevoerd met behulp van ImageJ zoals aangetoond. Een indirecte analyse van de adsorptie-efficiëntie kan worden uitgevoerd door een dot blotting-analyse van de supernatant fractie die het niet-gebonden eiwit bevat, en de daaropvolgende densitometrische analyse van het niet-gebonden eiwit maakt de indirecte berekening mogelijk van de hoeveelheid eiwit die op de sporen wordt geadsorbeerd. Hoewel elk eiwit in principe kan worden geadsorbeerd voor gebruik als mucosale vaccins of biokatalysatoren, is de efficiëntie van de adsorptie in de praktijk afhankelijk van de eiwitplaatsen en chemische eigenschappen.