Name: Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: Leer xenoGVHD-inductie en -scoring in NSG-muizen voor immunologisch onderzoek met digitale PCR. Deze methode kwantificeert menselijke T-cellen en verbetert klinische toepasbaarheid van immunosuppressieve therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag het laboratorium van Lane Christenson erkennen voor het leveren van de digitale PCR-machine die wordt gebruikt in deze experimenten en voor de geleverde technische ondersteuning. Ook willen we Dr. Thomas Yankee bedanken voor zijn begeleiding en mentorschap. Deze studies werden ondersteund door de Tripp Family Foundation.

Alle muis experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming, en met goedkeuring van, de Universiteit van Kansas Medical Center institutionele dierenverzorging en gebruik Comité. Alle gezonde menselijke bloedmonsters werden verkregen onder geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de institutionele Review Board aan de Universiteit van Kansas Medical Center.
1. bestraling van NSG-muizen
<ol><li>Een dag voorafgaand aan PBMC injectie, bestralen 8 – 12 weken oude NSG muizen (beide geslacht kunnen worden gebruikt). Plaats in een steriele bioveiligheidskast muizen in een gesteriliseerde cirkel kooi of micro-isolator. Bestraleren van muizen in een CS137 -bron of een kleine dierlijke irradiator (BIJV. RS 2000) met een totale dosis van 150 cgy met langzame rotatie om zelfs bestraling te garanderen.</li>
	<li>Plaats muizen in schone kooien in een steriele bioveiligheidskast.</li>
</ol>2. bereiding van de humane PBMC voor injectie
<ol><li>Verzamelen genoeg gezonde menselijke bloed te isoleren 1,1 x 107 PBMC per muis. Verdun het gehepariniseerde bloed in een gelijk volume van 2% foetaal runderserum (FBS) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Let op: met dit protocol is de PMBC-opbrengst over het algemeen 0,5 – 1 x 107 per 10 ml volbloed. Elke muis krijgt 107 PBMC in 100 μL PBS. De extra 1 x 106 in 10 μL per muis zorgt ervoor dat elke muis de volledige dosering PBMC ontvangt, mochten er problemen zijn met het vullen van spuiten.</li>
	<li>Voeg 15 mL lymfocyten scheidings dichtheidsgradiënt medium (bv. Ficoll) toe aan een conische buis van 50 mL en breng vervolgens zorgvuldig tot 25 mL verdund bloed bovenop de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer de buis met dichtheidsgradiënt en verdund bloed bij 400 x g voor 40 min bij kamertemperatuur zonder rem.</li>
	<li>Oogst de PBMC-interface in 10 mL PBS in een conische buis van 50 mL. Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.</li>
	<li>Maak de pellet los door de buis te flikken en in 10 mL PBS te respenderen om de PBMC te wassen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 400 x g .</li>
	<li>Optionele Gooi de supernatant-en lyse rode bloedcellen (Rbc's) in de celpellet weg door een volume ammonium-chloride-kalium (ACK) lysisbuffer toe te voegen dat gelijk is aan het korrel volume. Breng de pellet voorzichtig opnieuw aan en zwenk de tube 30 – 60 s. vulbuis met serum vrije RPMI-media en centrifugeer de buis bij 400 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 mL PBS. Tel de cellen met behulp van trypan blauwe uitsluiting met een hemocytometer en een microscoop.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en respendeer cellen bij 1 x 108 cellen/ml in PBS.</li>
</ol>3. retro-orbitale injectie van menselijke PBMC in muizen21
<ol><li>Plaats een anesthesie kamer in een laminaire stroom kap om de steriliteit te behouden. Pre-Charge de anesthesie kamer met 5% Isofluraan en 1 L/min zuurstof debiet gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Reduceer Isofluraan tot 2% en zet muizen uit dezelfde kooi in de anesthesie kamer. Zodra muizen de rechts verliezen, anesthetiseren muizen voor 5 minuten in de kamer. Gedurende deze tijd, Pre-Fill spuit met 100 μL (1 x 107 cellen) van celsuspensie.</li>
	<li>Plaats de muis op een verwarmingspad met zijn neus in een neuskegel om anesthesie te behouden. Controleer op bewustzijnsverlies door een voetpad te knijpen en te controleren op gebrek aan reflex.</li>
	<li>Restrain muis met duim en middelvinger. Plaats de 28 G 1/2 in de naald met de schuine kant omlaag aan de mediale Canthus, door het conjunctivale membraan totdat de achterkant van het oog is bereikt. Breng de naald lichtjes aan en Injecteer 100 μL cellen langzaam (1 x 107 cellen).</li>
	<li>Trek de naald volledig in en gooi de spuit en naald goed weg. Sluit het ooglid en breng milde druk aan op de injectieplaats met een gaas spons.</li>
	<li>Onderzoek de injectieplaats voor zwelling of ander zichtbaar trauma. Laat de muis het bewustzijn herwinnen in een steriele kooi bekleed met papieren handdoeken om te voorkomen dat het strooisel naar de huis kooi gaat. Nadat een bloeding is gestopt, breng een enkele druppel ooganestheticum aan op het oog voor analgesie. Opmerking: staart ader injectie is een alternatieve methode voor intraveneuze injectie van PBMC voor dit protocol zoals beschreven door Macholz et al.22.</li>
</ol>4. klinische scoring van acute GVHD bij muizen (Figuur 1)23
<ol><li>Meet de GVHD Score om de andere dag totdat muizen een Score van een 2 en vervolgens elke dag tot de dag van het opofferen bereiken.<ol>
<li>Plaats de kooi in een laminaire stroom afzuigkap, verwijder het voedsel en het water en zet het deksel weer op. Scoor activiteit door het observeren van muizen voor 5 min en toe te wijzen scores als volgt: 0 = muis begint te lopen binnen een paar minuten en houdt wandelen rond kooi, 1 = muis duurt een paar minuten om op te staan en loopt langzaam rond kooi, 2 = muis niet opstaan in 5 min en alleen wandelingen wanneer aangeraakt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weeg elke muis in een glazen beker en geef een gewichtsverlies Score: 0 = < 10% verandering, 1 = 10 – 25% verandering en 2 = > 25% verandering.</li>
	<li>Terwijl de muis nog in het bekerglas zit, Inspecteer je op de houding: 0 = normaal, 1 = opjagende in rust, 2 = hunching schaadt beweging; bont textuur: 0 = normaal, 1 = milde tot matige ruffling, 2 = ernstige ruffling en huid integriteit : 0 = normaal, 1 = schalen van poten/staart, 2 = voor de hand liggende gebieden van een gedenudeerde huid (kijk naar oren, staart en poten voor het schalen).</li>
	<li>Met vijf categorieën en een Score van 0 – 2 voor elke categorie, kan een muis een maximale Score van 10 bereiken. Wanneer een muis een Score van 7 of hoger bereikt of 42 dagen na de injectie bereikt, euthanasie de muis via CO2 euthanasius of een andere methode goedgekeurd door de lokale instelling voor dierenverzorging en-gebruik. Opmerking: om de nauwkeurigheid van de resultaten te garanderen, wordt de scoring uitgevoerd door een onderzoeker die is geblindeerd tot de behandelgroepen24. Bovendien, hoewel > 20% van het verlies van het lichaamsgewicht is het aanbevolen humane eindpunt voor veel IACUC protocollen, met aanvullende rechtvaardiging IACUC goedkeuring van dit protocol kan worden verkregen.</li>
</ol>5. oogst weefsels voor genomisch DNA van geëeuthaniseerde muizen en isolerende genomisch DNA
<ol><li>Ontleden muizen met steriel chirurgisch gereedschap. Snijd een klein stukje weefsel over 3 mm x 0,5 mm in grootte van een orgaan van belang, bijvoorbeeld Long, lever, of milt. Weeg het weefselmonster af en plaats het weefsel stuk in een steriele 1,5 mL Tube. Als het verzamelen van meerdere weefsels, wassen gereedschappen met ethanol tussen het snijden van elk orgaan.</li>
	<li>Vries weefsels door de buisjes met het weefsel in vloeibare stikstof te subfuseren totdat het stopt met borrelen en bewaar in-80 °C 's nachts. Ontdooi de weefselmonsters en lyseer ze volgens een genomische DNA (gDNA) isolatie kit.</li>
	<li>Isoleer genomisch DNA volgens de instructies van de fabrikant zoals beschreven in de kit. Noteer de hoeveelheid weefsel die is verwerkt per microliter van de eluteerde gDNA (mg/μL). Let op: bevroren weefsels kunnen bij-80 °C worden bewaard voor verwerking op een later tijdstip.</li>
</ol>6. kwantificering van menselijke T-cellen met behulp van digitale PCR (Figuur 2)
<ol><li>Bereid digitale PCR-reacties volgens het protocol voor DNA-bindende kleurstoffen voor de gebruikte digitale PCR-machine. Gebruik de volgende primers specifiek voor humaan CD3 Epsilon genomisch DNA (NCBI-referentie sequentie: NG_ 007383.1); Voorwaartse primer: AGGCTGCCTTAACTCCCAAG, omgekeerde primer: GCCCTACCAGCTGTGGAAAC. Deze primers zullen een enkele band van 105 BP opleveren. Opmerking: Voeg 0,5 μL van een restrictie-enzym, zoals HindIII, toe aan elke reactie om het genomisch DNA te verteren. Zorg ervoor dat u verschillende gDNA verdunningen test om de scheiding van positieve en negatieve druppels te optimaliseren. Bovendien kan een subset van infiltrerende T-cellen niet-pathogene regulatoire T-cellen zijn. Deze cellen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van extra primers voor regulatoire T-celmarkeringen.</li>
	<li>Voer de digitale PCR-reactie uit onder de volgende omstandigheden: deksel bij 105 °C, 95 °C gedurende 10 min (1 cyclus); 95 °C voor 30 s, helling 2 °C/s en 55 °C gedurende 1 minuut, helling 2 °C/s (40 cycli); 72 °C gedurende 10 min, 12 °C vasthouden. Opmerking: afhankelijk van de digitale PCR-apparatuur moeten deze parameters mogelijk worden aangepast.</li>
	<li>Verkrijg digitale PCR-gegevens met analyse software. Rapporteer gegevens als aantal kopieën per mg weefsel met behulp van de volgende vergelijking: (hoeveelheid kopieën/μL) x (μL gDNA in reactie) x (verdunningsfactor)/(mg weefsel/μL totaal gDNA)</li>
</ol>

<ol><li>Jagasia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+acute+GVHD+and+survival+after+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Risk factors for acute GVHD and survival after hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 119 (1), 296-307 (2012).</li>
<li>Bolanos-Meade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+3+clinical+trial+of+steroids%2Fmycophenolate+mofetil+vs+steroids%2Fplacebo+as+therapy+for+acute+GVHD%3A+BMT+CTN+0802%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Phase 3 clinical trial of steroids/mycophenolate mofetil vs steroids/placebo as therapy for acute GVHD: BMT CTN 0802.</a> Blood. 124 (22), quiz 3335 3221-3227 (2014).</li>
<li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+mortality+after+allogeneic+hematopoietic-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reduced mortality after allogeneic hematopoietic-cell transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li>
<li>Hahn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+in+survival+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation+during+a+period+of+significantly+increased+use%2C+older+recipient+age%2C+and+use+of+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Significant improvement in survival after allogeneic hematopoietic cell transplantation during a period of significantly increased use, older recipient age, and use of unrelated donors.</a> Journal of Clinical Oncology. 31 (19), 2437-2449 (2013).</li>
<li>Khoury, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+acute+graft-versus-host+disease+diagnosis+in+the+modern+era%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Improved survival after acute graft-versus-host disease diagnosis in the modern era.</a> Haematologica. 102 (5), 958-966 (2017).</li>
<li>King, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+leucocyte+non-obese+diabetic-severe+combined+immunodeficiency+interleukin-2+receptor+gamma+chain+gene+mouse+model+of+xenogeneic+graft-versus-host-like+disease+and+the+role+of+host+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex.</a> Clinical & Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).</li>
<li>Lucas, P. J., Shearer, G. M., Neudorf, S., Gress, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+antimurine+xenogeneic+cytotoxic+response.+I.+Dependence+on+responder+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The human antimurine xenogeneic cytotoxic response. I. Dependence on responder antigen-presenting cells.</a> Journal of Immunology. 144 (12), 4548-4554 (1990).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+model+for+xenogenic+GVHD+using+severe+immunodeficient+NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive model for xenogenic GVHD using severe immunodeficient NOG mice.</a> Transplantation. 87 (11), 1654-1658 (2009).</li>
<li>Kawasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Analysis+of+the+Activation+and+Proliferation+Kinetics+and+Effector+Functions+of+Human+Lymphocytes%2C+and+Antigen+Presentation+Capacity+of+Antigen-Presenting+Cells+in+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Analysis of the Activation and Proliferation Kinetics and Effector Functions of Human Lymphocytes, and Antigen Presentation Capacity of Antigen-Presenting Cells in Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 24 (8), 1563-1574 (2018).</li>
<li>Ito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Xenogeneic+Graft-Versus-Host+Disease+Model+for+Investigating+the+Pathological+Role+of+Human+CD4%28%2B%29+or+CD8%5BTitle%5D)+AND+%22T+Cells+Using+Immunodeficient+NOG+Mice.+American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">A Novel Xenogeneic Graft-Versus-Host Disease Model for Investigating the Pathological Role of Human CD4(+) or CD8.</a> T Cells Using Immunodeficient NOG Mice. American Journal of Transplantation. 17 (5), 1216-1228 (2017).</li>
<li>Trotta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+anti-IL-2+antibody+that+potentiates+regulatory+T+cells+by+a+structure-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A human anti-IL-2 antibody that potentiates regulatory T cells by a structure-based mechanism.</a> Nature Medicine. 24 (7), 1005-1014 (2018).</li>
<li>Dijke, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+Human+Thymus+Is+a+Novel+Source+of+Stable+and+Long-Lived+Therapeutic+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Discarded Human Thymus Is a Novel Source of Stable and Long-Lived Therapeutic Regulatory T Cells.</a> American Journal of Transplantation. 16 (1), 58-71 (2016).</li>
<li>Huang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Gingiva-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Inhibit+Xeno-Graft-versus-Host+Disease+via+CD39-CD73-Adenosine+and+IDO+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Gingiva-Derived Mesenchymal Stem Cells Inhibit Xeno-Graft-versus-Host Disease via CD39-CD73-Adenosine and IDO Signals.</a> Frontiers in Immunology. 8, 68(2017).</li>
<li>Stockis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+immunosuppression+by+human+Tregs+in+vivo+with+antibodies+targeting+integrin+alphaVbeta8%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Blocking immunosuppression by human Tregs in vivo with antibodies targeting integrin alphaVbeta8.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), E10161-E10168 (2017).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236-9241 (1999).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Sykes, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Bacterial+Contamination+in+Goat+Milk+Powder+Using+PacBio+Single+Molecule+Real-Time+Sequencing+and+Droplet+Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Bacterial Contamination in Goat Milk Powder Using PacBio Single Molecule Real-Time Sequencing and Droplet Digital PCR.</a> Journal of Food Protection. , 1791-1799 (2018).</li>
<li>Vitale, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+to+evaluate+estrogen+receptor+gene+mutations+in+small+amounts+of+cell-free+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow to evaluate estrogen receptor gene mutations in small amounts of cell-free DNA.</a> Journal of Molecular Diagnostics. , (2018).</li>
<li>Gorgannezhad, L., Umer, M., Islam, M. N., Nguyen, N. T., Shiddiky, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+and+liquid+biopsy%3A+opportunities%2C+challenges%2C+and+recent+advances+in+detection+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA and liquid biopsy: opportunities, challenges, and recent advances in detection technologies.</a> Lab Chip. 18 (8), 1174-1196 (2018).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> LabAnimal. 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Cooke, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+I.+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88 (8), 3230-3239 (1996).</li>
<li>Weisdorf, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+grading+of+graft-versus-host+disease+after+unrelated+donor+marrow+transplantation%3A+a+grading+algorithm+versus+blinded+expert+panel+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Prospective grading of graft-versus-host disease after unrelated donor marrow transplantation: a grading algorithm versus blinded expert panel review.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 9 (8), 512-518 (2003).</li>
<li>Nervi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+human+T+cell+engraftment%2C+trafficking%2C+and+associated+xenogeneic+graft-vs-host+disease+in+NOD%2FSCID+beta2mnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Factors affecting human T cell engraftment, trafficking, and associated xenogeneic graft-vs-host disease in NOD/SCID beta2mnull mice.</a> Experimental Hematology. 35 (12), 1823-1838 (2007).</li>
<li>Leon-Rico, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+haematopoietic+stem+cell+engraftment+through+the+retro-orbital+venous+sinus+and+the+lateral+vein%3A+alternative+routes+for+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22LabAnimal%22%5BJournal%5D)">Comparison of haematopoietic stem cell engraftment through the retro-orbital venous sinus and the lateral vein: alternative routes for bone marrow transplantation in mice.</a> LabAnimal. 49 (2), 132-141 (2015).</li>
<li>Ali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenogeneic+graft-versus-host-disease+in+NOD-scid+IL-2Rgammanull+mice+display+a+T-effector+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rgammanull mice display a T-effector memory phenotype.</a> PLoS One. 7 (8), e44219(2012).</li>
<li>van Rijn, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+xenograft+model+for+graft-versus-host+disease+by+intravenous+transfer+of+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+RAG2-%2F-+gammac-%2F-+double-mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A new xenograft model for graft-versus-host disease by intravenous transfer of human peripheral blood mononuclear cells in RAG2-/- gammac-/- double-mutant mice.</a> Blood. 102 (7), 2522-2531 (2003).</li>
<li>Wunderlich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OKT3+prevents+xenogeneic+GVHD+and+allows+reliable+xenograft+initiation+from+unfractionated+human+hematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">OKT3 prevents xenogeneic GVHD and allows reliable xenograft initiation from unfractionated human hematopoietic tissues.</a> Blood. 123 (24), e134-e144 (2014).</li>
<li>Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+graft-versus-host+disease%3A+advances+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 318-333 (2011).</li>
<li>Zeiser, R., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+acute+and+chronic+graft-versus-host+disease%3A+how+predictive+are+they+for+a+successful+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of acute and chronic graft-versus-host disease: how predictive are they for a successful clinical translation?</a> Blood. 127 (25), 3117-3126 (2016).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten gedeclareerd.

Ziekteprogressie is over het algemeen consistent in het xenoGVHD-model, zelfs met een injectie van PBMC van verschillende donoren, zodat meerdere experimenten kunnen worden gecombineerd. De belangrijkste stappen die nodig zijn om deze consistentie te behouden, zijn goede i.v.-injectietechniek, blindering en consistente scoring. Een studie van Nervi et al.25 toonde aan dat in vergelijking met intraveneuze staart ader injectie, retro-orbitale injecties van PBMC resulteerden in een consistentere engr...

Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) is een routine behandeling geworden voor patiënten die lijden aan hematologische maligniteiten zoals leukemie met een slechte prognose. Een significante complicatie van HSCT is acute graft-versus-hostziekte (GVHD). In een 2012-studie werd gemeld dat acute GVHD werd ontwikkeld in 39% van de HSCT-patiënten die transplantaties kregen van broer of zus en 59% van de patiënten die transplantaties ontvingen van niet-verbonden donoren1. Acute GVHD treedt op wanneer de donor afkomstige T-cellen de organen van de geadresseerde aanvallen. De enige succesvolle therapie voor GVHD is behandeling met zeer immunosuppressieve geneesmiddelen2, die zeer giftig en verhogen het risico van infectie en tumor herhaling. Zo, ondanks verbeteringen die zijn aangebracht in acute gvhd overleving in de afgelopen jaren3,4,5, er is nog steeds een kritische behoefte aan verbeterde gvhd therapieën met minimale toxiciteit die op lange termijn remissie bevorderen.
Het algemene doel van de volgende methoden is om te induceren en te scoren xenogene GVHD (xenoGVHD). De xenoGVHD model werd ontwikkeld als een instrument voor het opwekken van acute GVHD met menselijke cellen in plaats van Murine cellen waardoor meer directe vertaling van pre-klinisch GVHD onderzoek naar klinische proeven6. Dit model omvat het intraveneus injecteren van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in NOD-SCID IL-2Rγnull (NSG) muizen die sublethaal bestraald zijn. Geïnjecteerde humane t-cellen worden geactiveerd door humane antigeen-presentatie cellen (apc's) die muriene antigeen vertonen en de geactiveerde T-cellen migreren naar verre weefsels resulterend in systemische ontstekingen en uiteindelijk overlijden6,7, 8 , 9 , 10. ziekte pathologie en progressie in het xenogvhd model nabootsen van menselijke acute gvhd. In het bijzonder zijn de pathogene menselijke T-cellen reactief naar Murine Major histocompatibility complex (MHC) eiwitten, die vergelijkbaar is met de T-cel alloreactivity in humaan gvhd6,9. Het belangrijkste voordeel van de xenoGVHD model over de muis MHC-mismatch model, de andere veel gebruikte GVHD model, is het mogelijk voor het testen van therapieën op menselijke cellen in plaats van Murine cellen. Dit maakt het testen van producten die direct kunnen worden vertaald naar de kliniek zonder enige wijzigingen, omdat ze zijn gemaakt om menselijke cellen te richten. Onlangs is dit model gebruikt om een humaan anti-Il-2 antilichaam11, humane Thymus regulatoire T-cellen (tregs)12 en humane mesenchymale stamcellen13 te testen als mogelijke behandelingen voor acute gvhd. In een bredere context kan dit model worden gebruikt als een in-vivo-onderdrukkings test voor elk medicijn of celtype dat menselijke T-celactiviteit kan onderdrukken. Stockis et al.14 gebruikte bijvoorbeeld het xenoGVHD-model om het effect te bestuderen van het blokkeren van integrine αvβ8 op Treg suppressieve activiteit in vivo. Het xenoGVHD-model kan dus inzicht geven in het mechanisme van elke therapie gericht op T-cellen in een in vivo-instelling.
Een aanvullende methode die in dit protocol wordt beschreven, is het detecteren van menselijke T-cellen in muis weefsels met behulp van digitale polymerase kettingreactie (dPCR). Het doel van deze methode is om een instrument aan te bieden om migratie en proliferatie van T-cellen in doelweefsels te kwantificeren, die de werkzaamheid van immunosuppressieve therapieën meten die in dit model worden getest. dPCR is een relatief nieuwe methode voor de kwantificering van nucleïnezuren15. In het kort wordt het PCR-reactiemengsel onderverdeeld in partities die kleine aantallen van de doel volgorde of helemaal geen doel bevatten. De doel volgorde wordt vervolgens versterkt en gedetecteerd met behulp van DNA-intercalciserende kleurstoffen of fluorescerende doelspecifieke sondes. dpcr kwantificeert het aantal kopieën van de doel volgorde op basis van de Fractie van positieve partities en de statistieken van Poisson15,16. Het opsporen van T-cellen met dPCR vereist veel minder weefsel dan andere alternatieve methoden, waaronder Flowcytometrie en histologie, en kan worden uitgevoerd op bevroren of vast weefsel. dPCR vereist geen standaard curve om de Kopieer nummers te bepalen, noch zijn technische replicaten vereist. Dit vermindert de hoeveelheid reagens en het template-DNA die nodig zijn voor dPCR in vergelijking met traditionele kwantitatieve PCR (qPCR)16. Het partitioneren van de PCR-reactie in subreacties in dPCR concentreert zich doeltreffend op doelen17. Zo is dPCR in de eerste plaats een hulpmiddel voor het opsporen van zeldzame doelen in een grote hoeveelheid niet-doelwit DNA. Bijvoorbeeld, dPCR wordt gebruikt voor het opsporen van bacteriële besmetting in melk18, identificeren zeldzame mutaties in de oestrogeen receptor Gene19, en detecteren CIRCULEREND tumor-DNA in het bloed van patiënten20. In dit protocol fungeert dPCR als een efficiënt hulpmiddel voor het opsporen en kwantificeren van menselijke T-cellen in weefsels van muizen met xenoGVHD.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL eppendorf tubes</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>VWR International</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>10mL BD Vacutainers - Green capped with Sodium Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>250 &micro;L Ranin pipette tips</td><td>Rainin</td><td>17001118</td><td>Gebruik geen andere pipetten of pipettips voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR International</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>96-Well ddPCR plate</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Optioneel</td></tr><tr><td>Alcohol Wipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Chamber</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-178</td><td>Verstrekt door dierenfaciliteit</td></tr><tr><td>Anesthesia Machine</td><td>Parkland Scientific</td><td>PM1002</td><td>Verstrekt door dierenfaciliteit</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartridges and Gaskets for QX100/QX200 Droplet Generator</td><td>Bio-Rad</td><td>1864007</td><td></td></tr><tr><td>DNAse and RNAse free Molecular Grade H2O</td><td>Life Technologies</td><td>1811318</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol, Pure,200 proof, for molecular biology</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>45001750</td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>329424</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936</td><td>Verstrekt door dierenfaciliteit</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Irradiator Pie Cage</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MPC 1</td><td>Ruimte voor maximaal 11 muizen</td></tr><tr><td>Nexcare Gentle Paper Tape (a.k.a. 3M Micropore Surgical Tape / 3/4")</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td>MidSci</td><td>A-1000</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td>MidSci</td><td>A-200</td><td></td></tr><tr><td>Pierceable Foil Heat Seal</td><td>Bio-Rad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>Pipetaid Gilson Macroman</td><td>Fisher Scientific</td><td>F110756</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>Gebruik geen andere pipetten of pipettips voor druppelgeneratie</td></tr><tr><td>Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>qPCR plates</td><td>VWR International</td><td>89218-292</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Droplet Digital PCR System</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td>Inclusief druppelgenerator, druppellezer, laptopcomputer, software, bijbehorende verbruiksartikelen, voor EvaGreen of sonde-gebaseerde digitale PCR-toepassingen</td></tr><tr><td>QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1864033</td><td></td></tr><tr><td>RNase and DNase-free plate seal</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565491</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Advanced 1640</td><td>Life Technologies</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Gauze Pads (2" x 2", 12-Ply)</td><td>Fisher Scientific</td><td>67522</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Phosphate Buffered Saline</td><td>Fisher Scientific</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile reservoir</td><td>VWR International</td><td>89094-662</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Kent Scientific</td><td>INS600393-4</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Forceps</td><td>Kent Scientific</td><td>INS650914-4</td><td></td></tr></tbody></table>

inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene murine model en kwantificering van menselijke t cellen in muizen weefsels met behulp van digitale pcr

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Acute graft-versus-host ziekte (GVHD) is een significante beperking voor patiënten die hematopoietische stamceltransplantatie ondergaan als therapie voor Hematologische tekortkomingen en maligniteiten. Acute GVHD treedt op wanneer donor cellen gastheer weefsels als een vreemd antigeen herkennen en een immuunrespons op de host monteren. Huidige behandelingen omvatten toxische immunosuppressieve geneesmiddelen die patiënten vatbaar voor infectie en herhaling. Zo, er is lopend onderzoek naar een acute GVHD therapie die effectief kan richten op donor T cellen en het verminderen van bijwerkingen. Veel van dit pre-klinische werk maakt gebruik van de xenogene GVHD (xenoGVHD) Murine model dat het mogelijk maakt voor het testen van immunosuppressieve therapieën op menselijke cellen in plaats van murene cellen in een in vivo systeem. Dit protocol schetst hoe xenoGVHD te induceren en hoe te blind en standaardiseren klinische scoring om consistente resultaten te garanderen. Daarnaast wordt in dit protocol beschreven hoe u digitale PCR gebruikt om menselijke T-cellen in muizen weefsels te detecteren, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geteste therapieën te kwantificeren. Het xenoGVHD-model biedt niet alleen een model om GVHD-therapieën te testen, maar elke therapie die menselijke T-cellen kan onderdrukken, die vervolgens kan worden toegepast op veel ontstekingsziekten.

Sublethally bestraalde 8-12-week oude NSG-muizen van beide geslachten die menselijke PBMC ontvingen begonnen met het weergeven van klinische symptomen van GVHD rond dag 10 na injectie in vergelijking met negatieve controle muizen die alleen PBS ontvingen (Figuur 1a). XenoGVHD muizen hadden een mediane overleving van 23,5 dagen (Figuur 1b). Met digitale PCR kunnen CD3 Epsilon positieve menselijke T-cellen worden gedetecteerd in de...

Hier presenteren we een protocol voor het opwekken en scoren van ziekten in een Xenogenic graft-versus-hostziekte (xenoGVHD) model. xenoGVHD biedt een in vivo model om immunosuppressie van menselijke T-cellen te bestuderen. Daarnaast beschrijven we hoe we menselijke T-cellen in weefsels met digitale PCR kunnen detecteren als een hulpmiddel om immunosuppressie te kwantificeren.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

Dit protocol beschrijft hoe xenograft-versus-host ziekte, of xenoGVHD induceren, en hoe klinische scores blind en standaardiseren om consistente resultaten te garanderen. Het xenoGVHD-model biedt een in vivo methode voor het testen van immunosuppressieve therapieën tegen menselijke in plaats van murine T-cellen, waardoor de vertaling van deze studies naar de kliniek wordt verbeterd. Het aantonen van de procedure zal Amara Seng zijn, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Een dag voor de injectie, plaats acht-tot 12-week-oude, niet-zwaarlijvige diabetische scid gamma, of NSG, muizen in een gesteriliseerde taart kooi, en bestralen de muizen in een cesium-137 bron met een totale dosis van 150 centigrays, met een langzame rotatie om een gelijkmatige bestraling te garanderen. Plaats de muizen vervolgens 's nachts in schone kooien in een steriele bioveiligheidskast. De volgende ochtend verzamel je voldoende gezond menselijk bloed om 1,1 keer 10 te isoleren van de zeven perifere bloedmononucleaire cellen, of PBMCs, per muis, en verdun het gehepariniseerde bloed in een gelijk volume van 2%foetaal runderserum, of FBS, in PBS.Voorzichtig overlay tot 25 milliliter van het verdunde bloed op 15 milliliter lymfocyten scheidingsdichtheid gradiënt medium in een 50-milliliter conische buis voor dichtheid gradiënt centrifugatie. Aan het einde van de scheiding, oogst de PBMC op de interface, en was de cellen in 10 milliliter PBS in een nieuwe 50-milliliter conische buis. Aspirate de supernatant, en flick de buis om de pellet los te maken.Resuspend de PBMCs in 10 milliliter verse PBS voor een andere centrifugatie, gevolgd door resuspension in vijf milliliter verse PBS voor het tellen. Verzamel vervolgens de cellen met een laatste centrifugatie en zet de pellet één keer 10 op tot de acht PBMCs per milliliter PBS-concentratie. Voor retro-orbitale levering van de geïsoleerde menselijke PBMC in het oog van de muis, laad een een-milliliter spuit uitgerust met een 28-gauge naald met 100 microliters van cellen.Bevestig een gebrek aan reactie op teen knijpen, en voorzichtig beperken de muis met de duim en middelvinger. Steek de naald schuine kant naar beneden, laterale in de mediale canthus, door het bindmembraan totdat de achterkant van het oog is bereikt. Trek de naald lichtjes in en injecteer langzaam het volledige volume cellen.Trek vervolgens de naald volledig in voor een goede verwijdering van de spuit en naald. Sluit het ooglid en breng milde druk uit op de injectieplaats met een gaasspons. Bestudeer vervolgens de injectieplaats op zwelling of ander zichtbaar trauma en laat de muis het bewustzijn herwinnen in een steriele kooi bekleed met papieren handdoeken en monitoring voordat het dier naar zijn thuiskooi wordt verplaatst.Om de GVHD-score te meten, plaats je de kooi in een laminaire stroomkap en verwijder je het voedsel en water uit de kooi. Om de activiteit te scoren, observeer je het gedrag van de muizen gedurende vijf minuten. Om een gewichtsverlies score te verkrijgen, weegt elke muis in een glazen bekerglas.Terwijl de muis is nog steeds in het bekerglas, inspecteer het dier op houding, bont textuur, en de integriteit van de huid. Na het oogsten van de weefsels van belang, snijd een ongeveer drie-bij-0,5-millimeter stuk weefsel uit het orgaan, en weeg het monster op een balans. Breng het gewogen weefsel over in een steriele buis van 1,5 milliliter en vries het monster in vloeibare stikstof voor opslag 's nachts bij min 80 graden Celsius.De volgende ochtend ontdooi je de monsters voor lysis, volgens de instructies van een genomische DNA isolatiekit. Voor menselijke T-cel kwantificering door digitale polymerase kettingreactie, of PCR, bereid digitale PCR reacties volgens het protocol voor DNA bindende kleurstoffen voor de digitale PCR machine wordt gebruikt en met behulp van de juiste primers voor menselijke CD3 epsilon genomic DNA. Voer vervolgens de digitale PCR-reactie uit onder de juiste reactieomstandigheden.Sublethally bestraald acht-tot 12-weekse NSG muizen van beide geslachten die menselijke PBMC ontvangen beginnen met het weergeven van klinische tekenen van GVHD rond dag 10 na injectie in vergelijking met negatieve controle muizen behandeld met PBS alleen. XenoGVHD muizen hebben een mediane overleving van 23,5 dagen. Met behulp van digitale PCR, CD3 epsilon-positieve menselijke T-cellen kunnen worden gedetecteerd in de long-en levermonsters van muizen die menselijke PBMCs ontvangen.Het is van cruciaal belang dat de score consequent wordt uitgevoerd en dat de onderzoeker die de muizen scoort, blind is voor hun behandeling. Na deze procedure kan serum worden verzameld van geëuthanaseerde muizen voor perifere cytokine-expressieanalyse, en immuuncellen kunnen worden verzameld uit de milt voor analyse via stroomcytometrie.

induction-scoring-graft-versus-host-disease-xenogeneic-murine-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

This video demonstrates the induction of intestinal graft-versus-host disease, GvHD, in a lethally-irradiated recipient mouse using allogeneic hematopoietic stem cells and GvHD-inducing splenic alloreactive T lymphocytes. This protocol helps establish a severe acute intestinal GvHD model to understand the mechanism of the disease and develop innovative therapeutic options.

Induction of Graft Versus Host Disease in Mouse Models via Allogeneic Bone Marrow and Splenic Cell Transplantation

This video demonstrates an assay to generate a humanized xenograft mouse model. An immunocompromised mouse is injected with cyclophosphamide to cause immune cell depletion. Patient-derived tumor cells mixed with human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in a hydrogel are subcutaneously injected into the mouse, forming a tumor with infiltrating T cells.

A Technique to Generate a Human PBMC-Engrafted Humanized Xenograft Mouse Model

Het bepalen van donorcel innesteling vormt een uitdaging in de muis beenmerg transplantatie modellen die goed gedefinieerde fenotypische merkers missen. We beschreven een methode om mannelijke donor cel innesteling te kwantificeren in vrouwelijke transplantatie ontvangende muizen. Deze methode kan worden gebruikt in alle muizenstammen voor de studie van HSC functies.

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Menselijke tumorxenotransplantaten in immunodeficiënte muizen zijn waardevolle instrumenten om kanker biologie studeren. Specifieke protocollen voor subcutane en intrahepatische xenograften uit menselijke hepatocellulair carcinoom cellen of tumorfragmenten genereren worden beschreven. Leverregeneratie geïnduceerd door gedeeltelijke hepatectomie in ontvangende muizen wordt gepresenteerd als een strategie om intrahepatische engraftment vergemakkelijken.

Generatie van subcutane en Intrahepatic Human Hepatocellular carcinoom Xenografts in immunodeficiënte muizen

Hier beschreven is een werkwijze voor het produceren van exogeen cytokine in patiënten afgeleide xenograftmuizen via wekelijkse intraperitoneale injectie van een cytokine-getransduceerde stromale cellijn. Deze methode verruimt het nut van PDX en biedt de mogelijkheid voor transiënte of langdurige exogene cytokine-afgifte in een groot aantal PDX-modellen.

Expressie van exogeen cytokine in patiënt afgeleide Xenografts via injectie met een cytokine-getransduceerde stromcellijn

Hier presenteren we een protocol waarin wordt beschreven van Allogene hematopoietische stamceltransplantatie en repetitieve mini-Endoscopische evaluaties van de distale dubbelpunt ter plaatse voor de aanwezigheid, de kenmerken en de ernst van Colon ontsteking binnen live kunt muizen intestinale graft - versus - host-ziekte lijden.

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

We beschrijven een humaan perifeer bloed mononucleaire cel (PBMC) — op basis van gehumaniseerd xenotransplantaatmodellen is muismodel voor translationeel immuno-oncologisch onderzoek. Dit protocol kan dienen als een algemene richtlijn voor het vaststellen en karakteriseren van vergelijkbare modellen voor I-O-therapie beoordeling.

Een humane perifere bloed mononucleaire cel (PBMC) Engrafted gehumaniseerd xenograft model voor translationele immuno-oncologie (I-O) onderzoek

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Hier presenteren we een tumortransplantatieprotocol voor de karakterisering van tumor-inherente en periferie-afgeleide tumor-geïnfiltreerde lymfocyten in een muistumormodel. Specifieke tracering van de instroom van van de ontvanger afgeleide immuuncellen met flowcytometrie onthult de dynamiek van de fenotypische en functionele veranderingen van deze cellen tijdens antitumorimmuunresponsen.

Tumortransplantatie voor het beoordelen van de dynamiek van tumorinfiltrerende CD8 + T-cellen bij muizen

Het huidige protocol beschrijft hoe de menselijke huid kan worden geënt op niet-obese diabetische (NOD) -scid interleukine-2 gammaketen receptor (NSG) muizen. Een gedetailleerde beschrijving van de voorbereiding van de menselijke huid voor transplantatie, de voorbereiding van muizen voor transplantatie, transplantatie van de menselijke huid van gespleten dikte en de herstelprocedure na de transplantatie zijn opgenomen in het rapport.

Xenograft huidmodel om menselijke immuunresponsen in vivo te manipuleren

Leer xenoGVHD-inductie en -scoring in NSG-muizen voor immunologisch onderzoek met digitale PCR. Deze methode kwantificeert menselijke T-cellen en verbetert klinische toepasbaarheid van immunosuppressieve therapieën.

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR (Video) | JoVE Journal

Inductie en scoren van transplantaat-versus-gastheer ziekte in een xenogene Murine model en kwantificering van menselijke T cellen in muizen weefsels met behulp van digitale PCR

Meer video's verkennen