Name: Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Leer hoe functionele nanobodies retrograde eiwittransport van het celoppervlak naar het Trans-Golgi-netwerk in HeLa-cellen analyseren. Deze methode biedt inzicht in membraanhomeostase en celbiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door Grant 31003A-162643 door de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Nicole Beuret en de Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) voor steun.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Nanobodies vertegenwoordigen een opkomende klasse van eiwitten binder steigers met vele voordelen ten opzichte van conventionele antilichamen: ze zijn kleine, stabiele, monomeer, kunnen worden geselecteerd voor hoge affiniteit en ontbreken bisulfide obligaties33,35, 44 , 45. ze worden gebruikt in een aantal toepassingen, zoals in cel cultuur systemen en organismen in Ontwikkelingsbiologie<sup c...

Retrograde verkeer van eiwitten en lipiden van het celoppervlak aan verschillende intracellulaire compartimenten is van cruciaal belang voor handhaving van de membraan homeostase tegenwicht secretie en recycleren van onderdelen van anterograde vervoer machineries1 , 2. na de internalisering via clathrin-afhankelijke of -onafhankelijke endocytose, eiwit en lipide-vracht vullen eerst vroeg Endosomen uit waar ze verdere zijn doorverwezen hetzij langs de endo-lysosomale systeem, gerecycleerd aan het plasma-membraan, of gericht aan de trans-Golgi network (TGN). Recycling van Endosomen en/of het celoppervlak naar de TGN maakt deel uit van de functionele cyclus van een aantal anterograde transmembraan lading receptoren, zoals de catie-afhankelijke en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptoren (CDMPR en CIMPR) leveren nieuw gesynthetiseerd lysosomale hydrolases uit de TGN te laat Endosomen en lysosomen3,4,5, sortilin en SorLA6,7, Wntless (WLS) vervoer van Wnt liganden aan het celoppervlak 8 , 9 , 10 , 11. andere eiwitten ontvangen terug naar de TGN zijn TGN46 en haar aanverwante isoforms12,13,14, SNAREs (oplosbare N- ethylmaleimide-gevoelige fusion factor bijlage receptoren) 15 , 16 , amyloïde precursor eiwit (APP)18,19, progressieve ankylose (ANK) eiwit20, 17, metalen vervoerders zoals ATP7A/B of DMT121,22, en transmembraan verwerking van enzymen waaronder carboxypeptidase D, furin of BACE123,24,25. Afgezien van deze endogene proteïnen kapen bacteriële en plant toxines (bv, Shiga en cholera-toxine, ricine en Abrine) retrograde vervoer machines om te bereiken van de ER voor retrotranslocation in het cytosol26,27, 28,29.
Om direct retrograde verkeer analyseren, hebben we eerder een nanobody gebaseerde toolkit om te etiketteren en volg lading eiwitten van het celoppervlak naar intracellulaire compartimenten30ontwikkeld. Nanobodies vertegenwoordigen een nieuwe familie van eiwit bindmiddelen afgeleid van homodimeric zware-keten-alleen antilichamen (hcAbs) die van nature in kameelachtigen en cartilaginous vissen31,-32 voorkomen. Zij vormen het veranderlijke domein voor zware-keten (VHH) van hcAbs en hebben veel voordelen boven conventionele antilichamen (bijvoorbeeld IgGs): ze zijn monomeer, kleine (~ 15 kDa), zeer goed oplosbaar, verstoken van disulfide bindingen, kan worden bacterially uitgedrukt, en geselecteerd voor hoge-affiniteit bindende33,34,35,,36. Om onze tool nanobody veelzijdig en breed toepasbare, we matiemaatschappij anti-GFP nanobodies aan oppervlak-label en track eiwitten gelabeld met GFP op hun extracellulaire/lumenal domein gebruikt. Door functionalization van nanobodies met mCherry, ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)37, of tyrosine sulfation (TS) sequenties, retrograde vervoer van bonafide transmembraan lading eiwitten kan worden geanalyseerd door een vaste en live cel imaging, door elektronenmicroscopie, of biochemically. Aangezien tyrosine sulfation gemedieerd door tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 en TPST2) een posttranslationele wijziging beperkt tot de trans-Golgi is/TGN, we kan rechtstreeks studie vervoer en kinetiek van proteïnen van belang uit het celoppervlak daartoe intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.
In dit artikel methoden beschrijven we het gemak van de productie van matiemaatschappij nanobodies (VHH-2xTS - APEX2, - mCherry en derivaten) geschikt voor een aantal toepassingen voor het analyseren van retrograde vervoer in zoogdiercellen30. We vooral gericht op het gebruik van TS site-gewijzigd nanobody voor analyse van het intracellulair verkeer van het celoppervlak tot het compartiment van de sulfation.

<table><tbody><tr><td>Anti-GFP-antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>Product wordt gedistribueerd door Sigma-Aldrich, maar gefabriceerd door Roche</td></tr><tr><td>Anti-His6-antilichaam</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actine-antilichaam</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-konijn HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>opgelost in 1x PBS/1%BSA</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>opgelost in steriel 500 mM NaH2PO4 of DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevulinzuur (dALA) hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>opgelost in steriel water</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>opgelost in steriel water</td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Product wordt gedistribueerd door Sigma-Aldrich, maar gefabriceerd door Roche</td></tr><tr><td>Brefeldine A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal kalfs serum (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Zwavel-35 als natriumsulfaat</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>Product bevat 5 mCi</td></tr><tr><td>Earle's evenwichtige zouten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminozuren (50x) oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM vitamine oplossing (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Product wordt gedistribueerd door Sigma-Aldrich, maar gefabriceerd door Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>opgelost in steriel water, stock is 1 M</td></tr><tr><td>Carbenicilline dinatriumzout</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>opgelost in steriel water, stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Kanamycinesulfaat</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>opgelost in steriel water, stock is 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Brilliant Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Rundserum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>His GraviTrap kolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>His buffer kit</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>Eenmalige PD10 ontziltingskolommen</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>35 mm schalen</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>6-well platen</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksels (No. 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>opgelost in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Gist extract</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>opgelost in steriel water, stock is 1 M</td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>opgelost in steriel water, stock is 1 M</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>opgelost in steriel water, stock is 5 M</td></tr></tbody></table>

analyse van endocytotische opname en retrograde transport naar het netwerk van de trans-golgi matiemaatschappij nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Vervoer van eiwitten en membranen van het celoppervlak naar het Golgi en daarbuiten is essentieel voor de homeostase, organel identiteit en fysiologie. Studeren retrograde eiwit verkeer, hebben we onlangs een veelzijdig nanobody gebaseerde toolkit voor het analyseren van vervoer van het celoppervlak naar het Golgi-complex, hetzij door vaste en levende cel imaging, door elektronenmicroscopie of biochemically ontwikkeld. We ontworpen matiemaatschappij anti-groen fluorescente proteïne (GFP) nanobodies — kleine monomeer, hoge-affiniteit eiwit bindmiddelen — dat kan worden toegepast op cellijnen uiting van membraaneiwitten van belang met een extracellulaire GFP-groep. Derivatized nanobodies gebonden aan het GFP-verslaggevers specifiek zijn geïnternaliseerd en piggyback op de reporters sorteren traject vervoerd. Nanobodies waren matiemaatschappij met fluorophores te volgen retrograde vervoer door fluorescentie microscopie en beeldbewerking, met ascorbaat peroxidase 2 (APEX2) om te onderzoeken de ultrastructurele lokalisatie van verslaggever-nanobody complexen door elektron live microscopie, en met tyrosine sulfation (TS) motieven om te beoordelen van de kinetiek van trans-Golgi network (TGN) aankomst. In deze methodologische artikel duidelijk naar voren komt de algemene procedure bacterially express en zuiveren matiemaatschappij nanobodies. We illustreren de krachtige gebruik van onze tool met behulp van de mCherry - en TS-gemodificeerde nanobodies endocytotische opname en TGN komst van lading eiwitten te analyseren.

Om te onderzoeken retrograde eiwit transport naar diverse intracellulaire bestemmingen, hebben we onlangs een anti-GFP nanobody gebaseerde instrument om te etiketteren en volg recombinante fusion eiwitten van de cel-oppervlakte30opgericht. Hier tonen we de bacteriële productie van dergelijke derivatized nanobodies en tonen hun toepassing te bestuderen endocytotische ICT door fluorescentie microscopie en immunoblotting, alsmede het gebruik ervan te onderzoeken TGN a...

Retrograde vervoer van eiwitten uit het celoppervlak naar het Golgi is essentieel voor het handhaven van de membraan homeostase. Hier beschrijven we een methode om biochemically cel oppervlak-te-Golgi vervoer van recombinante eiwitten matiemaatschappij nanobodies met HeLa cellen te analyseren.

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Deze methode maakt de productie en toepassing van bacteriële uitgedrukte, gefunctionaliseerde nanolichamen mogelijk om retrograde eiwittransport van het celoppervlak naar intercellulaire compartimenten te analyseren. In het bijzonder het Trans-Golgi netwerk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van sulfatie. Een zeer specifieke, gecompartimenteerde en gevoelige post-vertaling wijziging om reporter nano-body complexe aankomst in het DTN-compartiment te beoordelen. Deze methode in combinatie met andere afgeleide nanolichamen voor levenscelbeeldvorming en elektronenmicroscopie kan ook worden gebruikt om endocitische processen van ziektegerelateerde celoppervlaktereceptoren te bestuderen. Ons repertoire van gefunctionaliseerde nanolichamen is ontworpen om retrograde transport in gekweekte cellen te bestuderen. Deze hulpmiddelen kunnen echter ook worden toegepast in meercellige organismen. Om deze procedure te beginnen, kies een bacteriële kolonie met de vector van belang van de plaat en inent een fles met 20 milliliter LB medium aangevuld met antibiotica. Incubeer 's nachts op 37

analysis-endocytic-uptake-retrograde-transport-to-trans-golgi-network

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates a method to study the uptake and retrograde transport of functionalized nanobodies to understand their intracellular trafficking pathways. By introducing radiolabelled sulfate and utilizing isolation and detection techniques, this method enables the study of endocytic uptake and trans-Golgi network arrival of cargo proteins.

Monitoring the Arrival of GFP-Tagged Surface Proteins to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies

We beschrijven een methode om eiwit label op het oppervlak van levende neuronen met een specifiek polyklonaal antilichaam tegen extracellulaire epitopen. Eiwit door het antilichaam gebonden op het celoppervlak en vervolgens geïnternaliseerd via endocytose kunnen worden onderscheiden van eiwitten nog op of verhandeld bij het oppervlak tijdens de incubatie.

Differentiële Labeling van Cell-oppervlak en Internalized Eiwitten na Antibody Voeden van Levende gekweekte neuronen

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Receptor handel moduleert signalering en celgevoeligheid liganden en zelf, reagerend op celomstandigheden, zoals ligand-geïnduceerde signalering. Hier beschrijven we een krachtige en flexibele techniek voor het kwantitatief beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde receptor handel met immunolabeling en colocalizational analyse.

Tracking-Drug geïnduceerde veranderingen in Receptor Post-internalisatie mensenhandel door Colocalizational Analyse

Het onderzoek naar membraanhandel is cruciaal voor het begrijpen van neuronale functies. Hier introduceren we een methode voor het kwantificeren van vesikelmotiliteit in neuronen. Dit is een handige methode die kan worden aangepast aan de kwantificering van membraanhandel in het zenuwstelsel.

Kwantificering van Endosome en Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

Twee biotinylatie-gebaseerde methoden, ontworpen voor het bepalen van de expressie van de celoppervlak en de endocytische snelheid van eiwitten uitgedrukt in het plasmamembraan, worden in dit rapport weergegeven.

Bepaling van de expressie van de celoppervlakte en de endocytische snelheid van eiwitten in primaire astrocytekulturen met behulp van biotinylering

We beschrijven een optische assay voor synaptic Vesikel (SV) recycling in gekweekte neuronen. Dit protocol combineert met dubbele transfectie uitspreken een presynaptische marker en proteïne van belang stelt ons in staat te vinden presynaptische sites, hun synaptic vesikel recycling capaciteit bepalen van de rol van de proteïne van belang.

Een optische Assay voor Synaptic vesikel Recycling in gekweekte neuronen Overexpressing presynaptische eiwitten

Recycling endosomen maken deel uit van het endosomale buisvormige netwerk. Hier presenteren we een methode om de dynamiek van recycling-endosomen te kwantificeren met behulp van GFP-STX13 als organelmarker.

De op microscopie gebaseerde test om de recycling-endosomen te bestuderen en te analyseren met behulp van SNARE-handel

Endocytisch en retrograde transport van eiwitten van het plasmamembraan naar het trans-Golgi-netwerk is essentieel voor het handhaven van de membraanhomeostase en het reguleren van signalering. Hier beschrijven we een methode om endocytisch transport van transmembraan ladingeiwitten in beeld te brengen en te kwantificeren door middel van live-cel microscopie met behulp van afgeleide anti-GFP nanobodies in HeLa-cellen.

Beeldvorming van levende cellen van endocytisch transport met behulp van gefunctionaliseerde nanobodies in gekweekte cellen

Hier presenteren we protocollen voor wasmiddel-vrije homogenisering van gekweekte zoogdiercellen gebaseerd op stikstof cavitatie en latere scheiding van cytosolische en membraan-gebonden eiwitten door ultracentrifugatie. Deze methode is ideaal voor het toezicht op de partitionering van perifere membraaneiwitten tussen oplosbare en membraan breuken.

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Leer hoe functionele nanobodies retrograde eiwittransport van het celoppervlak naar het Trans-Golgi-netwerk in HeLa-cellen analyseren. Deze methode biedt inzicht in membraanhomeostase en celbiologische processen.

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Meer video's verkennen