Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode
21 juni 2019
Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.
De Mango-tagged gel imaging methodologie die hier is aangetoond is robuust en zal naar verwachting eenvoudig kunnen worden uitgebreid in termen van gevoeligheid en specificiteit. Dit zou de routinematige zuivering van biologisch belangrijke RNAs- en RNA-complexen verder vereenvoudigen door eenvoudig een Mango-tag toe te voegen aan het RNA van belang. RNAs worden betrokken bij meer en meer ziekten daarom deze post dating methode is een gemakkelijke en snelle manier om te kunnen volgen en visualiseren RNA.
Extra zorg zal nodig zijn bij de overdracht van de gel van de ene plaats naar de andere als de gels zijn kwetsbaar en gevoelig voor breken. Om een 30 milliliter denatureringsgel voor te bereiden, selecteert u eerst het polyacrylamidepercentage met het juiste Bromophenolblauw en xylene cyanolkleurstoffen in vergelijking met een RNA van belang om een hoge bandscheiding te verzekeren. Meng vervolgens oplossingen A, B en C volgens tabel één en voeg APS en timud toe.
Giet de geloplossing onmiddellijk in een geschikt gelgietapparaat. Steek de gewenste kegel en laat de gel ongeveer 30 minuten aan polymerase. Maak de geltank aan met 1 XTBE-oplossing en verwijder de kegel voorzichtig.
Til de gel voorzichtig op en monteer op het gelapparaat en bevestig met bindmiddelclips. Met behulp van een spuit, aspirate uit de putten onmiddellijk voorafgaand aan monster laden. Bereid 1x RNA monsters door 2x denatureren gel laden oplossing toe te voegen aan de RNA monsters van belang.
Gebruik een thermocycler om de monsters te verwarmen op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Laad vervolgens gekoelde monsters naar de bodem van elke put met behulp van gel laden tips. En goed de gel bij kamertemperatuur ervoor te zorgen dat de macht effectief laag is om niet te kraken de glasplaat van de gel apparaat.
Bereid 1X gel kleuring oplossing volgens het manuscript in een schone glazen container die breed genoeg is om comfortabel te passen in de gel. Voeg voldoende 1X gel kleuring oplossing aan de container, zodat de gel volledig is bedekt met de oplossing wanneer het wordt geplaatst op een orbitale rotator. Zodra de gel klaar is met lopen, verwijder de gel uit het apparaat, snijd de putten ervan af, en een hoek van de gel om de oriëntatie te helpen bepalen.
Breng de gel vervolgens voorzichtig over in de 1X gel kleuroplossing. Om de beeldvorming uit te voeren, voorzichtig decanteren van de kleuroplossing en spoel de gel snel met water. Breng ten slotte de gel voorzichtig over op de lade die in de afbeeldingsreger moet worden geplaatst.
Rol een glazen pipet over de gel om gevangen bellen en overtollige vloeistof te verwijderen. En ga over tot het nemen van een gel beeld. Mango aptamers één, twee, drie, vier waren wezenlijk weerstaan aan denaturatie tot ongeveer één kiesconcentratie Ureum.
20 tot 40 minuten kleuringstijd was voldoende voor maximale gel florescentie. Langere tijd was niet geschikt voor kleine RNAs gebruikt in deze studie als ze begonnen te verspreiden uit de gel. Fluorometer analyse toonde aan dat Mango aptamers een, twee en drie in aanwezigheid van Ureum sneller kon vouwen dan aptamer vier.
Bij afwezigheid van Ureum ging het vouwen veel sneller dan verwacht. De gevoeligheid van de post kleuring methode werd getoond door enkele banden die overeenkomen met goed gevouwen RNAs voor elk van de Mango varianten in inheemse en denatureren gels met een iets minder gevoeligheid voor de latere. Kwantificering van inheemse gels was log lineair over ongeveer een orde van grootte met Mango een, twee, en vier gedragen zich in een meer lineaire manier dan Mango drie.
Kwantificering van denatureringsgels waren meer lineair, wat suggereert dat de aanwezigheid van Ureum in de denatureringsgel een meer homogene manier zou kunnen bieden om de aptamers te vouwen zodra ze in de TO1 biotine kleuroplossing zijn geplaatst. Mango gelabelde RNAs kan worden gedetecteerd in de aanwezigheid van de totale RNA met behulp van TO1 biotine vlekken in vergelijking met SG kleuring. Vergeet niet om ervoor te zorgen dat de gel kleuring container is groot genoeg om de gel passen anders de gel kan vouwen op zichzelf.
De RNA-monsters worden van de ene plaats naar de andere overgebracht. Net als bij de denatureringsgels kan deze methode worden uitgevoerd voor een inheemse gel. Voer de gel in een koude kamer op een lager wattage om inheemse omstandigheden te handhaven.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een snelle en gevoelige post-gel kleuringsmethode voor het visualiseren van RNA's die zijn gelabeld met RNA Mango-aptameren met behulp van polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). De methodologie verbetert het vermogen om biologisch belangrijke RNA's en RNA-complexen te volgen en te visualiseren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biochemie
- Moleculaire Biologie
- RNA-imaging
Achtergrond
- RNA speelt een cruciale rol in diverse biologische processen.
- Het volgen van RNA is essentieel om de betrokkenheid ervan bij ziekten te begrijpen.
- Bestaande methoden voor RNA-visualisatie kunnen complex en tijdrovend zijn.
- De Mango-tagging-benadering biedt een eenvoudiger alternatief.
Doel van de studie
- Om een robuuste kleuringsmethode te ontwikkelen voor de visualisatie van RNA.
- Om de gevoeligheid en specificiteit van RNA-tracking te verbeteren.
- Om de zuivering van RNA-complexen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Post-gel kleuring met TO1-Biotine.
- Gebruik van native of denaturerende PAGE-gels.
- Bereiding van gels met specifieke polyacrylamidepercentages.
- Analyse met behulp van fluorescentielezers.
Belangrijkste resultaten
- De imagingmethode met Mango-tag is gevoelig en snel.
- Het maakt een eenvoudige visualisatie van RNA-banden mogelijk.
- Vanwege de fragiliteit is extra zorgvuldigheid vereist bij de behandeling van de gel.
- De methode kan worden aangepast voor verschillende RNA-typen.
Conclusies
- De ontwikkelde methode vereenvoudigt de tracking en visualisatie van RNA.
- Het heeft potentiële toepassingen bij het bestuderen van RNA-gerelateerde ziekten.
- Toekomstig onderzoek kan de sensitiviteit en specificiteit van de methode verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Fluorescente visualisatie van Mango-gelabeld RNA in polyacrylamidegels maakt gevoelige, specifieke en kosteneffectieve detectie van RNA-soorten in complexe mengsels mogelijk. Deze mogelijkheid voldoet aan een kritische behoefte aan robuuste RNA-tracking en kwantificering tijdens vroege ontdekking en assayontwikkeling, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van RNA-gericht onderzoek. De hoge gevoeligheid en specificiteit van de methode vergemakkelijken de prioritering van het portfolio en de risico-gecorrigeerde voortgang van RNA-gebaseerde activa.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroegtijdige Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse van RNA-soorten en complexen in heterogene monsters mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van RNA-targets via directe visualisatie en kwantificering.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door specifieke RNA-interacties te onderscheiden van de achtergrond.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid in RNA-gecentreerde ontdekkingsprogramma's.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gestandaardiseerde, reproduceerbare workflow voor RNA-detectie in zowel native als denaturerende gels.
- Levert kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor assay-kalibratie en -optimalisatie.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van de RNA-integriteit en -vouwing onder meerdere condities mogelijk.
- Ondersteunt schaalbare screening van RNA-varianten of -complexen voor downstream-toepassingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij studies naar ziekterelevante RNA-biomarkers door gevoelige detectie in complexe achtergronden mogelijk te maken.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door robuuste RNA-tracking te ondersteunen.
- Vermindert het translationele risico door kwantitatieve, reproduceerbare RNA-visualisatiedata te leveren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode voor nabeitsing integreert naadloos van vroege ontdekking tot leadidentificatie en preklinisch onderzoek, waardoor een herbruikbare mogelijkheid voor RNA-visualisatie en kwantificatie wordt geboden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door directe observatie van RNA-targets mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten voor een betrouwbare vergelijking van RNA-monsters.
- Analytiek: Biedt log-lineaire kwantificering en een hoge gevoeligheid voor een robuuste data-analyse.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van biomarkers en continuïteit over verschillende onderzoeksfasen heen.
- Bedrijfsbreed hergebruik: Biedt een kosteneffectief, aanpasbaar platform voor herhaaldelijke RNA-detectiebehoeften.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de validatie van RNA-doelwitten.
- Operationele waarde: Standardiseert workflows voor RNA-visualisatie en verbetert de reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie in RNA-gecentreerde programma's.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van RNA-assets mogelijk op basis van robuuste detectiegegevens.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in RNA-handling en polyacrylamidegelelektroforese.
- Toegang tot fluorescentie-beeldvormingsapparatuur en compatibele kleuringsreagentia is noodzakelijk.
- Vraagt om zorgvuldige behandeling van de gel vanwege de fragiliteit en het risico op breuk tijdens transfers.
- Vereist aanpassing van kleurings Tijden en condities voor verschillende RNA-groottes en geltypen.
- Beperkt door potentiële diffusie van kleine RNA's tijdens langere kleuringsperiodes.
