Name: ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Leer een gemodificeerde ATAC-seq methode voor chromatine-toegankelijkheidsstudies met menselijke CD4+ T-cellen. Deze techniek vermindert mitochondriaal DNA van 50% naar minder dan 3%, wat sequencingskosten met 50% verlaagt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Atsede Siba voor technische ondersteuning. CSC wordt ondersteund door de NIH grant 1R61DA047032.

Dit verbeterde protocol bevat stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van ATAC-seq van CD4 +-lymfocyten, van de grondstof van volbloed door middel van data-analyse (Figuur 1).
1. isolatie van CD4 + T cellen van volbloed
Opmerking: De grondstof voor dit protocol is 15 mL vers volledig bloed verzameld met behulp van standaardprocedures, zodat de bron van de grondstoffen worden geselecteerd op basis van onderzoek vereisten. De schaal van het protocol zoals nodig. Vooraf warm fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) + 2% foetaal kalfsserum (FCS) tot kamertemperatuur (RT) en de centrifuge aan RT aanpassen voordat u de CD4 + T cel verrijking procedure begint.
<ol><li>Voeg 750 µL van menselijke CD4 + T cel verrijking cocktail aan 15 mL bloed in een conische tube van 50 mL en meng zachtjes door inversie. Incubeer bij RT gedurende 20 min. Na incubatie voltooid is, voeg toe 15 mL PBS + 2% FCS aan de buis en meng zachtjes door inversie.</li>
	<li>Een verse 50 mL conische buis met 15 mL dichtheid voedingsbodem voor te bereiden. Zorgvuldig laag het bloedmonster van het verdunde op de bovenkant van het medium dichtheid, die zeker niet te verstoren de dichtheid medium/bloed interface die vormt. Centrifugeer gedurende 20 min op 1.200 x g en RT met versnelling ingesteld op 1 en de aflopende rem af. Opmerking: Het is cruciaal voor de versnelling ingesteld op 1 en aflopende rem af op de centrifuge om onderbrekingen van de cellaag in het medium dichtheid te voorkomen.</li>
	<li>De verrijkte CD4 + T-cellen van de dichtheid medium/plasma interface met behulp van een precisiepipet smalle stengel overdracht verzamelen. De verzamelde cellen overbrengen in een conische buis van verse 50 mL. Centrifugeer de verzamelde CD4 + T cellen gedurende 8 minuten op 423 x g en RT. Opmerking: Zorg ervoor om terug te keren de centrifuge versnelling naar 9 en aflopende rem aan voor stap 1.3 en alle van de volgende stappen uit.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en de cel pellet tweemaal met 50 mL PBS + 2% FCS wassen, centrifugeren voor 8 min op 423 x g en RT. Discard het definitieve supernatant wassen en Suspendeer de pellet gewassen cel in 2 mL PBS + 2% FCS.</li>
	<li>Cellen tellen met behulp van een hemocytometer. Als u wilt doorgaan met de ATAC-seq, gaat u verder met stap 2.3. Als u wilt blokkeren van cellen voor later te worden verwerkt, ga naar stap 1.6.</li>
	<li>Voeg vervolgens 1 mL van verse bevriezing medium (FCS 90% + 10% dimethylsulfoxide) per 1 miljoen cellen. Aliquot 1 mL van de cellen in de bevriezing van medium in cryogene veilig buizen. Buizen aan-80 ° C's nachts in een langzaam-bevriezing container plaatsen. De volgende dag, buizen overbrengen in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Opmerking: 1 miljoen CD4 + T cellen worden geisoleerd per 2 mL van het oorspronkelijke volume van volbloed. Bevriezen van 500.000 cellen in 1 mL aliquots van bevriezing medium. Verse bevriezing medium op elk gebruik maken.</li>
</ol>2. Activeer en zuiveren van CD4 + T cellen
Opmerking: Deze snelle protocol voor het activeren en het zuiveren van CD4 + T cellen alleen vereist 48u en resultaten in 95% levensvatbare, geactiveerd CD4 + T cellen. De centrifuge tot 4 ° C afkoelen voordat u begint met het protocol.
<ol><li>Ontdooi 1 ampul (500.000) van CD4 + T cellen in een waterbad 37 ° C totdat het ijs is net gesmolten. Zachtjes overbrengen in cellen een conische tube van 15 mL, met 9 mL voorverwarmde Roswell Park Memorial Instituut-1640 (RPMI-1640) media aangevuld met 10% FCS, hierna te noemen de volledige RPMI. Opmerking: Laat geen cellen ontdooien volledig Voorkom blootstelling aan DMSO.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 6 min op 1500 x g - en 4 ° C. Verwijder het supernatant en zachtjes Suspendeer de pellet in 2 mL van volledige RPMI. Herhaal de spin naar beneden, verwijder het supernatant en zachtjes schorten cellen in 0,5 mL van volledige RPMI.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen. Aanpassen van de dichtheid van de celsuspensie met volledige RPMI aan de plaat van 50.000 cellen in 200 µL per putje van een 96-Wells-ronde bodemplaat. Opmerking: Uit een bevroren buis van 500K CD4 + T cellen, putjes van de plaat 10 van 50.000 CD4 + T cellen in 200 µL per putje.</li>
	<li>
Magnetische kralen geconjugeerd met menselijke T-activator anti-CD3 en anti-CD28 antilichamen voor te bereiden.
	<ol>
<li>Aliquot 12,5 µL van menselijke T-activator CD3/CD28 kralen per ATAC-seq monster tot een 1,5 mL koker. Wassen van de kralen met 1 mL 1 x PBS en plaats de buis op een magneet voor 1 min.</li>
		<li>Zorgvuldig verwijderen en de duidelijke vloeistof wordt weggeworpen, verwijderen van de buis van de magneet en opschorten van de kralen in 13 µL voltooien RPMI per ATAC-seq monster. Opmerking: Berekent het bedrag van kralen nodig op basis van het aantal monsters van de ATAC-seq wordt verwerkt. Dit protocol vereist 12,5 µL van CD3/CD28 kralen per 500.000 cellen, zijnde één ATAC-seq monster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De CD4 + T-cellen activeren. Verzamelen van 500.000 cellen in 2.1 mL voor volledige RPMI medium in een conische tube van 15 mL en voeg 12,5 µL van vooraf gewassen menselijke T-activator parels. Meng voorzichtig door het omkeren van de buis.</li>
	<li>Zachtjes de cellen met kralen naar een steriele reservoir en plaat 200 µL van cellen met kralen per putje van ronde bodemplaat 96-Wells met behulp van een precisiepipet meerkanaals overbrengen. Incubeer gedurende 48 uur in een 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Na incubatie, centrifugeren van de 96-wells-plaat gedurende 8 minuten op 423 x g en RT. verwijderen 100 µL van medium per putje van de 96-wells-plaat, het het verzamelen in een conische buis voor teruggooi om ervoor te zorgen geen verlies van de kraal. Resuspendeer de pellet van de cel in de resterende 100 µL en verzamelen all-in-een 1,5 mL-buis. Opmerking: 10 putjes van geactiveerde T-cellen worden verzameld in een volume van 1 mL.</li>
	<li>Uitvoeren van CD4 + isolatie. 50 µL van vooraf gewassen CD4 geconjugeerd parels aan 500.000 cellen in 1 mL van volledige RPMI toevoegen. Kralen en cellen combineren met pipet. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C in de koelkast. Agitate kralen en cel mengsel elke 6 min. Opmerking: Dit protocol wordt gebruikt voor een steekproef van 500.000 cellen. Pas zo nodig voor twee of meer steekproeven van 500.000.</li>
	<li>Wanneer de incubatie voltooid is, plaatst u de buis aan de magneet voor 2 min. verwijderen en verwijder het supernatant wanneer duidelijk. Wassen de kraal-gebonden cellen door het verwijderen van de buis van de magneet, opschorting van de cellen van de kraal-gebonden in 1 mL PBS + 2% FCS, ter vervanging van de buis aan de magneet voor 1 min en teruggooi van het supernatans dat duidelijk. Herhaal dit proces voor een totaal van 3 wasbeurten. Opmerking: Wees voorzichtig niet te ontdoen van alle kralen tijdens wasbeurten.</li>
	<li>Na de definitieve wash, plaats de buis aan de magneet voor 1 min. verwijderen en verwijder het supernatant en plaats de pellet op ijs. Ga verder met sectie 3 (ATAC-seq).</li>
</ol>3. ATAC-seq
Opmerking: In deze stap zijn kernen geïsoleerd uit geactiveerde CD4 + T cellen voor ATAC-seq. De lysis-buffermengsel gebruikt in dit protocol is verbeterd om te worden zachter op de kernen, wat resulteert in een efficiëntere spijsvertering en hogere kwaliteit van de resultaten. Alle stappen van het centrifugeren in punt 3 worden uitgevoerd met een vaste hoek centrifuge onderhouden bij 4 ° C. Koel de centrifuge voordat u begint met protocol.
<ol><li>Uitvoeren van kernen isolatie. Resuspendeer kralen en cellen met koude lysis-buffermengsel (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,03% Polysorbaat 20). Centrifugeer onmiddellijk bij 500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijderen en verwijder het supernatant.</li>
	<li>De reactie van de transposase uit te voeren. Opschorten van de geïsoleerde kernen pellet met 50 µL van Tn5 transposase mix (tabel 1). Incubeer in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 37 ° C met een deksel van 40 ° C, bij 4 ° C na afloop houden.</li>
	<li>Na thermocycling, onmiddellijk uitvoeren van een snelle benchtop centrifuge spin down en plaats de buis op de magneet voor 1 min om de parels van het product.</li>
	<li>Overbrengen in het supernatans dat duidelijk uit de buis aan de magneet een DNA zuivering kolom. Was de kolom met 250 µL van Buffer PB en tweemaal met 750 µL van Buffer PE. Elueer het monster in 10 µL van elutie buffer. Ga direct naar stap 3.5. Opmerking: Deze stap versterkt de DNA-fragmenten met de ligaturen adapters, aangeduid als de ATAC-seq-bibliotheek. Om verschillende ATAC-seq bibliotheken kunnen worden uitgevoerd op een NGS rijstrook multiplex, door niet-geïndexeerde Primer 1 te gebruiken voor alle monsters en een verschillende geïndexeerde Primer 2 voor afzonderlijke monsters (tabel 2). Inleidingen worden gebruikt in concentraties van 1,25 µM werken.</li>
	<li>Instellen van de eerste PCR versterking reactie in een nuclease-vrije PCR-buis, het combineren van de componenten in de volgorde en het volume opgegeven tabel 3. Plaats van de PCR-buis in de thermocycler en de PCR versterking programma uitvoeren met fietsen voorwaarden zoals vermeld in tabel 4.</li>
	<li>
De reactie door qPCR volgen. Instellen van de reactie van de qPCR in een nuclease-vrije PCR-buis, het combineren van de componenten in de volgorde en het bedrag dat is opgegeven in tabel 5. Plaats in qPCR machine en cyclus als gespecificeerd in tabel 6.
	<ol>
<li>Als u bepalen dat het optimale aantal extra versterking cycli voor de resterende 45 µL reactie, maakt u een perceel met cyclus nummer op de x-as en de relatieve fluorescentie (RFU) op de y-as. Het optimale aantal extra versterking cycli is eenderde van het aantal cycli die nodig is om de reactie van de qPCR op het plateau te bereiken. Opmerking: Controle van de reactie door qPCR maakt het mogelijk voor de bepaling van het optimale aantal cycli van PCR gewenst om optimale bibliotheek fragment amplificatie terwijl het minimaliseren van GC inhoud en grootte bias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vul de laatste PCR versterking van de resterende 45 µL van het PCR reactie. De PCR-buis met de reactie van de amplificatie van stap 3.5 plaats terug in de thermocycler en voer het programma zoals beschreven in tabel 7. Opmerking: Voor monsters verwerkt zoals beschreven in dit protocol, werd het optimale aantal cycli van PCR versterking bepaald als 12.</li>
	<li>Nadat de versterking voltooid is, zuiveren de bibliotheken met behulp van een PCR Schoonmaakbeurt kit volgens protocol van de fabrikant, eluerende in 25 µL van de elutie buffer. Opmerking: Versterkte bibliotheken kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 48 h of bevroren bij-20 ° C voor langdurige opslag.</li>
</ol>4. analyse van de kwaliteit van de bibliotheek van ATAC-seq
Opmerking: Het is belangrijk voor het valideren van de kwaliteit en de kwantiteit van ATAC-seq bibliotheken voor de volgende generatie sequencing. De kwaliteit en kwantiteit van de bibliotheken moeten worden beoordeeld met behulp van commercieel beschikbare kits (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Het beoordelen van de kwaliteit en kwantiteit van de ATAC-seq-bibliotheken met behulp van een microfluidics-gebaseerd platform voor grootte, kwantificering en kwaliteitscontrole van DNA. Zie Figuur 2 voor de resultaten van de beoordeling van de kwaliteit van de vertegenwoordiger. Opmerking: De concentratie van de ATAC-seq bibliotheken moet > 1 ng/µL sequencing kwaliteitsresultaten te verkrijgen. Op gemiddeld 30 nM in 25 µL werd verkregen.</li>
</ol>5. sequencing en Data-analyse
Opmerking: Deze analyse pijpleiding kan gebruikers controleren zij de kwaliteit van toewijzing van de procedure luidt, aanpassen van de coördinaten van de proefopzet en bel pieken voor downstream-analyse. Hier volgen de lijnen van de commando's en uitleg van uitvoering. De data analyse pakket is beschikbaar op (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
<ol><li>Het volgnummer van de bereid bibliotheken op een volgende generatie sequencer tot een gemiddelde Lees diepte van 42 miljoen leest per monster.</li>
	<li>Een schatting van de kwaliteit van sequencing leest door het controleren van bestanden die zijn gegenereerd door FastQC12 softwarepakket met behulp van de opdracht: fastqc -o < uitvoer_directory >< fastq_file ></li>
	<li>Trim de basissen van leest door Trimmomatic13 software, indien nodig, zoals bepaald door de kwaliteitscontrole van de FastQC, met behulp van de opdracht (voor paar fitting): java-jar < pad naar trimmomatic jar bestand > PE < Ingang1 >< Ingang2 >< gepaarde Uitgang1 >< ongepaarde Uitgang1 >< gepaarde output2 >< ongepaarde output2 > HEADCROP: < bijsnijden honken ></li>
	<li>Uitlijnen Bowtie214 software leest aan menselijke referentie genoom (hg38): bowtie2 - x < verwijst naar genoom > -1 < input paar 1 >< input paar 2 > -S < SAM uitvoerbestand > Opmerking: Het argument - x is voor de basename van de index voor de referentie-genoom en -S is voor de uitvoer van SAM formaat.</li>
	<li>Dekwaliteitsdoelstellingen van toegewezen luidt met behulp van Samtools15 flagstat pakket controleren samtools flagstat < BAM bestand ></li>
	<li>Het bestand toegewezen leest sorteren en verwijderen van duplicaten met Picard16 gereedschap: java-jar picard.jar INPUT SortSam = < input SAM bestandsnaam > OUTPUT = < output gesorteerd op BAM bestandsnaam > SORT_ORDER coördinaat = "en" java-jar picard.jar MarkDuplicates INPUT = < gesorteerde BAM bestand > OUTPUT = < BAM uitvoerbestand zonder duplicaten > REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>Index BAM bestand, trim de ongebruikte chromosoom leest en verschuiving van de coördinaten voor de experimentele reden van ATAC-seq17: java-jar picard.jar BuildBamIndex-INPUT = < BAM bestand > samtools idxstats < Input BAM bestand > | Cut -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools bekijken -b < Input BAM bestand >>< Output getrimd BAM bestand > bedtools bamtobed -i < Input getrimd BAM bestand >>< Output getrimd BED bestand > awk ' beginnen {OFS = "\t"}; {Als ($6 == "+") print $1, $2 + 4, $3 + 4, $4, $5, $6; anders afdrukken van $1, $2-5, $3-5, $4, $5, $6}' < Input getrimd BED bestand >< Trimmed verschoven BED bestand ></li>
	<li>Verwijder het luidt dat zijn verschoven naar negatieve coördinatie: awk '{if ($2 > 0) afdrukken $1 "\t" $2 "\t" $3 "\t" $4 "\t" $5 "\t" $6}' < Input BED bestand >< uitvoerbestand niet-negatieve coördinatie BED >.</li>
	<li>De BED-bestand converteren naar BAM bestand voor volgende DiffBind18 analyse: bedtools bedtobam -i < Input BED bestand > -g < verwijzing genoom >< Output BAM bestand ></li>
	<li>Piek roeping uitvoeren door DiffBind18 softwarepakket: macs2 callpeak -t < Input BAM bestand > -f BAM -g hs - nomodel--nolambda--houden-dup alle--oproep-topontmoetingen--outdir < mappad Output > - n < Output naam > -B - q 0.01--bdg--shift-100--extsize 200 Opmerking: Na filtering, verwachten een mediaan van 37 miljoen leest per monster. Mitochondriaal DNA verontreiniging zullen variëren van 0,30 – 5.39% (1.96% gemiddeld). Zal er een laag tarief van vermenigvuldigen toegewezen luidt (6,7% – 56%, 19% gemiddeld) en een relatief hoog percentage van bruikbare nucleaire leest (60%-92%, 79% gemiddeld).</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
<li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase-seq%3A+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li>
<li>Pajoro, A., Muiño, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq%3A+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li>
<li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAIRE+%28Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements%29+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li>
<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
<li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41(2017).</li>
<li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li>
<li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Andrews, S. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2018).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Stark, R., Brown, G. DiffBind: Differential Binding Analysis of ChIP-Seq Peak Data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf">http://bioconductor.org/packages/devel/bioc/vignettes/DiffBind/inst/doc/DiffBind.pdf</a> (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het gewijzigde ATAC-seq-protocol gepresenteerd in dit artikel biedt reproduceerbare resultaten met minimale mitochondriaal DNA-besmetting. Het protocol is met succes gebruikt om zijn karakteriseren chromatine architectuur van menselijke primaire PBMCs10, menselijke monocyten, muis dendritische cellen (ongepubliceerd), en gekweekte melanoom cel lijnen11. Wij verwachten dat deze verbeterde lysis voorwaarde heeft het potentieel om te werken voor andere celtypes ook. Verwacht w...

De assay voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) is snel uitgegroeid tot de toonaangevende methode voor de raadpleging van de chromatine het platform. ATAC-seq herkent regio's van de toegankelijke chromatine door het proces van tagmentation, fragmenteren en tagging van DNA door het zelfde enzym, voor de productie van bibliotheken waarmee reeksnummers chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom kunt bepalen. Dit tagmentation proces wordt gemedieerd door de hyperactieve Tn5 transposase, die alleen open regio's van de chromatine als gevolg van nucleosomic sterische hinder snijdt. Als het snijdt, voegt de transposase van de Tn5 ook sequencing adapters waarmee voor snelle bibliotheek bouw door PCR en volgende-generatie sequentiebepaling van het genoom-brede toegankelijk chromatine1,2.
ATAC-seq is uitgegroeid tot de geprefereerde methode om te bepalen van de regio's van de chromatine toegankelijkheid als gevolg van de relatief eenvoudige en snelle protocol, de kwaliteit en de hoeveelheid informatie die kan worden bepaald uit de resultaten, en de kleine hoeveelheid grondstof nodig. Vergeleken met DNase-seq3 (die ook maatregelen genoom-brede chromatine toegankelijkheid), MNase-seq4 (die bepaalt nucleosoom posities open genoom regio), en de formaldehyde-gemedieerde FAIRE-seq5, ATAC-seq is sneller, goedkoper en meer reproduceerbare1. Het is ook meer gevoelig, werken met de grondstof voor zo weinig als 500 kernen, ten opzichte van de kernen van de 50 miljoen nodig voor DNase-seq3. ATAC-seq heeft ook de mogelijkheid om meer informatie over de architectuur van de chromatine dan andere methoden, met inbegrip van de regio's van transcriptie factor bindende, nucleosoom positionering en open chromatine regio's1. Effectieve, eencellige ATAC-seq-protocollen zijn gevalideerd, voorlichting over chromatine architectuur aan de eencellige niveau6,-7.
ATAC-seq is gebruikt voor het karakteriseren van chromatine het platform over een breed spectrum van onderzoek en cellen soorten, met inbegrip van planten8, mens9en vele andere organismen. Het is ook cruciaal voor het identificeren van Epigenetische regulatie van de ziekte staten7geweest. Het meest gebruikte ATAC-seq-protocol bevat echter het grote nadeel van besmetting sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA. In sommige datasets kunnen dit niveau van verontreiniging oplopen tot 60% van de volgorde van de resultaten1. Er is een gezamenlijke inspanning op het gebied om deze contaminerende mitochondriale leest zodat de meer efficiënte toepassing van ATAC-seq7,10,11. Hier presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol dat het mitochondriaal DNA verontreiniging tarief reduceert tot slechts 3%, waardoor vermindering van ongeveer 50% in sequencing kosten10. Dit wordt mogelijk gemaakt door een gestroomlijnd proces van activering, CD4 +-lymfocyten isolatie en een verbeterde lysis-buffermengsel die van essentieel belang bij het minimaliseren van mitochondriaal DNA besmetting.
Dit protocol modifiedATAC-seq is gevalideerd met een breed scala van primaire cellen, met inbegrip van de primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)10, menselijke primaire monocyten en muis dendritische cellen (niet uitgegeven). Het is ook gebruikt met succes om te ondervragen melanoom cellijnen in een geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) scherm met niet-coderende elementen11. Daarnaast biedt het gegevenspakket analyse in dit protocol omschreven en aangeboden op GitHub nieuwe en ervaren onderzoekers met tools om ATAC-seq gegevens te analyseren. ATAC-seq is de meest effectieve assay chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom in kaart, en wijzigingen in het bestaande protocol die hier worden geïntroduceerd onderzoekers om kwalitatief hoogwaardige gegevens met lage mitochondriaal DNA besmetting, te produceren zal toestaan sequencing kostenverlaging en het verbeteren van ATAC-seq doorvoer.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, Sterile</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>96 Well Round Bottom Plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tape Station System</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>Aanbevolen voor kwaliteitsbeoordeling.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td>50674626</td><td>Aanbevolen voor kwaliteitsbeoordeling.</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>NaCl, Molecular Biology Grade</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Nuclease Free Sterile dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Precision Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>Aanbevolen voor kwaliteitsbeoordeling.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>Aanbevolen voor kwaliteitsbeoordeling.</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15022</td><td>Kritisch onderdeel</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>Sterile Resevoir</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Kan andere vergelijkbare producten gebruiken.</td></tr></tbody></table>

atac-seq assay met lage mitochondriaal dna besmetting van primaire menselijke cd4 + t lymfocyten

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq is uitgegroeid tot een veel gebruikte methodiek in de studie van de epigenetica vanwege zijn snelle en eenvoudige benadering van genoom-brede toegankelijk chromatine in kaart te brengen. In deze paper presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol, dat vermindert de verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest. Terwijl vorige ATAC-seq protocollen hebben geworsteld met leest een gemiddelde van 50% besmetten mitochondriaal DNA, de geoptimaliseerde lysis-buffermengsel in dit protocol opgenomen vermindert mitochondriaal DNA besmetting tot een gemiddelde van 3%. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol voorziet in een in de omgeving van 50% vermindering van de kosten van het rangschikken. We laten zien hoe deze kwalitatief hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken kunnen bereid worden uit geactiveerde CD4 +-lymfocyten, stapsgewijze instructies uit CD4 + lymfocyt isolement van volbloed door middel van data-analyse. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol in een breed scala van celtypes is gevalideerd en zullen voor onmiddellijk gebruik aan onderzoekers bestuderen van chromatine toegankelijkheid.

Van 15 mL vers volledig bloed genereert dit protocol een gemiddelde van 1 miljoen CD4 + T cellen. Dit kunnen worden ingevroren voor later te worden verwerkt of gebruikt onmiddellijk. Levensvatbaarheid van de CD4 + T-cellen, verse of ontdooide, was consequent > 95%. Deze methode van CD4 + T cel isolatie zorgt voor flexibiliteit in de bron-materiaal en collectie-tijd. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol produceert een definitieve bibliotheek van meer dan 1 ng/µL voor het rangschikken. Kwalitei...

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Dit gewijzigde ATAC-seq protocol introduceert een nieuwe lysis buffer die vervuilende mitochondriale reads verlaagt van 50% naar minder dan 3%De verminderde mitochondriale besmetting zal onderzoekers in staat stellen om efficiëntere ATAC-seq uit te voeren met een 50% daling van de sequencing kosten. We hebben dit nieuwe ATAC-seq protocol gevalideerd in menselijke primaire PBMCs, menselijke primaire monocyten, muisdendrogtische cellen en melanoomcellijnen. Wij geloven dat het effectief zal zijn in een breed scala van celtypes.Het minimaliseren van monsterverlies tijdens het celactiverings- en selectieproces is van cruciaal belang voor het verkrijgen van hoogwaardige resultaten met ATAC-seq. We zullen aantonen hoe om te gaan met kleine aantallen cellen uit kostbare monsters met behulp van basislaboratoriumapparatuur. Om te beginnen ontdooien een flesje van eerder geïsoleerde CD4 + T cellen in een 37-graden Celsius waterbad totdat het ijs net is gesmolten.Breng de cellen vervolgens voorzichtig over op een conische buis van 15 milliliter met negen milliliter voorverwarmde volledige RPMI. Centrifugeren de cellen op 1, 500 keer G, en vier graden Celsius, gedurende zes minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pellet voorzichtig opnieuw op in twee milliliters van volledige RPMI.Na het herhalen van de centrifugatie, gooi de supernatant, en voorzichtig resuspend de cellen in 0,5 milliliter van volledige RPMI. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Met behulp van volledige RPMI, pas de cel suspensie dichtheid aan plaat 50, 000 CD4 + cellen in 200 microliter per put van een 96-goed ronde bodem plaat.Vervolgens, om magnetische kralen voor te bereiden, aliquot 12,5 microliter van Human T-Activator CD3/CD28 kralen per ATAC-seq monster om een 1,5 milliliter buis. Voeg een milliliter 1x PBS toe aan de buis en plaats deze een minuut op een magneet om de kralen te wassen. Verwijder en gooi de heldere supernatant voorzichtig weg en verwijder de buis van de magneet.Resuspend de kralen in 13 microliter van volledige RPMI per ATAC-seq monster. Om de CD4+T-cellen met de aangepaste concentratie te activeren, verzamel je 500.000 cellen in 2,1 milliliter volledig RPMI-medium in een conische buis van 15 milliliter. Voeg 12,5 microliter menselijke T-Activator kralen, bereid en gewassen in eerdere stappen, en voorzichtig mengen door het omkeren van de buis.Breng de cellen, met kralen, voorzichtig over naar een steriel reservoir. Met behulp van een multi-channel pipet, plaat 200 microliters van cellen met kralen per put van een ronde-bodem 96-well plaat, en incubeer in een 37-graden Celsius, 5% CO2 incubator voor 48 uur. Na volledige incubatie, centrifugeren de plaat op 423 keer G, en kamertemperatuur, gedurende acht minuten.Verwijder 100 microliter medium uit elke put en verzamel het in een conische buis voordat u het weggooit, om geen kraalverlies te bevestigen. Dan resuspend de cel pellet in de resterende 100 microliter van medium, en verzamel alles in een 1,5-milliliter buis. Om CD4+-cellen te isoleren, voegt u 50 microliter voorgewassen CD4-geconjugeerde kralen toe aan 500,000 cellen in één milliliter volledige RPMI en omkeert u om te mengen.Incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius, terwijl de hand-flicking elke zes minuten te mengen. Plaats de buis twee minuten op de magneet, totdat supernatant duidelijk is, en verwijder en gooi deze weg. Haal de buis uit de magneet.Was de kraalgebonden cellen door ze opnieuw in één milliliter PBS te gebruiken, plus 2%FCS, en plaats de buis gedurende één minuut terug op de magneet. Gooi de duidelijke supernatant weg en herhaal dit proces voor een totaal van drie wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, plaats de buis op de magneet voor een minuut.Verwijder het, gooi de supernatant weg en leg de pellet op ijs. Vervolgens om kernisolatie uit te voeren, de kralen en cellen opnieuw op te zetten in 50 microliter van koude lysebuffer, en onmiddellijk te centrifugeren bij 500 G, vier graden Celsius, gedurende 10 minuten. Verwijder en gooi de supernatant weg.Om de transposasereactie uit te voeren, wordt de geïsoleerde kernenpellet opnieuw opgetrokken met 50 microliter van Tn5-transposasemix. Incubeer in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, met het deksel ingesteld op 40 graden Celsius, en houd dan op vier graden Celsius wanneer voltooid. Direct na het thermocycling, voer een snelle bank-top centrifuge spin-down.Plaats de buis gedurende een minuut op de magneet om de kralen uit het product te verwijderen. Zonder de buis uit de magneet te verwijderen, breng je de heldere supernatant over naar een DNA-zuiveringskolom. Was de kolom eenmaal met 250 microliters pbbuffer en twee maal met 750 microliter PE-buffer.Voeg vervolgens 10 microliter elutie buffer toe om het monster te ontwijken. Stel de eerste PCR-versterkingsreactie in een nuclease-vrije PCR-buis in. Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het PCR-versterkingsprogramma uit.Voltooi vervolgens de definitieve PCR-versterking van de resterende 45 microliters van PCR-reactie, zoals beschreven in het manuscript. Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het programma uit. Na volledige versterking, zuiveren van de bibliotheken met behulp van een PCR cleanup kit, volgens het protocol van de fabrikant, eluting in 25 microliters van de elutie buffer.Volg de voorbereide bibliotheken op een sequencer van de volgende generatie tot een gemiddelde leesdiepte van 42 miljoen leest per steekproef. Dit verbeterde ATAC-seq protocol produceerde een definitieve bibliotheek van meer dan een nanogram per microliter voor sequencing. Kwaliteitscontrole toonde DNA-fragmenten tussen 200 en 1.000 basisparen, en verdere sequencing werd uitgevoerd met deze hoogwaardige bibliotheken.Bibliotheken die volgens dit protocol waren opgesteld, vertoonden slechts 3%mitochondriale verontreiniging. Het hoge percentage bruikbare reads is voldoende constant over biologische replica's. Dit protocol leverde zeer reproduceerbare resultaten op voor technische replica's, evenals biologische replica's.Bovendien duurde dit protocol 48 uur, in plaats van een week of meer zoals eerder beschreven, wat resulteerde in consistente en efficiënte activering, zoals blijkt uit reproduceerbare sequencing resultaten. Bovendien werden voorspelde ATAC-seq pieken nauwkeurig genoemd door de analysepijplijn. Sequencing resultaatanalyse bleek duidelijke veranderingen in chromatine toestand tijdens de menselijke T-cel activering.Tussen zes monsters vóór en 48 uur na de activering werden differentiaal toegankelijke gebieden van open chromatine geïdentificeerd. Zorg ervoor dat de kernlysereactie wordt uitgevoerd met gekoelde reagentia en materialen, om het herstel van intacte kernen te maximaliseren. Onze gemodificeerde kernen lyse buffer is zachter op de cellen, en minimaliseert vervuilende mitochondriaal DNA.We kijken ernaar uit om deze gewijzigde lysis buffer wordt toegepast op single-nuclei ATAC-seq ook. We weten dat dit protocol onderzoekers in staat zal stellen om atac-seq-gegevens van hogere kwaliteit te produceren tegen lagere kosten, waardoor het epigenetische veld kan worden doorgestuurd. Het protocol is eenvoudig, snel en vereist geen gevaarlijke reagentia of instrumenten, waardoor het gemakkelijk toegankelijk is voor degenen die nieuw zijn bij ATAC-seq.

atac-seq-assay-with-low-mitochondrial-dna-contamination-from-primary

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Assay voor Transposase-toegankelijk chromatine in combinatie met high-throughput sequencing (ATAC-seq) is een genoom-brede methode aan het licht brengen van toegankelijke chromatine. Dit is een stapsgewijze ATAC-seq-protocol, van moleculaire aan computationele uiteindelijk geoptimaliseerd voor menselijke lymfocyten (Th1/Th2). Dit protocol kan worden aangenomen door onderzoekers zonder voorafgaande ervaring in volgorde van volgende-generatie methoden.

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Hier beschrijven we een methode die zich lenen voor het gelijktijdig kwantificeren en genoom-brede kaart ribonucleotides in zeer intact DNA op single-nucleotide de resolutie, enzymatische splitsing van genomic DNA te combineren met de alkalische hydrolyse en de daaropvolgende 5´-end sequencing.

Gelijktijdige Mapping en kwantificatie van Ribonucleotides in menselijke mitochondriaal DNA

Metabole aanpassing is fundamenteel voor T-cellen omdat het differentiatie, persistentie en cytotoxiciteit dicteert. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het monitoren van mitochondriale ademhaling in ex vivo cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen.

Real-time monitoring van mitochondriale ademhaling in cytokine-gedifferentieerde menselijke primaire T-cellen

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

ATAC-seq is een DNA-sequencingmethode die de hyperactieve mutant transposase, Tn5, gebruikt om veranderingen in chromatinetoegankelijkheid in kaart te brengen, gemedieerd door transcriptiefactoren. ATAC-seq maakt de ontdekking mogelijk van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische veranderingen in kankercellen. Dit protocol schetst optimalisatieprocedures voor ATAC-seq in epitheelceltypen, waaronder kankercellen.

ATAC-Seq Optimalisatie voor Kanker Epigenetica Onderzoek

Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.

Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

De bio-energetica van CD8 T-cellen kan worden ondervraagd met behulp van de Mito-stresstest. Deze methodologie kan worden gebruikt om acute en chronische metabole programmering te bestuderen. Dit protocol beschrijft benaderingen om de relaties tussen T-celreceptorbiologie en bio-energetische analyse te onderzoeken.

Meten van de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Dit manuscript schetst een protocol voor het voorbereiden van een ATAC-seq-bibliotheek van neutrofielen uit muizenbeenmerg, met als doel een optimale levensvatbaarheid van neutrofielen en een hoge bibliotheekkwaliteit te garanderen. Het biedt stapsgewijze instructies voor BMC-voorbereiding, immunomagnetische sortering en bibliotheekconstructie, en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het bestuderen van neutrofielen.

ATAC-SEQ Bibliotheekbereiding van van muizen beenmerg-afgeleide neutrofielen

Leer een gemodificeerde ATAC-seq methode voor chromatine-toegankelijkheidsstudies met menselijke CD4+ T-cellen. Deze techniek vermindert mitochondriaal DNA van 50% naar minder dan 3%, wat sequencingskosten met 50% verlaagt.

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

Meer video's verkennen