Isolatie en adoptief overdracht van hoge zout behandeld antigeen-presenteren dendritische cellen

Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen op het gebied van hypertensie en hart- en vaatziekten, waaronder de studie van CD11c positieve dendritische cellen en hoe ze de rol van hypertensieve letsel versterken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de isolatie van CD11c positieve dendritische cellen van vaste organen en de studie van hun fysiologische rol in verschillende ziektetoestanden. Dit proces kan dus worden toegepast op meerdere immuunceltypen, waaronder B-lymfocyten, T-lymfocyten, monocyten en macrofagen.

Visualisatie van de techniek is van cruciaal belang om dendritische celisolatie te begrijpen, met name het adoptieproces naar ontvangende muizen. Om te beginnen, spray de borst en zijkanten van de geëuthanaseerde muis met 70%ethanol. Open aan de linkerkant voorzichtig de huid en de buikholte om de milt bloot te leggen.

Met behulp van kleine tangen, voorzichtig verplaatsen van de darmen en de lever aan de linkerkant van de muis. Gebruik vervolgens een kleine schaar om de milt voorzichtig weg te nemen. Plaats elke uitgesneden milt in een gelabelde C-buis met drie milliliter RPMI 1640-medium.

Voeg eerst collagenase D en DNase toe aan het voorbereide RPMI 1640-medium om de miltverteringsoplossing voor te bereiden. Plaats de C-buis op een semi-geautomatiseerde homogenisator en zorg ervoor dat de buis stevig op de roterende arm wordt geplaatst. Druk op de startknop op de homogenisator om het milt 04.01-protocol gedurende 60 seconden uit te voeren.

Maak hierna de buis los van de homogenisator en ontcubeer de monsters bij 37 graden Celsius onder continu bij 20 tpm gedurende 15 minuten. Gebruik vervolgens een pipet om de oplossing over te zetten in een 50 milliliter conische buis na het filteren door een 40 micrometer zeef. Was de zeef met 10 milliliter dPBS.

Centrifugeren de cellen op 300 keer g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Spoel vervolgens de supernatant volledig aan en was de pellet door het opnieuw op te schorten in 10 milliliter dPBS. Centrifuge de suspensie op 300 keer g en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Schort de celpellet opnieuw op in vijf milliliter dPBS. Gebruik een hemocytometer en Trypan blauwe uitsluiting om het aantal cellen te tellen. Volgende centrifuge op 300 keer g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten om de cellen pellet.

Aspirate de supernatant volledig en opnieuw op te schorten de pellet in 400 milliliter van magnetisch geactiveerd cel-sorteren buffer. Voeg vervolgens 100 milliliter CD11c microbeads per 100 miljoen cellen toe. Vortex de cel suspensie en incubeer gedurende 10 minuten in een koelkast op vier graden Celsius.

Voeg hierna 10 milliliter MACs-buffer toe om de cellen te wassen en te centrifugeren bij 300 keer g en gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Aspirate de supernatant volledig en opnieuw op te schorten de cellen in 500 milliliter van MACs buffer. Plaats de LS-kolom in het magnetisch veld van de mag separator en plaats een 15 milliliter conische buis onder elke kolom om de stroom door te verzamelen.

Spoel vervolgens de kolommen af met drie milliliter buffer. Plaats de celsuspensie op elke kolom en verzamel de stroom waardoor niet-gelabelde cellen zijn opgenomen. Was de kolommen met drie milliliter macs buffer en het verzamelen van de niet-gelabelde cellen die passeren.

Was de LS-kolommen twee keer extra met behulp van drie milliliter MACs buffer per wasbeurt. Verwijder hierna de LS-kolommen uit de magnetische scheidingsteken. Voeg vijf milliliter MACs buffer aan elke kolom en onmiddellijk duik elke kolom in een duidelijke 15 milliliter conische buis te spoelen uit de magnetisch gelabelde cellen.

Gebruik een hemocytometer en Trypan blauwe uitsluiting om het cd11c positieve DC-getal te bepalen zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun vervolgens het celmonster bij een een-op-een verdunning in 0,4%Trypan blauwe oplossing. Bereid eerst de celpellets voor in DC-kweekmedia zoals beschreven in het tekstprotocol.

Pipette 900 microliters van de DC-suspensie in 24-goed platte bodemvalkplaat. Voeg 100 microliter van de hoge zout DC-kweekmedia toe aan elke put, voor een uiteindelijke natriumconcentratie van 190 millimolar. Label de plaat en plaats deze 48 uur in een bevochtigde koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius.

Verwijder na 48 uur de plaat uit de couveuse. Pipette de cel cultuur media in een enkele put op en neer om opnieuw op te schorten de CD11c positieve DC's. Breng al deze schorsing in een overeenkomstige gelabelde 1,6 milliliter buis.

Herhaal dit voor elke individuele goed die verguld was. Centrifugeren alle buizen op 300 keer g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Aspirate de supernatant en opnieuw op te schorten de DC pellet met 100 microliters van steriele dPBS.

Trek vervolgens de DC-oplossing van een van de buizen in een een milliliter spuit, uitgerust met een 27 meter halve inch naald. Plaats de naïeve man 10 weken oude C57-zwart-6 muis onder 2%isoflurane om een stabiel chirurgisch vlak te bereiken. Controleer het niveau van anesthesie met een gebrek aan pedaalreflex.

Zodra een stabiel chirurgisch vlak is bereikt, langzaam en zorgvuldig introduceren van de naald in de retro-orbitale ruimte onder een hoek van ongeveer 30 graden. Injecteer langzaam en soepel de CD11c positieve DC-vering. Zodra de injectie is voltooid, voorzichtig verwijderen van de naald voor de retro-orbitale ruimte, ervoor te zorgen dat het oog niet beschadigen.

Verwijder vervolgens de muizen uit de neuskegel en controleer ze gedurende ongeveer 30 minuten tijdens het herstel van anesthesie. Een typische bloeddrukanalyse wordt hier getoond na de adoptieoverdracht van DC's en osmotische minipompen die zijn geïmplanteerd voor een lage dosis Angiotensin II-infusie. Opgemerkt moet worden dat deze lage dosis Angiotensin II een suppressor dosis is die de bloeddruk bij een normale muis niet verhoogt.

Muizen die normale met zout behandelde CD11c-positieve DC's krijgen, handhaven een normale bloeddruk tijdens de infusie, terwijl de muizen die hoogzout behandelde CD11c-positieve DC's ontvangen, een toename van de systolische bloeddruk vertonen. Flow cytometrie analyse wordt vervolgens uitgevoerd met behulp van de gating strategie hier getoond om de zuiverheid van de geïsoleerde CD11c positieve cellen te bepalen. Een verhoogde verrijking van de CD11c positieve cellen wordt gezien in vergelijking met de totale splenocyten.

Verschillende CD11c Microbead concentraties worden gebruikt om het protocol van de fabrikant op te lossen. Magnetische scheiding van splenocyten met behulp van 100 microliter microliter microbeads levert ongeveer 65% van de CD11c positieve cellen, terwijl het gebruik van 200 microliters levert 55%en het gebruik van 300 microliter levert 50%Een FcR blokker is opgenomen, samen met 100 microliters van Microbeads. Na de magnetische scheiding levert de blokkade van FcR ongeveer 65% CD11c-positieve cellen op.

Sommige splenocyten worden vervolgens geïncubeerd met 100 microliter microbeads en magnetisch gescheiden door een LS-kolom. De gescheiden cellen worden geïncubeerd met een extra 100 microliter CD11c en opnieuw gescheiden door een LS-kolom. Dit dubbele isolatieproces leverde 92% CD11c positieve cellen op.

Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om de zuiverheid van de geïsoleerde cellen te bevestigen door stromingscytometrie. Na magnetische isolatie van dendritische cellen kunnen ze worden gekweekt om hun activeringsstatus te bepalen door moleculaire technieken, waaronder proteomics en eencellige sequencing. Sinds de ontwikkeling is het nu mogelijk om de functie en specifieke rol van dendritische cellen bij hypertensie te bestuderen.

Onderzoekers zijn nu het verkennen van de specifieke antigenen in hypertensie.