Name: Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer hoe u een elektrische stimulatiekamer bouwt voor het verbeteren van osteogene differentiatie in mesenchymale stamcellen. Dit herbruikbare, kosteneffectieve systeem ondersteunt botweefselengineering en elektrogevoelig celgedragsonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een AO Stichting Start-Up Grant (S-14-03 H) en de Friedrichsheim-Stichting (Stiftung Friedrichsheim), gevestigd in Frankfurt am Main, Duitsland.

1. bouw van elektrische stimulatie cel cultuur kamer
<ol><li>Verzamelen om te bouwen de kamer EStim, twee deksels van standaard 6-well cel cultuur platen; 99,99% platina-draad, 60 cm lang met een diameter van 0,5 – 1 mm; zilver gecoat koperdraad, 70 cm lang met een diameter van 0.6 mm; snijden-tangen; soldeerbout kit; één buis van supergeleidende lijm; één draad aansluitblok connector, zes kleine 2.2 V LEDs (facultatief); één buis van noncorrosive siliconen lijm coating (facultatief); een rol van zwarte elektrische isolatietape; standaard, flexibele, geïsoleerd koperdraad elektrische (0,14 mm2), 2 m lengte (tabel van materialen).</li>
	<li>In de deksel van een 6-well plaat, mark en boor vervolgens twee gaten (met een diameter van ~ 1 mm) wells 25 mm uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes (12 holes in totaal), zoals aangegeven in figuur 1A, B.</li>
	<li>Gesneden twaalf 5 cm lengtes van platina-draad met snijden-tangen. Buig van elk van de draden handmatig in een L-vorm, waardoor één uiteinde 3 cm lang en de andere 2 cm. Snijd de zilver-gecoate draad in twee lengtes van 35 cm.</li>
	<li>Steek de langere (3 cm) gebogen uiteinde van een platina draadje (van binnen naar buiten) in elke geboorde gat, verlaten van 1 – 2 mm uitsteekt aan de buitenkant van het deksel, buigen met behulp van de verlostang. Beveilig de platina draden in de gaten van de deksel met supergeleidende lijm en laat ze drogen voor ongeveer 6 h.</li>
	<li>Soldeer de tips van alle zes platina draden (dat zal later dienen als kathoden, Zie figuur 1A) uitsteken van de deksels op één van de draden zilver gecoat. Herhaal dezelfde procedure, de resterende zes platina draden (die later zal dienen als anoden) solderen met de andere zilver-gecoate draad.<ol>
<li>Voeg LEDs in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrode paren, functionaliteit tijdens de experimenten (optioneel) bevestigen. Plaats een stuk van zwarte isolatietape onder elk geleid om te voorkomen dat bloot van de cellen in de cultuur-platen aan het LED-licht (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lijm de draad aansluitblok connector naar de linker bovenhoek van het 6-well plaat deksel en beide beklede zilver draden sluit aan op de ingangen, zoals afgebeeld in Figuur 1 c.</li>
	<li>Knip een gedeelte van de 20 x 20 mm van de linker bovenhoek van een tweede 6-well plaat deksel (figuur 1B, deksel Nr. 2) aan de klemmenstrook-connector op de eerste klep. Betrekking hebben op de eerste klep, uitgerust met de elektroden, met de tweede deksel en tape ze samen met plakband.<ol>
<li>Gebruik om te verbeteren de hechting van de twee deksels, siliconen lijm coating (optioneel). Om dit te doen, betrekking hebben op het deksel met de zilveren elektroden met een laag van 3 – 5 mm van silicone, lijm en bedek het met de andere deksel, waardoor 12 h voor de lijm drogen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperen draden aan op de ingangen van de uitvoer van de connector van de draad en de andere uiteinden aan banaan mannelijke connectors (4 mm). Opmerking: De lengte van deze draden is afhankelijk van de afstand van de plank in de incubator, waar de cellen zal worden gehouden op de stroomvoorziening, buiten de incubator (Figuur 1 d).</li>
	<li>Aanpassen van de dosering (spanning) en regime van EStim afgeleverd bij de cellen door het reguleren van de DC voeding.<ol>
<li>Schakel de voeding door de ON/OFF -knop op het voorpaneel te drukken. Kanaal 1 activeren door op knop 1te drukken.</li>
		<li>Druk op knop Nr. 4 (V-set) om het instellen van de spanning. Druk op knoppen 2, . en 5 om de output van de belasting vastgesteld op 2,5 V. Druk op Enter.</li>
		<li>Zorgen dat de output van de belasting van 2,5 V (2500 mV) komt overeen met een EStim van 100 mV/mm, volgens de volgende, vereenvoudigde vergelijking. V EStim = <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59127/59127eq1.jpg"> </img>; of V = VEStim × d Hier, V = het netspanningsvoltage uitvoer in millivolts; d = de afstand tussen de elektroden in millimeter; V EStim = de spanning van de stimulatie in millivolts per millimeter. Opmerking: Deze vereenvoudiging geldt alleen in geval van constante gelijkspanning. De weerstand tussen het medium en de cellen is verwaarloosbaar, aangezien elektroden niet in direct contact met de cellen; in plaats daarvan wordt EStim geleverd aan de cellen via het medium.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mesenchymale stamcellen cultuur in osteogenic medium
<ol><li>Kopen en bewaren van verkrijgbare rat MSCs (Zie Tabel van materialen) in vloeibare stikstof tot de dag van het experiment. Als alternatief, isolaat MSCs van andere dieren volgens protocollen gepubliceerd elders7,,8 volgens lokale institutionele regels voor het gebruik van proefdieren.</li>
	<li>Op de dag van het experiment, een flesje (1 x 106 cellen) van MSCs verwijderen uit de opslag van vloeibare stikstof, en snel (binnen 1 min) ontdooien de cellen in een waterbad voorverwarmd tot 37 ° C.<ol>
<li>Onder steriele omstandigheden in een laminaire flow-kap, de inhoud van de flacon Pipetteer in een tube van 50 mL falcon en voeg 9 mL van normale medium (NM) voorverwarmde tot 37 ° C, bestaande uit Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 1 x) met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine oplossing. Pellet de cellen gedurende 5 minuten door centrifugeren op 300 x g.</li>
		<li>In een laminaire flow-kap, verwijder het supernatant en zorgvuldig resuspendeer de pellet cel in 12 mL NM voorverwarmde tot 37 ° C. De geresuspendeerde cellen overbrengen in een T-75 kolf voor de cultuur van de cel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 tot ze een samenvloeiing van 80-90% (na ongeveer 3-5 dagen bereikt).</li>
	<li>Passage van de cellen. Opmerking: Alle bewerkingen met uitzondering van centrifugeren en incubatie onder steriele omstandigheden uitvoeren in een laminaire flow-kap.<ol>
<li>Ophalen na het bereiken van een samenvloeiing van 80-90%, de cellen met cell detachement oplossing. Het kweekmedium cel gecombineerd, wassen 2 x met 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 5 mL 1 x cell detachement oplossing en de cellen terug te keren naar de incubator voor 5 min.</li>
		<li>Zodra de cellen zijn vrijstaand, voeg een gelijke hoeveelheid kweekmedium aan de inactivering van het detachement oplossing. Verzamelen van de cellen in een tube van 50 mL falcon en draaien ze bij 300 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Negeren van het medium en resuspendeer de cellen in 1 mL verse normale voedingsbodem. Het aantal levensvatbare cellen met trypan blauwe vlek te beoordelen.</li>
		<li>Zaad 1 x 106 cellen in een nieuwe T-75 kolf met 12 mL voorverwarmde NM. Cultuur de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 totdat ze een samenvloeiing van 80-90%. Opmerking: Cel passaging (stappen 2.4.1–2.4.4) kan worden herhaald een paar keer totdat het benodigde aantal cellen wordt verkregen. Gebruik geen cellen ouder dan passage 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zaad 9 x 104 cellen in 3 mL NM (10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum, 1% penicilline/streptomycine, DMEM) in elk putje van de plaat van een 6-well cultuur. Incubeer de cellen gedurende 1 dag bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2.</li>
	<li>De volgende dag, gecombineerd kweekmedium en 3 mL osteogenic differentiatie voedingsbodem (OM; normale medium aangevuld met 10-7 M dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate en 0.05 mM ascorbinezuur-2-fosfaat) van toepassing.</li>
	<li>Plaats de 6-well plaat met cellen in de incubator en Incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 5% O2 's nachts.</li>
</ol>3. behandeling van de MSCs met EStim
<ol><li>Op de dag dat de cellen worden behandeld met EStim, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten; vervolgens droog ze onder UV-licht in een veiligheidskast voor een extra 30 min.</li>
	<li>In een laminaire flow-kap, afdekplaat de 6-well met de gekweekte MSCs met het deksel voorzien van de elektroden, ervoor te zorgen dat de elektroden zijn volledig ondergedompeld in medium (indien nodig, toevoegen medium). De overdekte 6-well plaat (EStim kamer) met de cellen overbrengen in de incubator en sluit de kabels aan op netspanning.</li>
	<li>Set de voeding naar 2.5 V uitvoer laden en behandelen van de cellen met EStim voor 1 h3,9.</li>
	<li>Na stimulatie, koppel de voeding los en verwijder de EStim zaal uit de incubator. Onder steriele omstandigheden, wisselen de deksel voorzien van elektroden met een standaard 6-well plaat deksel.</li>
	<li>De cellen terug te keren naar de incubator en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS en vervolgens met 70% ethanol oplossing. Reinig de producten van de geaccumuleerde corrosie van het oppervlak van de elektrode met fijn schuurpapier.</li>
	<li>Herhaal stap 3.1-3.5 voor 6 opeenvolgende dagen. Wijzig op dag 4, alvorens EStim en onder steriele omstandigheden, het kweekmedium door zuigen 1,5 mL van medium en te vervangen met 1,5 mL verse OM. voorverwarmde</li>
	<li>Na het toepassen van EStim gedurende 7 opeenvolgende dagen, gedurende de cellen in de cultuur een extra 7 dagen, uitwisselen van het medium om 3-4 dagen.</li>
</ol>4. osteogenic differentiatie metingen
<ol><li>Cel morfologie wijzigingen onder een microscoop te analyseren.</li>
	<li>Om te beoordelen van het effect van EStim op MSC osteogenic differentiatie, maatregel calcium depositie, alkalische fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie, als beschreven elders3,9.</li>
</ol>

<ol><li>Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Regenerative+Medicine%3A+What+Is+the+Evidence%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%2C+Tissues%2C+Organs%22%5BJournal%5D)">Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence?</a> Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).</li>
<li>Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Bone+Tissue+Engineering+Applications%3A+Current+Status+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Role of Adult Mesenchymal Stem Cells in Bone Tissue Engineering Applications: Current Status and Future Prospects.</a> Tissue Engineering. 11 (5-6), 787-802 (2005).</li>
<li>Mobini, S., Leppik, L., Thottakkattumana Parameswaran, V., Barker, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+direct+current+electrical+stimulation+on+rat+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of direct current electrical stimulation on rat mesenchymal stem cells.</a> PeerJ. 5, e2821(2017).</li>
<li>Leppik, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+electrical+stimulation+and+tissue+engineering+to+treat+large+bone+defects+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model.</a> Scientific Reports. 8 (1), S1(2018).</li>
<li>Song, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocols. 2 (6), 1479-1489 (2007).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+responses+of+two-+and+three-dimensional+engineered+tissues+to+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">A review of the responses of two- and three-dimensional engineered tissues to electric fields.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 18 (3), 167-180 (2012).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Translation%22%5BJournal%5D)">An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 3 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Nau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+vascularized+periosteal+flap+enriched+with+MSC%2FEPCs+for+the+treatment+of+large+bone+defects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered vascularized periosteal flap enriched with MSC/EPCs for the treatment of large bone defects in rats.</a> International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 907-917 (2017).</li>
<li>Eischen-Loges, M., Oliveira, K. M. C., Bhavsar, M. B., Barker, J. H., Leppik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreating+mesenchymal+stem+cells+with+electrical+stimulation+causes+sustained+long-lasting+pro-osteogenic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Pretreating mesenchymal stem cells with electrical stimulation causes sustained long-lasting pro-osteogenic effects.</a> PeerJ. 6, 4959(2018).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, CA. 402-408 (2001).</li>
<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Molecular Biology. 11, 61(2010).</li>
<li>Wang, L., Li, Z. -y, Wang, Y. -p, Wu, Z. -h, Yu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Expression+Profiles+of+Marker+Genes+in+Osteogenic+Differentiation+of+Human+Bone+Marrow-derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Sciences+Journal+%28Chung-kuo+i+hsueh+k%27o+hsueh+tsa+chih%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Expression Profiles of Marker Genes in Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Chinese Medical Sciences Journal (Chung-kuo i hsueh k'o hsueh tsa chih). 30 (2), 108-113 (2015).</li>
<li>Kim, H. B., Ahn, S., Jang, H. J., Sim, S. B., Kim, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+corrosion+behaviors+and+surface+profiles+of+platinum-coated+electrodes+by+electrochemistry+and+complementary+microscopy%3A+biomedical+implications+for+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Evaluation of corrosion behaviors and surface profiles of platinum-coated electrodes by electrochemistry and complementary microscopy: biomedical implications for anticancer therapy.</a> Micron. 38 (7), Oxford, UK. 747-753 (2007).</li>
<li>Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field-induced+migration+and+intercellular+stress+alignment+in+a+collective+epithelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer.</a> Molecular Biology of the Cell. , mbcE18010077(2018).</li>
<li>Tai, G., Tai, M., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrically+stimulated+cell+migration+and+its+contribution+to+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Burns+%26+Trauma%22%5BJournal%5D)">Electrically stimulated cell migration and its contribution to wound healing.</a> Burns & Trauma. 6, 20(2018).</li>
<li>Love, M. R., Palee, S., Chattipakorn, S. C., Chattipakorn, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+electrical+stimulation+on+cell+proliferation+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of electrical stimulation on cell proliferation and apoptosis.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (3), 1860-1876 (2018).</li>
<li>Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+principles+for+measuring+resting+membrane+potential+and+ion+concentration+using+fluorescent+bioelectricity+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">General principles for measuring resting membrane potential and ion concentration using fluorescent bioelectricity reporters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 385-397 (2012).</li>
<li>Jin, G., Li, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrically+conductive+scaffold+as+the+skeleton+of+stem+cell+niche+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Science+%26+Engineering.+C%2C+Materials+for+Biological+Applications%22%5BJournal%5D)">The electrically conductive scaffold as the skeleton of stem cell niche in regenerative medicine.</a> Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 45, 671-681 (2014).</li>
<li>Hronik-Tupaj, M., Rice, W. L., Cronin-Golomb, M., Kaplan, D. L., Georgakoudi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+differentiation+and+stress+response+of+human+mesenchymal+stem+cells+exposed+to+alternating+current+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+Online%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic differentiation and stress response of human mesenchymal stem cells exposed to alternating current electric fields.</a> Biomedical Engineering Online. 10, 9(2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we de bouw van een kamer en een methode voor de behandeling van mesenchymale stamcellen met EStim die tot verbeterde osteogenic differentiatie leidt.
De setup van de EStim gepresenteerd vereist geen speciale apparatuur/kennis en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de biologie/biochemie de cel van de stam van de standaard door junioronderzoekers. Echter wanneer gebouw en met behulp van de zaal EStim, moet speciale zorg men in een paar kritische stappen. Bij de behande...

Een toename van de trauma's en/of ziekte-geïnduceerde bot gebreken worden behandeld met behulp van verschillende combinaties van celtherapie en regeneratieve geneeskunde technologieën. MSCs zijn de cel van keuze in dergelijke behandelingen, vanwege hun relatief hoge osteogenic activiteit, isolatie en uitbreiding efficiëntie en veiligheid1. Wilt maximaliseren van hun osteogenic activiteit en, dus, het optimaliseren van hun therapeutische doeltreffendheid, zijn verschillende methoden om te manipuleren MSCs voorafgaand aan het gebruik ervan in deze behandelingen (zoals herzien door Mauney et al.2) bijgekomen. Een dergelijke methode is EStim, waarvan is aangetoond te verbeteren van MSC osteogenic differentiatie in vitro3 en bot in vivo4genezing te bevorderen. Ondanks het groeiend aantal studies gericht op de behandeling van MSCs met EStim, moet een optimale regime voor het maximaliseren van de EStim pro-osteogenic effect nog worden gedefinieerd.
Andere methoden in vitro met behulp van EStim gebruiken zout bruggen ondergedompeld in het kweekmedium, die cellen van metalen elektroden5scheidt. Het voordeel hiervan is dat de invoering van chemische bijproducten (bijvoorbeeld, corrosie van metalen elektroden) die mogelijk cytotoxisch EStim leveren door middel van zout bruggen elimineert. Ondanks dit voordeel, zout bruggen zijn omslachtig om mee te werken en de EStim zij leveren verschilt van die in geleverde in vivo modellen, waardoor het moeilijk te correleren van resultaten bij het gebruik van de twee systemen. Opstellingen die EStim via metalen of koolstof elektrodes vast binnen de cel cultuur putten leveren simuleren (zoals herzien door Hronik-Tupaj en Kaplan6) beter apparaten die worden gebruikt in vivo; echter, deze apparaten zijn moeilijk te reinigen/steriliseren tussen toepassingen en het aantal cellen die kunnen worden bestudeerd per experiment is beperkt. We ontwierpen de EStim zaal gepresenteerd hier specifiek om aan te pakken van de beperkingen van deze andere opstellingen. Terwijl de meeste van onze ervaring met behulp van deze zaal EStim geweest met 2D en 3D culturen met het beenmerg - en adipeus-weefsel-afgeleide MSCs3,4, een belangrijk voordeel van dit Parlement is dat het is veelzijdig en, met relatief kleine wijzigingen, kunnen worden aangepast aan het bestuderen van andere celtypes onder allerlei verschillende omstandigheden.
Hier beschrijven we de bouw van een EStim vergaderzaal voor de cultuur van de cel; vervolgens tonen wij het gebruik ervan door behandelende MSCs met verschillende regimes van EStim en het meten van het resulterende effect op osteogenic differentiatie. MSC osteogenic differentiatie wordt beoordeeld via afzetting van calcium, alkalisch fosfatase activiteit en osteogenic marker genexpressie. Nog belangrijker is, in verleden experimenten waarmee deze opstelling, we hebben vastgesteld dat deze pro-osteogenic effecten aanhouden lang nadat de EStim behandeling werd gestaakt.

<table><tbody><tr><td>Estim fabricatie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana connector/Jack adapter</td><td>Poppstars</td><td>1008554</td><td>2 stuks</td></tr><tr><td>Snijtang</td><td>Knipex</td><td>78 03 125</td><td></td></tr><tr><td>DC voeding (0-30V/0-3A)</td><td>B&amp;K Precision</td><td>Model 9130B</td><td>Elk vergelijkbaar model kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>Geïsoleerde flexibele draden (0,14 mm2)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>604794, 604093</td><td>2 stuks</td></tr><tr><td>Niet-corrosieve siliconenrubber</td><td>Dow Corning</td><td>3140 RTV</td><td>*kan worden gekocht bij veel winkels</td></tr><tr><td>Platinedraad (999,5/1000; 1mm &oslash;)</td><td>Junker Edelmetalle</td><td>00D-3010</td><td>0,6 m nodig voor 1 Estim-kamer</td></tr><tr><td>70% ethanoloplossing</td><td>alle</td><td></td><td>Sterilisatie van Estim-kamer</td></tr><tr><td>Zilver gecoate koperdraad (0,6 mm &oslash;)</td><td>Conrad Electronic International</td><td>409334 - 62</td><td>&asymp;70 cm nodig voor 1 Estim-apparaat</td></tr><tr><td>Loodboutset</td><td>Conrad Electronic International</td><td>1611410 - 62</td><td>Elk vergelijkbaar model kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>TPP 6-well plaatdeksel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>2 deksels voor Estim-kamer</td></tr><tr><td>2,2V bedrade circulaire LED's</td><td>Conrad Electronic International</td><td>599525 - 62</td><td>6 stuks</td></tr><tr><td>UHU Superlijm</td><td>UHU GmbH &amp; Co. KG</td><td>n/a</td><td>*kan worden gekocht bij veel winkels</td></tr><tr><td>MSC-cultuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerofosfaat dinatriumzout hydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td>osteogene celcultuur</td></tr><tr><td>DMEM, lage glucose, GlutaMAX-supplement, pyruvaat</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>21885025</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>14190144</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>osteogene celcultuur</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>10500064</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>50 ml Falcon-buis</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>L-Ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td>osteogene celcultuur</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>15140122</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rat mesenchymale stamcellen, beenmerg van oorsprong</td><td>Cyagen</td><td>RASMX-01001</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>Celdetacheringsoplossing</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td>A1110501</td><td>celcultuur, celdetachering</td></tr><tr><td>TC Flask, T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911302</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>TPP 6-well platen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707759-126EA</td><td>celcultuur</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Kleur, 0,4% oplossing</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>celtelling</td></tr></tbody></table>

constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen in vitro

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymale stamcellen/stromale cellen (MSCs) zijn uitvoerig gebruikt om bot genezing in weefsel engineering benaderingen te bevorderen. Elektrische stimulatie (EStim) heeft aangetoond dat MSC osteogenic differentiatie in vitro verbeteren en bot genezing in klinische instellingen te bevorderen. Hier beschrijven we de bouw van een EStim kamer voor de cultuur van de cel en het gebruik ervan bij de behandeling van bot-merg-afgeleide MSC ter verbetering van osteogenic differentiatie rat. We vonden dat behandeling van MSCs met EStim voor 7 dagen in een aanzienlijke toename van de osteogenic differentiatie resulteert, en bovenal dit pro-osteogenic effect blijft voortbestaan lang na (7 dagen) EStim wordt stopgezet. Deze aanpak van voorbehandeling MSCs met EStim ter verbetering van osteogenic differentiatie kan worden gebruikt om botweefsel engineering behandeling resultaten te optimaliseren en, dus, helpen hen om hun volledige therapeutische potentieel te bereiken. Naast deze applicatie, kunnen deze EStim cel cultuur kamer en protocol ook worden gebruikt te onderzoeken van andere EStim-gevoelige cel gedrag, zoals migratie, proliferatie, apoptosis en steiger bijlage.

Om te evalueren van het effect van 100 mV/mm EStim op de osteogenic differentiatie van MSCs, cellen EStim behandeld voor 3, werden 7, en 14 dagen of nontreated (control) geanalyseerd op dag 14 van kweken door beoordeling van de morfologische veranderingen en calcium afzetting (Figuur 2 ). Dit werd gedaan door imaging cellen met helder-veld microscopie (morfologie wijzigingen) of door de vaststelling van de cellen in 4% paraformaldehyde oplossing, hen met oplo...

Hier presenteren we een protocol voor de bouw van een cel cultuur kamer ontworpen om bloot cellen tot verschillende soorten elektrische stimulatie, en het gebruik ervan bij de behandeling van mesenchymale stamcellen om osteogenic differentiatie.

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Hier laten we zien hoe je een elektrische stimulatiekamer bouwt met behulp van gemeenschappelijke zes wandkweekplaten, en hoe je deze gebruiken om osteogene differentiatie in mesenchymale stamcellen te stimuleren. Deze kamer is eenvoudig en niet duur om te bouwen, en kan worden hergebruikt in meerdere experimenten. Na voorbehandeling met elektrische stimulatie in onze kamer, kunnen mesenchymale stamcellen worden gebruikt om de resultaten in botweefsel engineering behandelingen te verbeteren.Deze kamer kan ook worden gebruikt om andere celtypen en elektrogevoelig celgedrag te onderzoeken, zoals migratie, proliferatie, veranderingen in het membraanpotentieel, apoptose en zorgvuldige hechting. In een zes put plaat deksel, markeren en vervolgens boren twee een-millimeter diameter gaten, 25 millimeter uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes putten. Knip vervolgens een platina draad in 12 vijf centimeter lange secties.Buig elke sectie van vijf centimeter handmatig in een L-vorm, waardoor het ene uiteinde drie centimeter lang is en de andere twee centimeter lang. Snijd vervolgens de met zilver bedekte draad in twee lengtes van 35 centimeter. Steek het langere gebogen uiteinde van een platina draad in het geboorde gat, waardoor een tot twee millimeter uitsteken van de buitenkant van het deksel.Buig het met tangen. Bevestig daarna de platina draden in de dekselgaten met supergeleidende lijm en laat ze ongeveer zes uur drogen. Om de kathodes voor te bereiden, soldeer de uiteinden van alle zes platina draden die uitsteken van het deksel naar een van de met zilver bedekte draden.Om de anoden voor te bereiden, soldeer de resterende zes platina draden aan andere zilvergecoate draden. Voeg vervolgens LED's toe in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrodeparen om de functionaliteit te bevestigen. Plaats een stuk zwarte isolatietape onder elke LED om te voorkomen dat de cellen in de kweekplaten worden blootgesteld aan LED-licht.Plak vervolgens de draadeindblokconnector in de linkerbovenhoek van het zes-putplaatdeksel en sluit beide met zilver bedekte draden aan op de ingangsterminals. Knip vervolgens een vierkant stuk van 20 bij 20 millimeter uit de linkerbovenhoek van een tweede zes-putplaatdeksel, om de sluitblokconnector op het eerste deksel te huisvesten. Bedek het eerste deksel, uitgerust met de elektroden, met het tweede deksel, en plak ze samen met plakband.Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperdraden aan op de uitgangsterminals van de draadconnector en het andere uiteinde op mannelijke bananenconnectoren. Schakel de voeding in door op de AAN-UIT-knop op het voorpaneel te drukken. Activeer kanaal één door op knop één te drukken.Druk daarna op knop vier om de spanning in te stellen. Stel de belastingsuitvoer in op 2,5 volt. Druk vervolgens op Enter.Op de dag dat de cellen worden behandeld met E-stam, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten. Droog ze vervolgens 30 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast. Bedek in een laminaire stroomkap de zes-put plaat met de gekweekte MSCs met het deksel uitgerust met de elektroden, om ervoor te zorgen dat de elektroden volledig ondergedompeld zijn in het medium.Breng vervolgens de overdekte zes-put plaat met cellen naar de incubator en sluit de draden aan op de voeding. Stel vervolgens de voeding in op een belastingsvermogen van 2,5 volt en behandel de cellen een uur met E-stam. Na stimulatie de voeding loskoppelen en de E-stamkamer uit de couveuse verwijderen.Vervang onder steriele omstandigheden het deksel, voorzien van elektroden, door een standaard zesputte plaatdeksel. Vervolgens, terug de cellen naar de incubator, en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS, en vervolgens met 70% ethanol oplossing.Reinig vervolgens de opgehoopte corrosieproducten van het elektrodeoppervlak met fijn schuurpapier. Herhaal de E-stambehandeling gedurende zes opeenvolgende dagen. Op dag vier, voorafgaand aan het toepassen van elektrische stimulatie, en onder steriele omstandigheden, verander het kweekmedium door 1,5 milliliter medium te aspireren en te vervangen door 1,5 milliliter voorverwarmd, vers osteogeen differentiatiemedium.Na het toepassen van elektrische stimulatie gedurende zeven opeenvolgende dagen, handhaven van de cellen in de cultuur voor een extra zeven dagen, het uitwisselen van het medium om de drie tot vier dagen. Wanneer de behandeling is voltooid, analyseren van de celmorfologie veranderingen onder een microscoop. Om het effect van elektrische stimulatie op MSC osteogene differentiatie te beoordelen, meet calciumdepositie, alkalische fosfatase activiteit, en osteogene marker genexpressie, zoals elders beschreven.Om het effect van 100 millivolt per millimeter elektrische stimulatie op de MSC osteogene differentiatie te evalueren, werden cellen behandeld met elektrische stimulatie gedurende drie, zeven en 14 dagen en niet-behandelde cellen, geanalyseerd op dag 14 van de cultuur door morfologische veranderingen en calciumdepositie te beoordelen. Significante veranderingen in celmorfologie en calciumafzettingen waren zeven en 14 dagen zichtbaar in cellen die met elektrische stimulatie werden behandeld. Een gedetailleerde analyse van osteogene marker genexpressie veranderingen werd uitgevoerd op dag drie, zeven en 14 van de cultuur.Op dag zeven van de cultuur, RunX2 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld met elektrische stimulatie voor zeven dagen. Terwijl colla1 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld voor zeven dagen, gemeten op dag 14 van de cultuur. De expressie van osteopontine werd aanzienlijk verhoogd in elektrisch gestimuleerde cellen op dagen drie, zeven en 14 van de cultuur.Osterix expressie was afwezig in controlecellen op alle tijdstippen, en werd alleen gezien op zeven en 14 dagen van de cultuur in cellen blootgesteld aan elektrische stimulatie. De elektrische stimulatiekamer is relatief eenvoudig te bouwen. Er moet echter speciale aandacht worden genomen bij het hanteren van de platinadraden, en ook bij het reinigen en steriliseren van de elektroden.Cellen die in onze kamer voorbehandeld zijn op elektriciteit, alleen of op een steigermateriaal, kunnen in diermodellen worden geïmplanteerd om te bestuderen hoe het positieve effect van elektrische stimulatie in vitro aanhoudt. Deze techniek biedt een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel om het mechanisme te bestuderen waarmee elektrische stimulatie celfuncties reguleert. Deze kennis kan beschikbaar zijn in regeneratieve geneeskunde cellen.

construction-use-an-electrical-stimulation-chamber-for-enhancing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het is algemeen bekend dat mechanische krachten in het lichaam kan cel differentiatie en proliferatie beïnvloeden. Hier presenteren wij een video-protocol demonstreren het gebruik van een custom-built bioreactor voor het leveren van uniaxiale cyclische rek aan cellen gekweekt op flexibele substraten micropatterned steel.

Mechanische stimulatie van stamcellen Met behulp van Cyclische uniaxiale Strain

This video demonstrates the use of an extracellular matrix-coated microfluidic chip to differentiate neural stem and progenitor cells or NPCs through electrical stimulation. After seeding and adhering to the coated region, NPCs grow, and the application of a direct current  triggers their differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.

Electrical Stimulation-Induced Differentiation of Neural Stem and Progenitor Cells

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een differentiatiepotentieel naar de osteoblastische lijn wanneer ze worden gestimuleerd met oplosbare factoren of specifieke biomaterialen. Dit werk presenteert een nieuwe optie voor de aflevering van MSC's uit menselijk amnionmembraan (AM-hMSC's) die de boviene botmatrix Nukbone (NKB) gebruikt als een scaffold.

Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

Het kweken van menselijke mesenchymale stromale cellen (hMSCs) met autologe serum, vermindert het risico op afwijzing door xenogene materiaal en andere negatieve effecten. Het staat ook voor het herstel van een subset van mesodermale voorlopercellen, die een frisse hMSCs kan leveren. Inbedding hMSCs in een autoloog fibrinestolsel maakt een eenvoudige bediening en effectieve chirurgische implantatie.

Mesenchymale stromale Cell Cultuur en Levering in autologe Voorwaarden: een slimme aanpak voor orthopedische toepassingen

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Dit protocol beschrijft fabricage van een celcultuur dat zaaien van de cellen van de stam op een geleidend polymeer steiger voor in vitro elektrische stimulatie en latere in vivo innesteling van de cel van de stam-geplaatste steiger, met behulp van een minimaal invasieve techniek.

Elektrisch geleidend steiger te moduleren en leveren van stamcellen

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Dit protocol beschrijft het stapsgewijze proces om zowel elektrische als magnetische stimulatoren te bouwen die worden gebruikt om biologische weefsels te stimuleren. Het protocol bevat een richtlijn voor het simuleren van computerkracht en magnetische velden en de vervaardiging van stimulatorapparaten.

Elektrische en magnetische veldapparaten voor stimulatie van biologische weefsels

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

We hebben een oogirritatie test die een driedimensionaal gereconstrueerd menselijk hoornvlies-achtige epitheliale (RHCE) weefsel model maakt gebruik ontwikkeld. De test is in staat onderscheid te maken tussen oculaire irriterende en bijtende stoffen (GHS-categorieën 1 en 2 gecombineerd) en degenen die geen etikettering (GHS geen categorie) vereisen.

Test op oogirritatie (EIT) voor Risico oog irriterende stoffen met gereconstrueerde humane Cornea-achtige Epithelial (RHCE) Tissue Model

Leer hoe u een elektrische stimulatiekamer bouwt voor het verbeteren van osteogene differentiatie in mesenchymale stamcellen. Dit herbruikbare, kosteneffectieve systeem ondersteunt botweefselengineering en elektrogevoelig celgedragsonderzoek.

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro (Video) | JoVE Journal

Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Meer video's verkennen