Constructie en het gebruik van een elektrische stimulatie kamer voor het verbeteren van Osteogenic differentiatie in mesenchymale stamcellen/stromale cellen In Vitro

Hier laten we zien hoe je een elektrische stimulatiekamer bouwt met behulp van gemeenschappelijke zes wandkweekplaten, en hoe je deze gebruiken om osteogene differentiatie in mesenchymale stamcellen te stimuleren. Deze kamer is eenvoudig en niet duur om te bouwen, en kan worden hergebruikt in meerdere experimenten. Na voorbehandeling met elektrische stimulatie in onze kamer, kunnen mesenchymale stamcellen worden gebruikt om de resultaten in botweefsel engineering behandelingen te verbeteren.

Deze kamer kan ook worden gebruikt om andere celtypen en elektrogevoelig celgedrag te onderzoeken, zoals migratie, proliferatie, veranderingen in het membraanpotentieel, apoptose en zorgvuldige hechting. In een zes put plaat deksel, markeren en vervolgens boren twee een-millimeter diameter gaten, 25 millimeter uit elkaar, in de buurt van de buitenste rand van elk van de zes putten. Knip vervolgens een platina draad in 12 vijf centimeter lange secties.

Buig elke sectie van vijf centimeter handmatig in een L-vorm, waardoor het ene uiteinde drie centimeter lang is en de andere twee centimeter lang. Snijd vervolgens de met zilver bedekte draad in twee lengtes van 35 centimeter. Steek het langere gebogen uiteinde van een platina draad in het geboorde gat, waardoor een tot twee millimeter uitsteken van de buitenkant van het deksel.

Buig het met tangen. Bevestig daarna de platina draden in de dekselgaten met supergeleidende lijm en laat ze ongeveer zes uur drogen. Om de kathodes voor te bereiden, soldeer de uiteinden van alle zes platina draden die uitsteken van het deksel naar een van de met zilver bedekte draden.

Om de anoden voor te bereiden, soldeer de resterende zes platina draden aan andere zilvergecoate draden. Voeg vervolgens LED's toe in het circuit tussen elk van de zes anode-kathode platina-elektrodeparen om de functionaliteit te bevestigen. Plaats een stuk zwarte isolatietape onder elke LED om te voorkomen dat de cellen in de kweekplaten worden blootgesteld aan LED-licht.

Plak vervolgens de draadeindblokconnector in de linkerbovenhoek van het zes-putplaatdeksel en sluit beide met zilver bedekte draden aan op de ingangsterminals. Knip vervolgens een vierkant stuk van 20 bij 20 millimeter uit de linkerbovenhoek van een tweede zes-putplaatdeksel, om de sluitblokconnector op het eerste deksel te huisvesten. Bedek het eerste deksel, uitgerust met de elektroden, met het tweede deksel, en plak ze samen met plakband.

Sluit het ene uiteinde van de twee standaard geïsoleerde koperdraden aan op de uitgangsterminals van de draadconnector en het andere uiteinde op mannelijke bananenconnectoren. Schakel de voeding in door op de AAN-UIT-knop op het voorpaneel te drukken. Activeer kanaal één door op knop één te drukken.

Druk daarna op knop vier om de spanning in te stellen. Stel de belastingsuitvoer in op 2,5 volt. Druk vervolgens op Enter.

Op de dag dat de cellen worden behandeld met E-stam, steriliseren de elektroden in 70% ethanol oplossing gedurende 30 minuten. Droog ze vervolgens 30 minuten onder UV-licht in een veiligheidskast. Bedek in een laminaire stroomkap de zes-put plaat met de gekweekte MSCs met het deksel uitgerust met de elektroden, om ervoor te zorgen dat de elektroden volledig ondergedompeld zijn in het medium.

Breng vervolgens de overdekte zes-put plaat met cellen naar de incubator en sluit de draden aan op de voeding. Stel vervolgens de voeding in op een belastingsvermogen van 2,5 volt en behandel de cellen een uur met E-stam. Na stimulatie de voeding loskoppelen en de E-stamkamer uit de couveuse verwijderen.

Vervang onder steriele omstandigheden het deksel, voorzien van elektroden, door een standaard zesputte plaatdeksel. Vervolgens, terug de cellen naar de incubator, en laat ze 's nachts. Reinig de elektroden, eerst met PBS, en vervolgens met 70% ethanol oplossing.

Reinig vervolgens de opgehoopte corrosieproducten van het elektrodeoppervlak met fijn schuurpapier. Herhaal de E-stambehandeling gedurende zes opeenvolgende dagen. Op dag vier, voorafgaand aan het toepassen van elektrische stimulatie, en onder steriele omstandigheden, verander het kweekmedium door 1,5 milliliter medium te aspireren en te vervangen door 1,5 milliliter voorverwarmd, vers osteogeen differentiatiemedium.

Na het toepassen van elektrische stimulatie gedurende zeven opeenvolgende dagen, handhaven van de cellen in de cultuur voor een extra zeven dagen, het uitwisselen van het medium om de drie tot vier dagen. Wanneer de behandeling is voltooid, analyseren van de celmorfologie veranderingen onder een microscoop. Om het effect van elektrische stimulatie op MSC osteogene differentiatie te beoordelen, meet calciumdepositie, alkalische fosfatase activiteit, en osteogene marker genexpressie, zoals elders beschreven.

Om het effect van 100 millivolt per millimeter elektrische stimulatie op de MSC osteogene differentiatie te evalueren, werden cellen behandeld met elektrische stimulatie gedurende drie, zeven en 14 dagen en niet-behandelde cellen, geanalyseerd op dag 14 van de cultuur door morfologische veranderingen en calciumdepositie te beoordelen. Significante veranderingen in celmorfologie en calciumafzettingen waren zeven en 14 dagen zichtbaar in cellen die met elektrische stimulatie werden behandeld. Een gedetailleerde analyse van osteogene marker genexpressie veranderingen werd uitgevoerd op dag drie, zeven en 14 van de cultuur.

Op dag zeven van de cultuur, RunX2 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld met elektrische stimulatie voor zeven dagen. Terwijl colla1 expressie was aanzienlijk hoger in cellen behandeld voor zeven dagen, gemeten op dag 14 van de cultuur. De expressie van osteopontine werd aanzienlijk verhoogd in elektrisch gestimuleerde cellen op dagen drie, zeven en 14 van de cultuur.

Osterix expressie was afwezig in controlecellen op alle tijdstippen, en werd alleen gezien op zeven en 14 dagen van de cultuur in cellen blootgesteld aan elektrische stimulatie. De elektrische stimulatiekamer is relatief eenvoudig te bouwen. Er moet echter speciale aandacht worden genomen bij het hanteren van de platinadraden, en ook bij het reinigen en steriliseren van de elektroden.

Cellen die in onze kamer voorbehandeld zijn op elektriciteit, alleen of op een steigermateriaal, kunnen in diermodellen worden geïmplanteerd om te bestuderen hoe het positieve effect van elektrische stimulatie in vitro aanhoudt. Deze techniek biedt een eenvoudig maar krachtig hulpmiddel om het mechanisme te bestuderen waarmee elektrische stimulatie celfuncties reguleert. Deze kennis kan beschikbaar zijn in regeneratieve geneeskunde cellen.