Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Dit protocol beschrijft een eenvoudig en effectief suppressorscherm om suppressormutaties in mutanten te identificeren die een groeidefect in splijtingsgist hebben. Traditionele mutagenesis methoden gebruiken giftige chemicaliën of UV die meerdere mutaties in een cel kan genereren. Omgekeerd kan dit protocol een enkele suppressor mutant verrijken in individuele cellen zonder mutatie inducerende methoden te gebruiken.

Begin deze procedure met spanningsconstructie en voorbereiding zoals beschreven in het tekstprotocol. Voeg 200 microliter vloeibare media toe aan elke put van een 96-put polystyreen microplaat. Neem met een steriele applicator een kleine hoeveelheid van elk van de bereide kolonies en schorst elke kolonie in afzonderlijke putten die de vloeibare media bevatten.

Neem een lege put voor elke rij op de plaat met 200 microliters van dezelfde media. Stel nu het protocol op de plaatlezer detectie software aangesloten op een geautomatiseerde microplate reader. Stel de temperatuur in op 30 graden Celsius en stel een kinetisch programma in voor 24 uur met een leesfrequentie van twee minuten.

Dit resulteert in 721 totaal leest over een periode van 24 uur per put. Stel het schudden op continue snelle orbitale schudden. Stel de optische reads in om lichtverstrooiing op een golflengte van 600 nanometer te meten om de optische dichtheid te meten en stel het licht in om van onder de plaat af te lezen.

Na 24 uur registreert u de uiteindelijke blanco optische dichtheidsmetingen en gebruikt u de formule in het tekstprotocol om het volume te bepalen dat nodig is om elk van de monsters te verdunnen tot een optische dichtheid van 0,1. Als u het verdunningsvolume wilt verwerken dat vanaf elke experimentele put moet worden gebruikt, exporteert u de gegevens uit de plaatlezersoftware en gebruikt u een spreadsheetsoftware om dezelfde formule als een functie in te voegen. Gebruik elke 24 uur dezelfde media als dag nul om elk van de monsters te verdunnen tot een optische dichtheid van 0,1 met behulp van de formule.

Zorg ervoor dat u de formule gebruikt om alle putten te verdunnen tot een optische dichtheid van 0,1. Dit omvat de putten die kunnen zijn begonnen met het tonen van enig herstel in hun groei defect. Sla alle groeicurven die dagelijks worden gegenereerd.

Let op elke individuele kolonie die een verhoogde groei snelheid beoordeeld door een uiteindelijke optische dichtheid die aanzienlijk hoger is dan de rest van het cohort met dezelfde genetische achtergrond of door een groeicurve die vergelijkbaar is met die van wilde type kolonies toont. Deze test duurt meestal ongeveer zeven tot 14 dagen. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden.

Vanaf de laatste dag van de plaatlezertest hebben sommige vloeibare culturen een merkbaar hersteld groeipercentage, vermoedelijk door het verkrijgen van een suppressormutatie die het fenotype van de ouderlijke mutatie kan verlichten. Om de fenotypisch herstelde culturen op te slaan, breng en meng 250 microliters van vloeibare cultuur naar een cryotube met 250 microliters van 50%glycerol. Flash bevriezen van de cellen in vloeibare stikstof en sla de stammen in min 80 graden Celsius voor onbepaalde tijd.

Om te bevestigen dat de suppressor mutatie is een genetisch erfelijke element, gebruik standaard genetische kruising methoden om uw favoriete mutant P cellen kruisen met uw favoriete mutant S cellen. Wanneer twee haploïde cellen met een gratis paringstype worden gemengd en worden blootgesteld aan stikstofhonger, kunnen ze een zygote genereren dat een tetrad van vier sporen vormt. De ouderlijke genetische materialen zullen scheiden tijdens meiose volgens de regels van de Mendeliaanse genetica.

Na sporulatie kunnen individuele sporen van dezelfde tetraden worden ontleed en vormen vier individuele kolonies zoals verticaal waargenomen op een plaat. Plaats de sporen een voor een op de plaat met behulp van een microneedle. Na dissectie, laat de cellen groeien in een 30 graden Celsius incubator voor een paar dagen totdat kolonies verschijnen.

Als de suppressormutatie een genetisch erfelijk element is, moet dit kruis tetrads opleveren waarin twee kolonies het ziektefenotype van de ouderlijke stam hebben en twee kolonies het herstelgroeipercentage van de suppressorstam hebben. Kies drie kolonies met het suppressorfenotype en drie kolonies met het ouderlijk fenotype van hetzelfde genetische kruis en ga verder met de genomische DNA-extractie en sequencing stappen zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer vervolgens bioinformatica-analyse uit voor de identificatie van de suppressormutaties zoals beschreven in de tekst.

Groeicurven van individuele kolonies werden geregistreerd op het eerste tijdstip en gedurende zes dagen met continue monitoring met behulp van de plaatlezer. Zoals verwacht, wild type kolonies tonen geen merkbare veranderingen in hun groei curven gedurende het experiment. Met name vier kolonies met de elf1 verwijdering achtergrond en een fal1 schrapping kolonie tonen een dramatische verschuiving in de groei van langzaam groeien naar een aantal verschillende niveaus van groei vergelijkbaar met die van wilde type kolonies.

Dramatisch, alle clr6 mutanten tonen een consistente fenotypic herstel groeit in een sneller tempo tegen het einde van de test. Twee van de geïdentificeerde niet-synonieme veranderingen, de cue2 mutatie en de rpl2702 mutatie werden gereconstrueerd in het lab met behulp van standaard protocollen voor site gerichte mutagenesis. Cue2 elf1 dubbele mutanten en rpl2702 elf1 dubbele mutanten werden gekruist met de gratis elf1 verwijdering mutant stam.

Genetische kruising toonde aan dat de geïdentificeerde suppressor mutaties succesvol zijn in het onderdrukken van het langzaam groeiende fenotype van elf1 verwijdering mutant en erfelijk zijn. Tijdens de dagelijkse verdunning van de 96-put plaat is het belangrijk om alle putten tot dezelfde concentratie te verdunnen om kunstmatig groeiherstel te voorkomen. Deze methode maakt het mogelijk de isolatie van suppressor mutaties in een hoge doorvoermanier versnellen van de ontdekking van honderden genen die niet goed zijn gekenmerkt in splijting gist en andere micro-organismen.

Deze methode kan worden gebruikt om suppressors te isoleren voor alle micro-organismen die mutatie veroorzaken groeidefect en die kan worden uitgegroeid tot een grote populatie in vloeibare cultuur. Het identificeren van suppressor mutaties in splijtingsgist kan potentiële implicaties hebben bij het vinden van ziekteverwekkende genen in overlappende paden, vooral als het gaat om sterk geconserveerde trajecten van gist naar de mens.