Kwantitatieve analyse van cellulaire samenstelling in geavanceerde atherosclerotische laesies van de gladde spieren cel Lineage-Tracing muizen

Ons protocol helpt onderzoekers om gestandaardiseerde experimentele pijpleidingen te implementeren voor het uitvoeren van fenotypische karakterisering van vergelijkbare populaties door immunofluorescente kleuring. Met deze techniek kunnen onderzoekers de vergelijkbare samenstelling van complexe ziekteweefsels rigoureus analyseren en kwalitatieve en kwantitatieve analyses uitvoeren van de fenotypes van de celtypen van belang. Het aantonen van de procedure zal Sidney Mahan zijn, een technicus van mijn laboratorium.

Om het dier voor te bereiden op brachiocephalic slagader oogst, snijd het buikvlies tot aan het borstbeen, zorg ervoor dat de buikweefsels niet beschadigen. En maak twee sneden op de mid-oksel lijn door de thorax, oppassen niet te beschadigen het hart en de longen. Snijd vervolgens het middenrif door om het hart gedeeltelijk bloot te stellen.

Om de muis te overmatigen, installeer een zwaartekracht-overfusiesysteem zodanig dat de druk van de overfusievloeistof gelijk is aan de gemiddelde murinebloeddruk om een consistente overvloed en onderhoud van de morfologie van het vat mogelijk te maken. Dan, overvloedig het dier met vijf milliliter kamertemperatuur PBS, 10 milliliter van 4% kamertemperatuur paraformaldehyde, en vijf extra milliliter kamertemperatuur PBS. Sluit een vlindernaal van 23 of 25 meter aan op het zwaartekracht-overmaaksysteem en laat PBS door de naald lopen om de lucht uit de buizen te verdrijven voordat de naald in de linkerventrikel wordt gestoken.

Na het vastzetten van de naald op zijn plaats, gebruik iris schaar om een minder dan twee centimeter incisie te maken in het rechter atrium. Oogst de weefsels van belang in verse 4%paraformaldehyde. Om de brachiocephalic slagader bloot te leggen, gebruik een schaar om een incisie in de middellijn van het borstbeen door het manubrium te maken en gebruik tangen om beide zijden van de ribbenkast te trekken om de borstholte volledig te openen.

Plaats het dier vervolgens onder een ontledenmicroscoop om de halsslagader gedeeltelijk te visualiseren en gebruik fijne pincetten om de spieren, bindweefsel en vet te trekken tot de rechter halsslagader, vlechtslagader, subclavian bifurcatie en aortaboog worden gereinigd en geïsoleerd van het omringende bindweefsel en vet. Gebruik vervolgens tangen om de juiste halsslagader onder zijn splitsing te grijpen en een eerste snede boven de tang te maken. Nog steeds, met de halsslagader, maak een tweede snede door de subclavian slagader en maak de laatste twee bezuinigingen door de aortaboog aan weerszijden van de brachiocephalic slagader.

Verzamel vervolgens andere vaatweefsels van belang en plaats de brachiocephalische slagader en de andere weefsels 's nachts in 4% paraformaldehydeoplossing bij kamertemperatuur. Voor immunofluorescente kleuring van de brachiocephalic slagader, gebruik een microtome om 10 micrometer secties te verkrijgen door de paraffine ingebed weefsel monster totdat het kan worden bevestigd door de lichtmicroscopie dat de aortaboog is doorgesneden en de brachiocephalic slagader zichtbaar is. Pas de oriëntatie van het blok aan totdat het weefsel volledig loodrecht staat op het microtomeblad en verkrijg drie seriële 10 micrometer dikke delen van de brachiocephalic slagader per glazen schuif, totdat de subclavian bifurcatie is bereikt.

Wanneer alle secties zijn verzameld, hydrateren de weefselmonsters onder een chemische kap met twee vijf minuten xyleen onderdompee onderdompeling, gevolgd door een vijf minuten onderdompeling ethanol serie zoals aangegeven, en twee vijf minuten gedeïoniseerde water onderdompees. Vervolgens, incubeer glijbanen in antigeen retrieval oplossing, volgens de standaard protocollen, gevolgd door verwarming in een magnetron gedurende 20 minuten. Na een uur afkoelen bij kamertemperatuur, gebruik een hydrofobe pen om elke weefselsectie te omringen.

En blokkeer elke niet-specifieke binding met blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, etiketteren de weefselmonsters 's nachts op vier graden Celsius met de primaire antilichaam cocktail van belang, of isotype overeenkomen met IgG controle antilichamen. De volgende ochtend, wasg dia's drie keer in PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt, gevolgd door een een uur incubatie in de juiste fluorescentie geconjugeerde secundaire antilichaam cocktail en DAPI voor nucleus visualisatie.

Gebruik vervolgens het montagemedium dat geschikt is voor fluorescentiemicroscopie om coverslips op de dia's te monteren. Voor confocale microscopie beeldvorming van de gelabelde weefselsecties, gebruik secties bevlekt met de IgG-controle en primaire antilichamen om de gevoeligheid, laserkracht en offset van de detector voor elk afzonderlijk kanaal in te stellen. Stel vervolgens de bovenste en onderste posities in voor de z-stack-acquisitie en bepaal de dikte en het aantal stapels dat moet worden afgebeeld.

Wanneer alle afbeeldingen zijn verkregen, opent u de afbeeldingen in ImageJ en opent u het kanaalgereedschap en kleurt u de verschillende kleurkanalen. De kleurkanalen samenvoegen. Alle kanalen moeten zichtbaar worden op dezelfde afbeelding.

Schakel afzonderlijke kleurkanalen in en uit in het deelvenster Kanaalgereedschappen en klik met de rechtermuisknop op het telpictogram om het gereedschap meerdere punten te selecteren. Dubbelklik op het telpictogram om het puntgereedschapspaneel te openen en selecteer het type en de grootte van de items die worden gebruikt om de cellen te tellen. Controleer alles weergeven en schakel het DAPI-kanaal alleen in in het kanaalgereedschap.

Selecteer vervolgens counterkanaal nul en klik op afzonderlijke kernen die moeten worden getagd, waarbij u door de z-stacks bladert om alle kernen te tellen die zijn gekleurd binnen het gebied van belang. Het aantal gekwantificeerde eencellige gebeurtenissen wordt hieronder aangegeven in het puntgereedschapspaneel. Wanneer alle kernen zijn getagd, schakelt u een ander kleurkanaal in en selecteert u tegenkanaal één om de cellen te taggen waarin er een colocalisatie tussen DAPI en de antilichaamvlekken is.

Voor cytoplasma kleuring, selecteer cellen met vlekken rond de kern over de gehele diepte van de kern, het controleren van meerdere z-stacks indien nodig. De resultaten kunnen vervolgens worden uitgedrukt als het aantal cellen tot het totale aantal DAPI-positieve cellen of het aantal cellen per gebied binnen het interessegebied. Immunofluorescente kleuring met antilichamen gericht op fenotypische markers, zoals aangetoond, maakt het mogelijk beelden van elke individuele marker kleuring en differentiële interferentie contrast te verkrijgen voor de afbakening van regio's van belang voor eencellige tellen.

Eencellige tellen om de overvloed van verschillende gladde spiercel-afgeleide populaties te bepalen kan vervolgens worden uitgevoerd met behulp van ImageJ. Bijvoorbeeld, eencellige tellen analyse in de vezelige cap regio van deze representatieve dwarsdoorsnedes bleek opmerkelijke verschillen in de cellulaire samenstelling van de vezelige cap gebied tussen muizen behandeld met anti IL-1 bèta-antilichaam en muizen behandeld met een isotype afgestemd IgG controle. Inderdaad, de remming van IL-1 beta werd geassocieerd met een afname van YFP-positieve gladde spiercellen, en een toename van galectine-3-positieve cellen.

Verder werd een afname van het aantal YFP-positieve gladde spieraorta-alfa actine-positieve gladde spiercellen waargenomen. Terwijl het relatieve aantal gladde spiercel-afgeleide YFP-positieve galectine-3-positieve macrofagen aanzienlijk werd verhoogd op beide brachiocephalic slagader locaties. Met name had de remming van IL-1 bèta geen invloed op het totale aantal osteochondrogene cellen binnen de laesie, of het aandeel van gladde spiercel-afgeleide of macrofaag-afgeleide chondrogene cellen.

Dit protocol is ontworpen om de strengheid en reproduceerbaarheid in atherosclerotische laesieanalyse te verbeteren door het standaardiseren van belangrijke stappen zoals weefselverzameling, verwerking en sectie, evenals het tellen van eencellige cellen. Dit protocol kan worden gebruikt om extra vaatbedden te analyseren die gevoelig zijn voor het presenteren van atherosclerotische laesies, waaronder de aorta en de aortawortel.