Name: Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer een rigoureuze methode voor het isoleren van extracellulaire blaasjes uit weefsel, inclusief hersen- en longtumoren. Deze techniek biedt hoge zuiverheid voor morfologische en immunofenotypische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Richard Nowakowski en de Florida State University laboratorium dier Resources voor de verlening en zorg voor de dieren gebruikt voor het ontwikkelen van dit protocol, met alle respect. Wij danken Liu Xia, Dr. Rakesh Singh en de Florida staat University translationeel Science Laboratory voor hulp met het werk van de Spectrometrie van de massa gebruikt voor downstream vesikel karakterisering, evenals de FSU biologische wetenschap Imaging Resource faciliteit voor het gebruik van het transmissie-elektronenmicroscoop in deze studie. Tot slot bedanken wij Dr. Mandip Sachdeva (Florida A & M University) voor donatie van de specimens van de tumor in de ontwikkeling van deze methode gebruikt. Deze studie werd ondersteund door subsidies van de Florida departement van gezondheid Ed en Ethel Moore Alzheimer's Disease Research Program toegekend aan D.G.M. en J.M.O (6AZ11) en het National Cancer Institute van de National Institutes of Health onder Award nummer R01CA204621 toegekend aan D.G.M.

Hele hersenen werden verkregen met goedkeuring van de institutionele dier gebruik en Care Comité (IACUC) van de Florida State University. Een totaal van twaalf muis hersenen (3 hersenen uit elke leeftijdsgroep: 2, 4, 6 en 8 maanden) van een C57BL/6 J achtergrond werden gebruikt voor EV extractie, als eerder beschreven16. Long tumor exemplaren waren gedoneerd door Dr. Mandip Sachdeva onder goedkeuring van de Florida landbouw- en mechanische IACUC van de Universiteit. Long tumoren zijn afgeleid van de menselijke adenocarcinoom cellijn H1975 geteeld in immunodeficiëntie Balb/c nu/nu naakt muizen. Gegevens uit twee representatieve tumor wordt gerepliceerd, worden gemarkeerd in deze studie.
Opmerking: Een schematisch overzicht van de vesikel isolatie en zuivering methode wordt gegeven in Figuur 1.
1. de weefsels dissociatie en differentiële centrifugeren
<ol><li>10 mL van dissociatie buffer (10 mg papaïne 5.5 mM L-cysteïne 67 µM 2-mercaptoethanol; 1.1 mM EDTA) bereiden in slaapstand-E medium per ongeveer 0,4-1,0 g weefsel. Merk op dat alle oplossingen gebruikt voor EV verrijking en zuivering in ultrazuiver gefilterd water moeten worden verdund.</li>
	<li>Toevoegen hele vers of bevroren weefsel aan dissociatie buffer in een conische tube van 50 mL en broeden in een warm water kan bad bij 37 ° C gedurende 20 min. weefsel worden gesneden in kleinere fragmenten voordat incubatie indien nodig.</li>
	<li>Voeg na de incubatie, protease en phosphatase inhibitors voor de concentratie van een definitieve 1 x aan de dissociatie buffer met het weefsel.</li>
	<li>Giet de oplossing met het weefsel in een los-fit Dounce homogenizer, en zachtjes distantiëren van het weefsel met behulp van ongeveer 30 trage slagen per monster. Het aantal slagen kan worden aangepast op basis van weefsel consistentie.</li>
	<li>Overdracht losgekoppeld weefsel in buffer een conische tube van 50 mL en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C tot pellet van de cellen en de resterende vezelig of samenhangende weefsel fragmenten.</li>
	<li>Het supernatant overbrengen in een schone 50 mL conische buis en centrifuge op 2.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet en negeren grote cellulaire puin.</li>
	<li>Overdracht van het supernatant weer een schone 50 mL conische buis en centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 40 min bij 4 ° C tot pellet ongewenste grotere blaasjes of kleine apoptotic organen. Opmerking: Deze pellet kan worden opgeslagen voor aanvullende studie van grotere blaasjes, indien gewenst.</li>
	<li>Giet het supernatant door een 0,45 µm filter in een schone 12 mL ultracentrifugatie buis. Opmerking: Dichtbevolkte fibrotische weefselsteekproeven kunnen niet gemakkelijk worden gefilterd. Deze monsters kunnen worden gefilterd door een 40 µm cel zeef, vervolgens serieel kleiner naalden (18 G, 20 G 22 G) doorlopen voordat het filteren door middel van het 0,45 µm filter.</li>
	<li>Ultracentrifuge het monster bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot kleine EVs pellet.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren en laat de ultracentrifugatie buizen omgekeerd voor 5-10 min, onttrekken vaak om te verwijderen van de resterende vloeistof op de zijkanten van de buizen. Resterende vloeistof kan ook worden aanzuiging met behulp van een zuigen vacuüm pipet.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet EV in 1,5 mL 0,25 M sacharose buffer (10 mM Tris, pH 7.4). Het is belangrijk om ervoor te zorgen volledige resuspensie van de pellet in deze stap. Om dit te doen, hebben betrekking op de buizen met parafilm voordat vortexing EVs in oplossing. Rock de ultracentrifuge buizen gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur alvorens een definitieve vortex-mix.</li>
	<li>Kort centrifugeren de buizen bij een snelheid niet meer dan 1.000 x g terug te vorderen van de vloeibare suspensie aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Gaat u verder met de stappen van de kleurovergang zuivering of desgewenst opslaan EV schorsing bij 4 ° C's nachts.</li>
</ol>2. dichtheid kleurovergang zuivering
<ol><li>Voeg 1,5 mL 60% iodixanol (stock oplossing in water) aan de 1,5 mL sacharose/Tris buffer met EVW te maken van een definitieve oplossing met 30% iodixanol. Pipetteer omhoog en omlaag meermaals naar Meng oplossing. Voorzichtig om te voorkomen dat verliezen van de oplossing in de pipet tip, zoals de concentratie hoog iodixanol zeer visceuze is.</li>
	<li>Overbrengen met EVs naar de onderkant van een tube van de ultracentrifugatie 5,5 mL bufferoplossing 30% iodixanol.</li>
	<li>Bereiden van ten minste 1,5 mL 20% en 10% iodixanol oplossingen per monster in ultrazuiver water van de stamoplossing van 60% iodixanol.</li>
	<li>1.3 mL 20% iodixanol en zorgvuldig laag bovenop de kleurovergang onderlaag met behulp van een spuit en een naald 18 G te meten. Om te voorkomen dat het mengen van de lagen op het raakvlak van de dichtheid, houden van de schuine kant van de naald in contact met de binnenkant van de buis ultracentrifugatie net boven de meniscus en voeg de oplossing ontkleuring.</li>
	<li>Laag 1.2 mL 10% iodixanol-oplossing op de top van de laag van de 20% iodixanol met gebruikmaking van dezelfde techniek als hierboven.</li>
	<li>Zorgvuldig evenwicht en laadt de ultracentrifugatie buizen in de rotor emmers en centrifuge in de rotor van een swing-emmer bij 268,000 x g gedurende 50 minuten bij 4 ° C. De snelheden van de versnelling en vertraging van de centrifuge ingesteld op de minimale tarieven toegestaan om onderbrekingen van de dichtheid lagen te voorkomen.</li>
	<li>Label tien 1,5 mL microcentrifuge buizen voor elk monster overeen moeten komen met breuken 1 t/m 10 van het verloop van de dichtheid. Deel 1 is aangewezen als het bovenste deel, die zullen worden eerst verwijderd, terwijl de breuk 10 is de Fractie van de bodem laatst verwijderd.</li>
	<li>Zodra de kleurovergang ultracentrifugatie heeft voltooid, zachtjes de buizen uit de rotor emmers verwijderen en plaatsen in een stabiele houder. Een zichtbaar band van blaasjes zal vaak worden gezien in de Fractie van belang. Pipetteer tien seriële breuken van 490 µL vanaf de bovenkant van het verloop in de overeenkomstige buizen. Zal er een kleine hoeveelheid van de vloeistof blijft aan de onderkant van de buis van Eustachius waarschijnlijk contaminerende eiwitten bevat. In dit voorbeeld kan worden verwijderd of behouden als breuk 11 indien gewenst.</li>
	<li>Het meten van de brekingsindices van fracties met behulp van een refractometer. Dit kan ook worden uitgevoerd met een verloop van de controle parallel lopen als monster instandhouding nodig is. Pipetteer 20-30 µL van elke breuk met iodixanol op het oppervlak van de refractometer, en de dichtheid te schatten door het vergelijken van de brekingsindices aan bekende iodixanol dichtheden. Opmerking dat breuken kunnen worden opgeslagen 's nachts in de iodixanol-bevattende oplossing indien nodig voordat u verdergaat met de volgende ultracentrifugatie wassen stap.</li>
	<li>Elke fractie overbrengen in een schone 12 mL ultracentrifugatie buis. Voeg 5 mL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM nb2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) om de buis en mengeling door pipetteren langzaam op en neer. Opmerking: PBS toegevoegd aan de monsters mag deeltje-vrij, gewaarborgd door steriel PBS door een 0,22 µm filter filteren en opslaan bij kamertemperatuur te vermijden van zout neerslag.</li>
	<li>Voeg een extra 6 mL 1 x PBS toe aan de kop en opnieuw meng zorgvuldig.</li>
	<li>Ultracentrifuge de buizen bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 ° C tot de pellet opnieuw kleine blaasjes. De bovendrijvende vloeistof decanteren en tik op de buizen droog zijn voordat de lysis van blaasjes voor eiwit analyse (stap 3) of resuspensie van het EVW voor morfologische analyse (stap 5).</li>
</ol>3. lysis en Immunoblot bevestiging van EV eiwitten
Opmerking: Als behoud van hele blaasjes voor Morfologische karakterisering of biologische activiteit wordt gewenst, kunnen onderzoekers gaan rechtstreeks naar stap 5. In de eerste experimenten, of vóór de analyse van de Spectrometrie van de massa, moeten alle fracties hersteld door immunoblot te bevestigen van breuken met EV eiwitten worden geanalyseerd.
<ol><li>Om lyse EVs voor eiwit analyse, voeg toe 40 µL van sterke lysis buffer (5% SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 2,5% 2-mercaptoethanol, 8 M ureum) met de toevoeging van de proteaseinhibitor aan EV pellet in ultracentrifuge buis. Opmerking: Desgewenst niet-reducerende omstandigheden zijn voor de opsporing van antilichamen van proteïnen, vervang ultrazuiver water voor 2-mercaptoethanol in de sterke lysis-buffermengsel.</li>
	<li>Zorgen voor volledige resuspensie van pellet en lysis van het EVW in de buffer door parafilm plaatsen over de ultracentrifugatie tube, vortexing krachtig, vervolgens schommelen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur alvorens een definitieve vortex.</li>
	<li>Kort centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 30-60 s om de gehele steekproef-volume te herstellen. Overdracht van het monster een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis en opslag bij-20 ° C tot-80 ° C totdat zij worden verwerkt.</li>
	<li>Ter voorbereiding van gezuiverde lysates immunoblot p.a., voeg toe 5 x Laemmli monster buffer (10% SDS, 250 mM Tris pH 6.8, 1 mg/mL bromophenol blauw, 0.5 M DTT, 50% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol) aan de monsters voor een eindconcentratie van 1 x. Opmerking: Als niet-reducerende omstandigheden gewenst zijn, vervangen door de DTT en 2-mercaptoethanol ultrazuiver water.</li>
	<li>Als hele weefsel homogenaat besturingselementen gewenst zijn, lyse het weefsel in de ureum-bevattende sterke lysis-buffermengsel met proteaseinhibitor hierboven is uiteengezet, vervolgens Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 10 minuten om te verwerpen van de resterende extracellulaire matrix, hele cellen, of intact cellulaire puin. 5 x Laemmli monster buffer aan het homogenaat weefsel voor een eindconcentratie van 1 x toevoegen.</li>
	<li>Kook de buffer van de steekproef met EV of weefsel homogenaat monsters bij 95 ° C gedurende 5-10 min, dan laden gelijk volume (van het equivalent van 0,1-0,3 g weefsel grondstof; 1-2 µg gezuiverde EV eiwit) van breuken 1-10 in een 10% SDS-pagina gel. Gelijke massa van weefsel homogenaat laden. Grotere hoeveelheid monsters kan nodig zijn voor de detectie door minder gevoelig antilichamen.</li>
	<li>Doorgaan met de gelelektroforese van het en westelijke vlekkenanalyse als eerder gedetailleerde21 te bevestigen EV eiwitten in de gezuiverde lysates en relatieve EV overvloed in breuken vergelijken. Opmerking: Zodra EV eiwit reproducibly is aangetoond in consistente breuken, kan het wassen van de definitieve ultracentrifugatie beschreven in stap 2.12 beperkt worden tot kleurovergang breuken van belang.</li>
</ol>4. EV eiwit kwantificering
<ol><li>Gebruik een wasmiddel - en ureum-compatibele fluorescentie gebaseerde assay desgewenst gevoelige kwantificering van EV eiwitten is voor verdere analyse (Zie Tabel van materialen). Merk op dat sommige fluorescentie gebaseerde testen verenigbaar met de bromophenol blauw in Laemmli monster buffer zijn, vergemakkelijking van directe lysis van de EV-pellet (in stap 2.12) in deze buffer als voorkeur aanwezig.</li>
	<li>Als de bovengenoemde fluorescentie gebaseerde eiwit kwantificering kit wordt gebruikt, plek 1 µL van het monster of standaard in ten minste dupliceren op de meegeleverde filterpapier en verder eiwit kwantificering volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>5. karakterisering van EV morfologie
<ol><li>Om te onderzoeken hele blaasjes nadat de definitieve centrifugeren wassen in stap 2.12, grondig resuspendeer EV pellet in PBS deeltje-gratis 1 x. Winkel EVs bij 4 ° C niet langer dan één week totdat zij verwerkt om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien. Opmerking: Het is gunstig voor het eerder breuken consequent verrijkt EV eiwit bevattende door immunoblot analyse te beperken van morfologische analyses naar breuken van belang hebben bevestigd.</li>
	<li>Nanoparticle tracking analyse op hele EV monsters om te bepalen van de concentratie en de grootte van blaasjes in preparaten als eerder gedetailleerde22uitvoeren</li>
	<li>Karakteriseren EV morfologie en grootte metingen bevestigen door elektronenmicroscopie van blaasjes, indien gewenst. EM rasters kunnen bereid worden uit vesikel schorsingen na stap 5.123, of als alternatief kunnen worden verwerkt als blok voorbereidingen24 van pellets na stap 2.12.</li>
</ol>6. in-gel reiniging en de spijsvertering van de trypsine massaspectrometrie p.a.
<ol><li>Als karakterisering van EV proteomes door massaspectrometrie gewenst is, laadt u gelijke massa (ten minste 10 µg eiwit) van breuken met EVW in een voorgegoten polyacrylamidegel te scheiden en zuiveren van eiwitten. Fabrikant kopen voorgegoten gels zijn voorkeur om de niveaus van potentieel verontreinigende eiwitten (bijvoorbeeld keratine) wordt ingevoerd in de monsters.</li>
	<li>Het monster ten minste 0,5 inch tegenkomen het polyacrylamidegel voor EiwitReiniging, dan vast en vlekken met Coomassie kleurstof, zoals eerder beschreven in detail25.</li>
	<li>Snijd de rijstroken in 1 mm3 kubussen voor de spijsvertering van de trypsine, als eerder gedetailleerde19,26.</li>
	<li>5 µL van verteerd peptide monster in LC-MS/MS instrument voor scheiding op de analytische kolom en de daaropvolgende analyse door massaspectrometrie volgens parameters die zijn opgegeven in detail16laden.</li>
</ol>

<ol><li>Bobrie, A., Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion%3A+molecular+mechanisms+and+roles+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion: molecular mechanisms and roles in immune responses.</a> Traffic. 12 (12), 1659-1668 (2011).</li>
<li>Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li>
<li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+the+Pathology+of+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Exosomes in the Pathology of Neurodegenerative Diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li>
<li>Sardar Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+pathology+propagation+by+exosomes+containing+toxic+amyloid-beta+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease pathology propagation by exosomes containing toxic amyloid-beta oligomers.</a> Acta Neuropathologica. 136 (1), 41-56 (2018).</li>
<li>Meckes, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and viral infection.</a> Journal of Virology. 85 (24), 12844-12854 (2011).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+communication+goes+viral%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Exosomal communication goes viral.</a> Journal of Virology. 89 (10), 5200-5203 (2015).</li>
<li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+in+cancer%3A+small+particle%2C+big+player%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematology+Oncology%22%5BJournal%5D)">Exosomes in cancer: small particle, big player.</a> Journal of Hematology Oncology. 8, 83(2015).</li>
<li>Janas, A. M., Sapoń, K., Janas, T., Stowell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+neural+cells+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes and other extracellular vesicles in neural cells and neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1858 (6), 1139-1151 (2016).</li>
<li>Chahar, H. S., Bao, X., Casola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+Their+Role+in+the+Life+Cycle+and+Pathogenesis+of+RNA+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Exosomes and Their Role in the Life Cycle and Pathogenesis of RNA Viruses.</a> Viruses. 7 (6), 3204-3225 (2015).</li>
<li>Pegtel, D. M., Peferoen, L., Amor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+modulators+of+cell-to-cell+communication+in+the+healthy+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as modulators of cell-to-cell communication in the healthy and diseased brain.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Raposo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).</li>
<li>Katsiougiannis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles%3A+Evolving+Contributors+in+Autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Forum+on+immunopathological+diseases+and+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles: Evolving Contributors in Autoimmunity.</a> Forum on immunopathological diseases and therapeutics. 6 (3-4), 163-170 (2015).</li>
<li>Costa-Silva, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+exosomes+initiate+pre-metastatic+niche+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver.</a> Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+enrichment+of+whole+brain-derived+extracellular+vesicles+reveals+insight+into+neurodegenerative+processes+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 210-220 (2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Perez-Gonzalez, R., Gauthier, S. A., Kumar, A., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exosome+secretory+pathway+transports+amyloid+precursor+protein+carboxyl-terminal+fragments+from+the+cell+into+the+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The exosome secretory pathway transports amyloid precursor protein carboxyl-terminal fragments from the cell into the brain extracellular space.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (51), 43108-43115 (2012).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Adaptable+Polyethylene+Glycol-Based+Workflow+for+Proteomic+Analysis+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Adaptable Polyethylene Glycol-Based Workflow for Proteomic Analysis of Extracellular Vesicles.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 303-317 (2017).</li>
<li>Vella, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rigorous+method+to+enrich+for+exosomes+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD63+Regulates+Epstein-Barr+Virus+LMP1+Exosomal+Packaging%2C+Enhancement+of+Vesicle+Production%2C+and+Noncanonical+NF-.%CE%BAB+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">CD63 Regulates Epstein-Barr Virus LMP1 Exosomal Packaging, Enhancement of Vesicle Production, and Noncanonical NF-.κB Signaling.</a> Journal of Virology. 91 (5), (2017).</li>
<li>Hurwitz, S. N., Conlon, M. M., Rider, M. A., Brownstein, N. C., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+analysis+sheds+budding+insights+into+genetic+drivers+of+extracellular+vesicle+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle analysis sheds budding insights into genetic drivers of extracellular vesicle biogenesis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 31295(2016).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3037(2012).</li>
<li>Jung, M. K., Mun, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+and+Imaging+of+Exosomes+by+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), (2018).</li>
<li>Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+combined+with+mass+spectrometry+to+identify+herpes+simplex+virus+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity purification combined with mass spectrometry to identify herpes simplex virus protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1144, 209-222 (2014).</li>
<li>Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExtraPEG%3A+A+Polyethylene+Glycol-Based+Method+for+Enrichment+of+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles.</a> Scientific Reports. 6, 23978(2016).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180(2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
<li>Zijlstra, A., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters+in+nanoscale+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Size matters in nanoscale communication.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 228-230 (2018).</li>
<li>Meehan, B., Rak, J., Di Vizio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncosomes+-+large+and+small%3A+what+are+they%2C+where+they+came+from%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Oncosomes - large and small: what are they, where they came from.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 33109(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Veel wetenschappelijke belang is gegenereerd met betrekking tot de rollen die kleine EVs in de communicatie van de tumor, evenals in de ontwikkeling van het orgel, rijping en functie spelen. Over het geheel genomen, deze studie biedt een geoptimaliseerde workflow voor de winning van intact EVs uit hele hersenen of tumor exemplaren. Terwijl wij hier gewoon de toepasselijkheid van deze techniek aan longkanker tumor afkomstige EVs tonen, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor werk aan andere stevige weefsels, bi...

Kleine extracellulaire blaasjes (EVs) omvatten endosomal afkomstige exosomes en kleine membraan-loods microvesicles die brede biomedische aanbelangen. Kleine EVs zijn samengesteld uit een heterogene populatie van 50-250 nm membraan-gebonden blaasjes met biologisch actieve eiwitten, lipiden en nucleïnezuren die gezamenlijk worden verondersteld een belangrijke rol spelen in een veelheid van ziekteprocessen. Bevordering van onderzoek is met name betrokken deze blaasjes in neurodegeneratieve en prion aandoeningen, besmettelijke processen, auto-immune of inflammatoire voorwaarden, en tumorgroei en uitzaaiing1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. parallel belang bij de ontwikkeling van reproduceerbaar en rigoureuze methoden voor de isolatie en zuivering van deze blaasjes snel groeiende biomedisch onderzoek in de betekenis van het EVW in de pathogenese van de ziekte heeft gegenereerd.
Een historische en actuele uitdaging in EV karakterisering is het onvermogen om volledig aparte kleine EV subpopulaties. Deze uitdaging is grotendeels te wijten aan ons beperkte begrip van de verschillende moleculaire mechanismen inzake de biogenese van verschillende blaasjes. Overlappende omvang, dichtheid en biologische lading tussen subpopulaties verder windingen dit onderscheid. Een deel van deze uitdaging is ook het gebruik van de wijd uiteenlopende verrijking technieken, verstrekken van inconsistentie in downstream analyse van geïsoleerde blaasjes in laboratoria en ondermijning van de wereldwijde inspanningen voor het verlichten van de categorische EV populaties.
Het is vermeldenswaard dat de meerderheid van de karakterisering van het EV uit in vitro collectie van celkweek supernatant, werd uitgevoerd met recentere in vivo onderzoek met een beschrijving van technieken om te isoleren van de blaasjes van menselijke of dierlijke lichaam vloeistoffen, met inbegrip van plasma, urine , en speeksel. Terwijl EVs aanwezig in grote hoeveelheden in omloop zijn, is het ook erkend dat deze blaasjes spelen een belangrijke rol in de cel-naar-cel communicatie evenementen en aanwezig zijn in het interstitium van cellulaire weefsels. In het kader van kanker, kunnen interstitiële EVs worden met name van belang bij het moduleren van de tumor communicatie voor kankercel zaaien en metastatische groei14,15. Bijgevolg is er waarde in de ontwikkeling en de optimalisatie van technieken om de blaasjes uittreksel uit solide weefsel monsters. Deze methoden zullen een manier bieden waarmee zij rechtstreeks studie orgel - of tumor afkomstige EVs geoogst van klinische specimens, met inbegrip van kleine biopsieën en orgel van de gedeeltelijke of volledige resections.
In deze studie, en in een vorig rapport gepubliceerd door onze laboratorium16, wij streven ernaar te houden met verschillende belangrijke huidige problemen in EV verrijking methodologie: 1) om een reproduceerbare techniek om te isoleren en zuiveren van EVs volgens de hoogste normen momenteel te beschrijven geaccepteerd in het veld; 2) om te proberen om te isoleren van kleine EV subpopulaties hoogverrijkt in endosomal-afgeleide exosomes; en 3) om een protocol voor de winning van deze blaasjes uit solide weefsel monsters met het oog op verdere karakterisering.
Onlangs, Kowal en collega's beschreven een relatief kleinschalige iodixanol dichtheid verloop om te scheiden en zuiveren van EV subpopulaties met grotere werkzaamheid dan vergelijkbare sacharose dichtheid verlopen17. In de aangehaalde studie, werden dendritische cel-afgeleide EVs gevangen in een relatief lichte dichtheid Fractie, overeenstemming met een dichtheid van 1.1 g/mL, hoogverrijkt in endosomal eiwitten beschouwd als meest consistente met een groot aantal exosomes aanwezig in dit breuk. Volgens de auteurs opgenomen deze eiwitten "bonafide" exosomal tumor gevoeligheid gene 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 en verschillende annexin eiwitten17. Wij later deze techniek om te slagen voor een methode van weefsel dissociatie beschreven door Perez-Gonzalez et al.18 en een daaropvolgende differentiële centrifugeren protocol te isoleren van de hele hersenen-afgeleide EVs16aangepast. We toonden ook aan het nut van deze methode in het karakteriseren van EV proteomes door het combineren van een sequentiële protocol voor downstream kwantitatieve en vergelijkende massaspectrometrie van vesiculaire eiwit, beschreven door onze laboratorium-19. Dit werk parallel die van het laboratorium van de heuvel, waarin EVs van de frontale cortex van de hersenen20werden verrijkt.
In deze studie, wij ingaan op deze techniek en verlenging van het protocol onlangs gepubliceerd van onze laboratorium aan het isolement van het EVW van solide Long tumoren. Om onze kennis is dit de eerste studie om te beschrijven een protocol om te verrijken EVs van ex vivo tumor exemplaren. Gezien de grote belangstelling in EVW als nieuwe diagnostische biomarkers en hun rol in de tumorigenesis, zal deze methode waarschijnlijk waardevol voor een toenemend aantal wetenschappelijke onderzoekers blijken. Vanuit het oogpunt van klinische kon interstitiële EVs haven grote diagnostische waarde, met name in specimens waar histologische evaluatie beperkt is. Onze hoop is dat de hier geschetste methode voor een basis voor een reproduceerbare techniek om te oogsten EVs uit vers of bevroren dier of mens chirurgische monsters zorgen zal, de weg vrijmaakt voor toekomstige werkzaamheden aan het licht brengen de belangrijke rol in de pathogenese van de ziekte deze kleine blaasjes kunnen spelen.

<table><tbody><tr><td>0.45 &micro;m filter</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 mL ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>5.5 mL ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>anti-Alix antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>anti-Calnexin antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD63 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD81 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flotillin 2 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>anti-HSC70 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>anti-Syntenin-1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>anti-TSG101 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ protein quantification kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 rotor&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Electron Microscope</td><td>TSS Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>goat anti-rabbit IgG (Fab fragment)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>HALT phosphatase inhibitor (100x solution)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>HALT protease inhibitor (100x solution)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 swinging-bucket rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Benchtop Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100 ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>60% iodixanol in steriele wateroplossing</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Mass Spectrometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-mouse IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (refractometer)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Tabletop 5804R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Circulerende en interstitiële kleine membraan-gebonden extracellulaire blaasjes (EVs) vertegenwoordigen veelbelovende doelstellingen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of voorspellende biomarker tests en waarschijnlijk fungeren als belangrijke spelers in de progressie van een groot spectrum van ziekten. Huidige onderzoek is gericht op de karakterisatie van blaasjes uitgescheiden door meerdere cel en weefseltypes (HLA) om beter begrijpen van de rol van het EVW in de pathogenese van voorwaarden waaronder neurodegeneratie, ontsteking en kanker. Wereldwijd consistente en reproduceerbare technieken te isoleren en te zuiveren van blaasjes blijven echter aan de gang. Methoden voor de winning van EVs uit solide weefsel ex vivo zijn bovendien nauwelijks beschreven. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het extraheren van kleine EVs van belang heel vers of bevroren weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor specimens, voor verdere karakterisering. We tonen het aanpassingsvermogen van deze methode voor meerdere stroomafwaartse analyses, met inbegrip van elektronenmicroscopie en immunophenotypic karakterisering van blaasjes, alsmede kwantitatieve massaspectrometrie van EV eiwitten.

Een schematisch overzicht van de weefsel dissociatie, differentiële centrifugeren en kleurovergang zuivering van blaasjes is weergegeven in Figuur 1. De morfologische en immunophenotypic bevestiging van het EVW verloop-gezuiverd wordt gemarkeerd in Figuur 2. Een diagram van reproduceerbare dichtheden na ultracentrifugatie van de helling van de iodixanol 10-30% wordt weergegeven, met twee verschillende vesikel populaties migreren ...

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Dit protocol biedt een rigoureuze en reproduceerbare techniek voor extractie en isolatie van kleine extracellulaire vikjes uit hele weefselmonsters voor downstream ex-vivo analyses. Met een van de hoogste niveaus van zuiverheid momenteel haalbaar, deze methode vergemakkelijkt de directe morfologische, immunophenotypische, en diepe karakterisering van interstitiële sicles uitgescheiden in verschillende weefselmonsters, met inbegrip van tumoren. Hier tonen we de isolatie van weefsel-EV's van hersen- en longtumormonsters.Echter, deze techniek kan worden toegepast op studies met behulp van diverse, goedaardige, of andere tumor exemplaren ook. Om te beginnen, bereid 10 milliliter dissociatiebuffer in Hibernate-E medium voor elke 0,4 tot 1,0 gram weefsel. Voeg geheel vers of bevroren weefsel aan de buffer in een 50 milliliter buis, en incubeer in een warm water bad op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.Voeg hierna protease- en fosforremmers toe voor een laatste 1xconcentratie in de dissociatiebuffer. Giet de oplossing met het weefsel in een losse pasvorm downs homogenizer. Gebruik ongeveer 30 langzame slagen per monster om het weefsel voorzichtig te scheiden.Breng vervolgens het gescheiden weefsel en de bufferoplossing over op een conische buis van 50 milliliter. Centrifuge op 500x g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen en de resterende vezels of samenhangende weefselfragmenten pellet. Breng de supernatant naar een schone 50 milliliter conische buis, en centrifuge op 2, 000x g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten te pelleteren en gooi de grote cellulaire puin.Breng deze supernatant over op een schone conische buis van 50 milliliter en centrifuge op 10,000x g en bij vier graden Celsius gedurende 40 minuten om ongewenste grotere milsicles of kleine apoptotische lichamen te pelleteren. Decanteer de supernatant door een 0,45 micrometer filter in een schone 12 milliliter ultracentrifugatiebuis. Vervolgens ultracentrifuge het monster op 100, 000x g en op vier graden Celsius gedurende twee uur, om kleine EV's pellet.Decanteer de supernatant en laat de ultracentrifugatiebuizen vijf tot tien minuten omgekeerd, waarbij vaak wordt getapt om eventuele restvloeistof aan de zijkanten van de buizen te verwijderen. Dan, resuspend de EV pellet in 1,5 milliliter van 0,25 molaire sacharose buffer. Bedek de buizen met Parafilm, en dan vortex de EV's in oplossing.Rock de ultracentrifugebuizen 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur. En dan nog een keer vortex. De buizen kort centrifugeren met een snelheid van minder dan 1,000x g om de vloeibare suspensie aan de onderkant van de buis terug te krijgen.Bewaar indien nodig de vering 's nachts op vier graden Celsius. Voeg eerst 1,5 milliliter 60%iodixanol toe aan de 1,5 milliliter van de sacharose tris buffer die de EV's bevat om een definitieve oplossing te creëren die 30%iodixanol bevat. Pipet meerdere malen op en neer om de oplossing grondig te mengen.Breng deze oplossing naar de bodem van een 5,5 milliliter ultracentrifugatiebuis. Meng vervolgens de 60%iodixanol voorraad met ultra zuiver water om ten minste 1,5 milliliter van zowel een 20% als een 10%iodixanol oplossing voor te bereiden. Met behulp van een spuit en een 18-meter naald meet je 1,3 milliliter van de 20%iodixanol-oplossing en leg je deze voorzichtig op de onderste helling.Houd de schuine kant van de naald in contact met de binnenkant van de buis, net boven de meniscus en voeg de oplossing drop verstandig om te voorkomen dat het mengen van de lagen op de dichtheid interface. Dan, laag 1,2 milliliter van de 10%iodixanol oplossing op de top van de 20%-laag, met behulp van dezelfde techniek. Breng de ultracentrifugatiebuizen zorgvuldig in balans en laad in rotoremmers.Stel de acceleratie- en vertragingssnelheden van een zwenkbakrotor in op de minimale snelheden en zet 50 minuten op 268, 000x g en op vier graden Celsius. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, label 10 1,5 milliliter microcentrifuge buizen voor elk monster dat zal overeenkomen met fracties een tot en met 10 van de dichtheid gradiënt. Zodra de centrifugatie is voltooid, verwijder voorzichtig de buizen uit de rotoremmers en plaats ze in een stabiele houder.Pipette 10 seriële fracties van 490 microliters vanaf de bovenkant van het verloop in de overeenkomstige buizen. Met behulp van een refractometer meet u de brekingsindexen van de breuken. Breng vervolgens elke fractie over naar een schone ultracentrifugatiebuis van 12 milliliter.Voeg vijf milliliter 1x PBS toe aan elke buis en pipet langzaam op en neer om te mengen. Voeg nog eens zes milliliter 1x PBS toe aan de bovenkant van de buis en meng voorzichtig opnieuw. Ultracentrifuge de buizen op 100, 000x g en bij vier graden Celsius om de kleine adergels opnieuw te pelleteren.Decanteer de supernatant en tik de buizen droog voordat de vesicles worden gelysing voor eiwitanalyse of de EV's opnieuw in gebruik worden gehouden voor morfologische analyse. Om de EV's voor eiwitanalyse te lyse, voeg 40 microliter sterke lysisbuffer met proteaseremmer toe aan de EV-pellets. Plaats Parafilm over elke buis, en vortex krachtig.Vervolgens, rock de buizen voor 20 minuten op kamertemperatuur en vortex weer. Het monster gedurende 30 tot 60 seconden kort centrifugeren op 1, 000x g om het volledige monstervolume te herstellen. Breng elk monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar het op een temperatuur tussen de 20 en 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor verdere verwerking.Om de gezuiverde lysaten voor te bereiden op immunoblot-analyse, voegt u 5x Laemmli monsterbuffer toe aan de monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1x. Kook het monster op 95 graden celsius gedurende vijf tot 10 minuten. Laad vervolgens een gelijk volume van fracties één tot en met 10 in een 10%SDS-paginagel.Laad een gelijke massa weefselhomogenaat. Voer elektroforese en westerse vlekanalyse uit om EV-eiwitten in de gezuiverde lysates te bevestigen en relatieve EV-overvloed in fracties te vergelijken. In deze studie worden extracellulaire akelige akelige akeligheden geëxtraheerd en gezuiverd uit hele weefsel.Na ultracentrifugatie van de 10 tot 30% iodixanol gradiënt, een populatie van lichte EV's kan worden gezien migreren tot fractie twee, terwijl een populatie van dichte EV's kan worden gezien migreren tot fractie vijf, afhankelijk van het weefsel type. Representatieve immunoblots van de gradiëntfracties vertonen de efficiënte scheiding en zuivering van kleine tumor afgeleide EV's in fractie vijf. Met name longtumor exemplaren lijken verrijkt in dichte EV's in vergelijking met lichte EV's die eerder werden geoogst uit hele hersenweefsel.Representatieve nanodeeltjes tracking analyse en elektronenmicroscopie van weefsel-afgeleide blaasjes in de overheersende blaasjes bevattende fractie tonen de verrijking en het behoud van hele blaasjes. In overeenstemming met de bekende grootte en structuur van kleine EV's. Interstitiële EV's vertegenwoordigen veelbelovende doelen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of prognostische biomarkertesten.Deze techniek biedt onderzoekers tools voor de extractie en zuivering van vesicles voor downstream utility. Na extractie van hele of lysed weefsel-EV's kan een brede karakterisering van vesicles worden uitgevoerd, waaronder proteomische, genomische en lipidomische analyses. Bovendien kunnen monsters worden gebruikt voor meer gerichte benaderingen.Vesicles die rechtstreeks uit weefselmonsters zijn geïsoleerd, kunnen verder inzicht geven in ziektemechanismen, waaronder tumorverwekkende ontstaan, en kunnen in de toekomst belangrijke diagnostische of prognostische hulpmiddelen bieden.

extraction-of-extracellular-vesicles-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video describes the technique of extracting extracellular vesicles from fresh or frozen tissues. The isolated extracellular vesicles can be used for further analysis to uncover their significant roles in disease pathogenesis.

Extracellular Vesicle Extraction: A Technique to Isolate Extracellular Vesicles from Whole Tissue Specimens Using Differential Centrifugation

This video demonstrates the density gradient ultracentrifugation-based purification method to isolate subpopulations of extracellular vesicles suitable for characterization studies.

Purification of Subpopulations of Extracellular Vesicles: A Technique to Purify Subpopulations of Extracellular Vesicles Using Density Gradient Ultracentrifugation

Dit is een protocol om weefsel extracellulaire blaasjes (EVs) te isoleren van de lever. Het protocol beschrijft een proces in twee stappen waarbij Collagenase perfusie gevolgd door differentiële ultracentrifugatie om leverweefsel EVs te isoleren.

Isolatie van weefsel extracellulaire vesicles uit de lever

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Het protocol hier toont aan dat extracellulaire blaasjes adequaat kunnen worden gescheiden van geconditioneerde celkweekmedia met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie.

Grootte-uitsluitingschromatografie voor het scheiden van extracellulaire blaasjes van geconditioneerde celkweekmedia

Het huidige protocol beschrijft een methode om extracellulaire blaasjes uit het perifere bloed en vaste weefsels te extraheren met daaropvolgende profilering van oppervlakteantigenen en eiwitladingen.

Isolatie en analyse van traceerbare en gefunctionaliseerde extracellulaire blaasjes uit het plasma en vaste weefsels

Dit protocol beschrijft de differentiële centrifugatie voor het isoleren en karakteriseren van representatieve EV's (exosomen en microvesicles) uit gekweekte menselijke MSC's. Verdere toepassingen van deze EV's worden in dit artikel ook toegelicht.

Isolatie, karakterisering en therapeutische toepassing van extracellulaire blaasjes uit gekweekte menselijke mesenchymale stamcellen

Hier beschrijven we de verrijking van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel door middel van een geoptimaliseerde differentiële ultracentrifugatiemethode.

Een verrijkingsmethode voor kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van leverkankerweefsel

Hier presenteren we een protocol om van milt afgeleide exosomen van muizen te isoleren met behulp van een combinatie van vertering met collagenase type I en ultracentrifugatie.

Isolatie en karakterisering van exosomen afgeleid van miltweefsels van muizen

Dit protocol beschrijft de isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg met behulp van enzymatische vertering en grootte-uitsluitingschromatografie, waardoor reproduceerbare terugwinning van vesikelverrijkte fracties uit structureel complexe, laagopbrengstweefsels mogelijk is voor downstream moleculaire analyse.

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes uit muisskeletspier en beenmerg door grootte-uitsluitingschromatografie

Leer een rigoureuze methode voor het isoleren van extracellulaire blaasjes uit weefsel, inclusief hersen- en longtumoren. Deze techniek biedt hoge zuiverheid voor morfologische en immunofenotypische analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Meer video's verkennen