Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de spatiotemporale regulatie van een gen van belang tijdens dynamische biologische gebeurtenis, zoals immuniteit in intacte arabidopsis bladeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het ons in staat stelt om de spatiotemporale dynamiek van de promotor activiteit in de grond geteelde intacte plantenbladeren vast te leggen over enkele dagen. Om te beginnen met deze procedure, vul een plastic-cel stekker lade met autoclaved grond.

Zaai een transgene arabidopsiszaad in elke cel. Breng de lade in een groeiruimte die wordt gehandhaafd op 23 graden Celsius en groeien de planten onder continue wit-licht omstandigheden voor twee tot drie weken. Twee dagen voorafgaand aan pathogene inenting, streep de ziekteverwekker die avrRpt2 van een glycerolvoorraad op NYG-medium draagt dat rifampicine bevat met 100 milligram per liter en kanamycine bij 50 milligram per liter.

Incubeer op 28 graden Celsius gedurende 48 uur. Met behulp van plastic tips, oogst de bacteriële cellen die verschijnen op het oppervlak van het medium. Breng de bacteriën over op een plastic buis met 10 milliMolar magnesiumchloride en zet ze opnieuw op.

Meet vervolgens de optische dichtheid van de oplossing op 600 nanometer. Pas de uiteindelijke concentratie van bacteriële cellen aan op 100 miljoen kolonievormende eenheden per milliliter die normaal gesproken overeenkomt met een OD600 van 0,2. Eerst, zorgvuldig uitgesneden een cel plug met een twee tot drie weken oude plant ervoor te zorgen niet om de plant te beschadigen.

Stel de cel in een lege celpluglade in om een goede balans te behouden. Selecteer een zichtbaar gezond blad voor inenting. Vaststellend dat over het algemeen, de derde, vierde en vijfde bladeren van de bodem van de plant zijn gemakkelijk te hanteren.

Geef de bodem die de plant vasthoudt vóór inenting water voor langdurige time-lapse beeldvorming. Optioneel, bij het analyseren van stress-responsieve promotors onderzoeken de bladeren onder een fluorescentie stereomicroscoop voorafgaand aan pathogene inenting om de afwezigheid van YFP signaal te controleren. Trek vervolgens wegwerp latex handschoenen aan om direct contact met de ziekteverwekker tijdens infiltratie te voorkomen.

Met behulp van een een milliliter naaldloze plastic spuit, zorgvuldig infiltreren de abaxiale kant van het blad met de bacteriële suspensie. Inenting van een klein deel op de helft van het blad maakt een goede visualisatie van de PR1 promotor activiteit mogelijk. Gebruik een zachte papieren handdoek om eventuele overtollige bacteriële suspensie te absorberen uit het gebied rond het geïnfiltreerde gebied op het geïnfiltreerde blad.

Onmiddellijk na inenting, gebruik chirurgische tape om een glazen dia vast te stellen aan de plastic lade zodanig dat het geïnfiltreerde blad zich in het midden van de glazen glijbaan. Zorg ervoor dat het ingeënte blad volledig in de glazen schuif is gemonteerd. Snijd een stuk dubbelgelaagde plastic tape in twee stukken om de ruimtes langs de petiole van het geïnfiltreerde blad te passen en snijd een hoek van elk stuk af.

Met behulp van een paar fijne pincet, plak deze stukjes tape aan weerszijden van de petiole zodanig dat de gesneden hoeken van elk stuk uitlijnen met de basis van het blad, ervoor te zorgen dat de tape stukken niet de petiole of het blad te raken. Bereid vervolgens een extra stuk dubbellaagse plastic tape zoals beschreven in figuur twee van het tekstprotocol. Plak dit stuk tape op de top van de eerder aangehangen stukken om een brug over de petiole te vormen, voorzichtig om het petiole of bladblad niet direct tussen de tapestukken te vangen.

Steek vervolgens voorzichtig een klein stukje chirurgische tape op de glazen schuif boven de punt van het blad, zodat het zeer zacht op de glijbaan wordt bevestigd. Druk alleen stevig naar beneden op het gedeelte van de tape dat de glazen schuif direct raakt. Plaats voorzichtig een ander klein stukje chirurgische tape op de rand van de petiole en plastic tape stukken, zodat de petiole is zeer zacht bevestigd op zowel de glazen dia en plastic tape stukken, zorg ervoor dat alleen stevig hechten het gedeelte van de chirurgische tape die direct raakt de glazen glijbaan of de plastic tape stukken.

Steek 200 microliter pipet tips zachtjes in de grond om voorzichtig houd de naburige bladeren uit de buurt van het geïnfiltreerde blad. Zet eerst de fluorescerende stereomicroscoop aan. Zet de plant in de ruimte onder de objectieve lens van de stereomicroscoop voor beeldvorming.

Stel de parameters in voor time-lapse imaging. Gebruik het conventionele YFP-filter om het YFP-signaal te visualiseren. Gebruik het Texas Red-filter om chlorofyl autofluorescentie te visualiseren, zodat het PCD-domein zichtbaar is als een donker gebied omringd door YFP-positieve cellagen.

Gebruik vervolgens de conventionele epi-heldere veldopstelling voor extra lichtblootstellingsstappen, zodat stappen worden geprogrammeert voor blootstelling aan licht tijdens de intervalperiode van de time-lapse imaging, aangezien licht een grote invloed heeft op de immuniteit van planten. Voer het time-lapse imaging programma uit. Voor langdurige observatie over meerdere dagen, overwegen water geven van de plant op de juiste manier.

Na het verkrijgen van afbeeldingen, weglaten extra kanalen die worden gebruikt voor blootstelling aan licht in de intervallen van de dataset. Analyseer de gegevens met behulp van beeldanalysesoftware met verschillende methoden, zoals regio-of-interest-analyse. In deze studie wordt een veelzijdige methode gedemonstreerd voor de montage van arabidopsisbladeren voor intravital time-lapse beeldvorming.

Een representatief voorbeeld van time-lapse beeldgegevens met behulp van avrRpt2 geïnduceerde ETI wordt verkregen als zowel een reeks beelden als als een time-lapse film. In succesvolle experimenten met pPR1-YPF-NLS tijdens avrRpt2 geïnduceerde ETI, wordt voorbijgaande activering van de PR1 promotor waargenomen, zoals blijkt uit YFP uitdrukken foci en verschillende lagen van cellen rond de PCD domein. De activering van de PR1-promotor in cellen rond het PCD-domein begint meestal bij ongeveer vijf uur na inenting, pieken op ongeveer 12 uur na inenting en duurt tot 40 uur na inenting.

Bij het proberen van deze procedure moeten de tijdsverloopvoorwaarden zorgvuldig worden vastgesteld, zoals beschreven in de tekst. Na deze procedure kan de promotoractiviteit kwantitatief en kwalitatief worden geanalyseerd met behulp van analysesoftware. Deze analyse helpt ons om de spatiotemporale dynamiek van genexpressie te onderzoeken in elke biologische gebeurtenis die zich voordoet in levende bladeren van arabidopsisplanten.