Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta
15 mei 2019
De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.
Dit protocol maakt gebruik van een gestroomlijnde aanpak voor het meten van plantengenexpressie in reactie op insectenherbisder. Door het gebruik van losstaande bladeren geïsoleerd in petrischaaltjes, zijn de insecten gemakkelijker toe te passen en te controleren tijdens de relatief korte periode van besmetting die bijdraagt aan reproduceerbare genexpressiegegevens. Dit protocol kan worden aangepast aan vele interacties tussen planten en insecten.
als rekeningmetswaarnemingen van hele installatiesystemen in aanmerking worden genomen. De onvoorspelbare aard van insectenvoeding kan een uitdaging zijn. Daarom bieden een betrouwbare toevoer van goed geënsceneerde larven en gezonde planten de beste kans op succes.
Het visualiseren van hoe gezonde planten en insecten moeten verschijnen en zich gedragen is instrumenteel om optimale resultaten te bereiken, vooral voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van studie. Het aantonen van de procedure met mij zal Frances Perez, een moleculair bioloog in de genetische verbetering van groenten en fruit lab. Voor de voorbereiding van nodale gekweekte weefselkweek aardappelplanten, eerst verkrijgen Kennebec planten die worden geteeld uit explant materiaal met ten minste drie tot vier knooppunten.
Gebruik een steriel blad om de bladeren te verwijderen snijden van de takken dicht bij de hoofdsteel en het verlaten van ongeveer twee millimeter vertakking weefsel per blad. Snijd ongeveer twee millimeter boven en onder elk knooppunt om de knooppunten van de stengels te verwijderen en de nodale stekken te schikken in een steriel weefselkweekvat met knooppuntoverdrachtsmedium met de tak omhoog. Breng vervolgens de nodale stekken over naar een plantenweefselkweekkamer voor twee tot drie weken groei bij 24 graden Celsius en een 16-uurs licht, acht uur durende donkere fotoperiode.
Om de insecten voor te bereiden op het voeden, verkrijg het gewenste larvenstadium van M.sexta en breng één larve over in elke put van een geschikt insluitingsvat afhankelijk van de grootte van de larve. Maak plaatsingssjablonen voor elk oogsttijdpunt met behulp van vijf stevige trays die een set van zes op de juiste manier formaat petrischaaltjes bekleed met wit papier kunnen houden. Traceer een set van zes cirkels met behulp van de juiste grootte Petri schotel op het papier in elke lade en label een set cirkels controle A, B en C en de andere besmet A, B en C.Then label elke plaatsing sjabloon met de juiste oogsttijd.
Label vervolgens één 1,7 milliliter microcentrifugebuis voor elke cirkel in de plaatsingssjabloon om de verstoring, de plantenreplicatieletter en het oogsttijdpunt op de juiste manier te identificeren. Wanneer alle buizen zijn gelabeld, plaats een steriele filter papier schijf in een petrischaal per sjabloon en bevochtigen de schijven met steriel water zonder te laten overtollige vloeistof zwembad in elk gerecht. Plaats vervolgens een schotel in elke cirkel in elke plaatsing sjabloon en plaats drie aardappelplanten van dezelfde leeftijd en relatieve grootte naast elke plaatsing sjabloon.
Om de besmetting te starten, gebruik steriele schaar om de bovenste twee grootte afgestemde bladeren van elke plant te verwijderen en plaats een blad in de controle Petri schotel en een in de besmette petrischaal voor elke plant zo snel mogelijk. Wanneer alle bladeren zijn geplaatst, gebruik soft touch tangen om ten minste een larve over te brengen in elk besmet gerecht zo snel mogelijk en stel de timer voor de gewenste besmetting tijd. Let op de voeding om ervoor te zorgen dat alle larven eten, ter vervanging van alle niet-voedende larven als dat nodig is.
Verwijder alle larven van alle bladeren aan het einde van de besmettingstijd en start de timer voor de oogst. Breng aan het einde van elk oogsttijdpunt elk blad in de overeenkomstige buis en laat de buis onmiddellijk in vloeibare stikstof vallen om het bladmonster te bevriezen voordat het bij min 80 graden Celsius wordt opgeslagen tot de RNA-isolatie. Gezonde nauwkeurig geënsceneerde larven moeten onmiddellijk na plaatsing op het bladoppervlak beginnen met voeden en het voederen moet gedurende de besmettingsperiode vrij consistent worden voortgezet.
De larve aan de onderkant van dit blad heeft geen plantaardig materiaal verbruikt en is een voorbeeld van een mislukte besmetting. Deze bladeren werden losgemaakt van twee weken oude nodale gekweekte weefselkweek planten en geconsumeerd in verschillende snelheden en voeding stijlen voor elke larve stadium. Op basis van deze resultaten werden vierde instar larven geselecteerd om de schade aan bladeren verder te beoordelen voor meer volwassen aardappelplanten die dichter bij elkaar komen bij de aardappelplanten.
In deze genexpressie studies, twee nieuwe C2H2 zink vinger transcriptie factoren die robuust reageren op M.sexta herbivory werden geïdentificeerd ter ondersteuning van het gebruik van vrijstaande bladeren voor besmetting testen. Vergeet niet om leeftijd en grootte afgestemde bladeren te gebruiken en om de larven voor elk experiment goed te fasereren, omdat uniformiteit resulteert in meer reproduceerbare gegevens. Bladweefsels kunnen worden getest voor stress-geïnduceerde reactieve zuurstofsoorten en jasmoninezuur hormoonderivaten.
Hele transcriptoom, proteoom, of microbioom studies kunnen ook worden uitgevoerd op de bladweefsels.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt gebruik van een gestroomlijnde aanpak voor het meten van plantgenexpressie als reactie op herbivorie door insecten. Door Manduca sexta-larven aan te brengen op losgekoppelde aardappelbladeren, kunnen onderzoekers eenvoudig de effecten van herbivorie op de genexpressie monitoren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Plantbiologie
- Interacties tussen insecten en planten
- Genexpressieanalyse
Achtergrond
- Herbivorie door insecten heeft een aanzienlijke impact op de gezondheid en ontwikkeling van planten.
- Het begrijpen van plantenreacties op herbivorie is cruciaal voor landbouwpraktijken.
- Traditionele methoden om deze interacties te bestuderen kunnen complex en variabel zijn.
- Assays met losgekoppelde bladeren bieden een gecontroleerde omgeving voor experimenten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het beoordelen van plantgenexpressie als reactie op herbivorie.
- Om de studie van diverse plant/insect-interacties te faciliteren.
- Om de reproduceerbaarheid van genexpressiegegevens te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Toepassing van Manduca sexta-larven op losgemaakte aardappelbladeren.
- Isolatie van bladeren in petrischalen voor gecontroleerde observatie.
- Monitoring van het voedingsgedrag van de insecten tijdens de assay.
- Assay voor de expressie van homologen van transcriptiefactoren.
Belangrijkste resultaten
- Een succesvolle applicatie van larven leidt tot meetbare veranderingen in genexpressie.
- De expressie van zes homologen van transcriptiefactoren werd geanalyseerd.
- De gegevens ondersteunen de reproduceerbaarheid en aanpasbaarheid van de methode.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van plantreacties op herbivorie.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbaar kader voor het bestuderen van plantreacties op herbivorie door insecten.
- Aanpasbaar aan diverse plant-insectinteracties met de juiste controles.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze methode om bredere ecologische effecten te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Assays met losgekoppelde bladeren verminderen de biologische variabiliteit in studies naar plant-insectinteracties, waardoor meer reproduceerbare genexpressiegegevens worden verkregen voor doelvalidatie in de landbouwbiobiotechnologie. Deze gestroomlijnde aanpak ondersteunt het mechanistische risicobeheer van herbivorieresponsroutes door vroege signaaltransductiegebeurtenissen te isoleren in een gecontroleerd, schaalbaar systeem. De methode verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij het identificeren van transcriptiefactoren en signaleringsknopen die relevant zijn voor de ontwikkeling van gewasbeschermingseigenschappen.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om transcriptionele reacties op herbivorie door kauwende insecten te onderzoeken, wat de functionele validatie van kandidaatgenen zoals C2H2-zinkvinger-transcriptiefactoren ondersteunt.
- Operationele waarde: Vereenvoudigt de experimentele workflow door bladeren los te maken voorafgaand aan de infestatie, waardoor de ruimtebehoefte wordt verminderd en de doorvoersnelheid voor targetscreening wordt verhoogd.
- Strategische waarde: Faciliteert hypothesetoetsing in plantdefensiepaden, wat helpt bij de prioritering van eigenschappen voor pijplijnen ter verbetering van gewassen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd platform voor het kwantificeren van veranderingen in genexpressie als reactie op gedefinieerde verstoringen door herbivorie.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van bladbehoud in Petri-schalen om reproduceerbaarheid en eenvoudige monitoring van het voedingsgedrag van larven te garanderen.
- Strategische waarde: Maakt aanpassing mogelijk over verschillende plant-insectsystemen, wat een brede toepasbaarheid ondersteunt in agrochemische programma's en programma's voor trait discovery.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie door downstream-analyse mogelijk te maken van stressmarkers zoals reactieve zuurstofverbindingen en jasmonzuurderivaten.
- Operationele waarde: Maakt profilering van het volledige transcriptoom, proteoom of microbioom van bladweefsels mogelijk, wat de multi-omics-integratie bij trait-evaluatie verbetert.
- Strategische waarde: Versterkt de translationele continuïteit door vroege genexpressieresponsen te koppelen aan fenotypische uitkomsten bij resistentie tegen herbivorie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
De assay met losgekoppelde bladeren past binnen de fase van discovery biology, waardoor hypothesen in een vroeg stadium kunnen worden getest en signaalpaden kunnen worden verduidelijkt voordat men overgaat naar lead-identificatie bij de ontwikkeling van gewaskenmerken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van door herbivorie geïnduceerde signaleringspaden en verduidelijkt de rollen van transcriptiefactoren in vroege afweerreacties.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door gestandaardiseerde bladpreparatie en gecontroleerde infestiecondities, wat reproduceerbare kwantitatieve resultaten garandeert.
- Analytica: Genereert genexpressie-uitlezingen die vergelijking tussen geïnvesteerde en controlecondities mogelijk maken, wat statistische evaluatie van behandelingseffecten faciliteert.
- Translationeel onderzoek: Legt een connectie met preklinische continuïteit door analyse van hormoonderivaten en markers voor oxidatieve stress te permitteren die gekoppeld zijn aan fenotypische resistentie.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Functioneert als een herbruikbaar platform voor meerdere plant-insectinteracties, waardoor herontwikkelingskosten in programma's voor kenmerkontdekking worden verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door ruis van variabiliteit van de hele plant te verminderen en zich te concentreren op blad-autonome signalering.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en schaalbaarheid door vereenvoudigde bladafscheiding en een assayformaat op basis van Petri-schalen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij kenmerkontwikkeling door betrouwbare, reproduceerbare gegevens over vroege afweerreacties te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaatgenen mogelijk op basis van consistente expressiepatronen in reactie op herbivorie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in plantenweefselkweek, larvale stadiering en RNA-isolatietechnieken.
- Afhankelijk van steriele instrumentatie, gecontroleerde groeikamers en infrastructuur voor RNA-conservering (vloeibare stikstof, -80°C opslag).
- Vereist standaardisatie tussen teams met betrekking tot bladleeftijd, grootte en de selectie van het larvale stadium om experimentele uniformiteit te waarborgen.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding naar verschillende plantensoorten of insectenherbivoren met variërende voedingsgewoonten.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van gezonde, uniform gestageerde larven en waakzame monitoring om consistente voeding gedurende de gehele assayperiode te bevestigen.
