Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging
19 maart 2019
Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.
Deze monstervoorbereidingstechniek is ontworpen om de beste kwaliteit van ultrastructuurconservering te combineren met het meest geschikte contrast voor de beeldmodaliteit in een gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscoop. Dit protocol is vooral handig voor monsters die voorbereid moeten worden door hoge drukbevriezing voor een betrouwbare ultrastructuurconservering, maar niet genoeg contrast krijgen tijdens de vriessubstitutie voor volumebeeldvorming. Voor minimale hars inbedding is het essentieel om zoveel mogelijk hars te verwijderen om een goede targeting later in de gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscoop mogelijk te maken.
Om te beginnen, gebruik de pipet om een druppel van 20% PVP PBS druppel op de snijmat. Dompel de ontleed nervus tibialis onder in de druppel. Gebruik de scalpel om twee millimeter lengte van het monster te snijden.
Gebruik fijne tangen om het monster in een 0,2 millimeter diepe metalen monsterdrager van type A te plaatsen. Breng de drager over in de middelste plaat van de cartridge. Leg de hexadecane-gecoate type B drager op de bovenkant als deksel.
Sluit de montage door de bovenste helft van de cartridge te verlagen. Sluit de driedelige cartridge in het laadstation van de hogedrukvriezer. Druk op de procesknop en ga verder volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
Plaats in een bad van vloeibare stikstof monsterdragers in cryo-flesjes met twee milliliter bevroren 0,1%-tanninezuur en aceton en sluit de doppen. Plaats de cryo flacons in de vriesvervangingseenheid die op min 90 graden Celsius is ingesteld. Start het programma en bewaar de monsters daar voor 100 uur.
Was in de vriessubstitutie-unit de monsters drie keer gedurende 30 minuten met twee milliliter aceton. Plaats 2%osmiumtetroxide in 0,1%uranylacetaat in de vriessubstitutie-unit om af te koelen en voeg deze toe aan de monsters voor zeven uur durende aanhoudende kleuring bij min 90 graden Celsius. Wanneer de temperatuur van het programma in de vriessubstitutie eenheid bereikt min 20 graden Celsius, houd de monsters daar voor nog eens 16 uur.
Wanneer de temperatuur stijgt tot 4 graden Celsius, gooi de vloeistof in de flesjes en vul in pure aceton. Verwijder de cryo-flesjes uit de vriessubstitutie. Monsterbehandeling vóór het invriezen en na osmofication is van cruciaal belang, omdat het monster ernstig kan worden beschadigd.
Gebruik in een rookkap fijne tangen om de metalen dragers uit de cryoflacs te verwijderen en de monsters van de dragers over te brengen om ze onder te dompelen in een 150 millimeter diephorlogeglasschotel gevuld met aceton. Gebruik fijne tangen om de monsters over te brengen in twee milliliter reactiebuizen gevuld met aceton. Zet de magnetron op 250 watt gedurende 40 seconden en start de magnetron om de monsters te wassen en vier keer te herhalen.
Pipette een milliliter van 1%thiocarbohydrazide oplossing in de reactiebuis en zet het in de magnetron. Zet de vacuümfunctie aan met twee minuten aan en twee minuten uit, het is in totaal 14 minuten en zet deze in op 150 watt. Start de magnetron.
Was het monster vier keer in aceton zoals voorheen. Pipette een milliliter van 2%osmium tetroxide oplossing in de reactiebuis. Plaats het monster in de magnetron en gebruik dezelfde magnetron instellingen als bij de thiocarbohydrazide.
Was het monster vier keer in aceton zoals voorheen. Pipette een milliliter van 25% hars in aceton in de reactiebuis en zet het in de magnetron. Schakel de vacuümfunctie gedurende drie minuten in en zet deze in op 250 watt.
Start de magnetron. Gebruik een tandenstoker om de nervus tibialis uit de reactiebuis te verwijderen en plaats ze op een stuk plastic folie. Plaats een halogeenlamp dicht bij de monsters om de hars op te warmen.
Met behulp van een tandenstoker, voorzichtig duw het monster rond op de plastic film totdat er geen resterende hars wordt gedetecteerd. Leg de plastic folie met het monster erop in de oven en stel de temperatuur in op 60 graden Celsius om de monsters minstens 48 uur te polymeriseren. Gebruik een scheermesje om de gepolymeriseerde monsters samen met de plastic folie uit te snijden op een grootte die past bij de SEM stomp.
Gebruik een tandenstoker om geleidende zilveren hars toe te voegen op de SEM stompen en bevestig de gesneden monsters aan. En voeg dan hars rond de monsters. Zet de SEM stompjes in de oven om te polymeriseren op 60 graden Celsius voor ten minste 4 uur of 's nachts.
Plaats na polymerisatie de SEM-stubs in een sputtercoater. Zet de sputtercoater op 35 milliamperes en breng 10 nanometer dikke gouden coating of laag voor een minuut. Na het coaten plaatst u de SEM-stubs in de gerichte ionenbundel die elektronenmicroscoop scant.
In deze studie werd een verbeterd protocol uitgevoerd voor nervus tibialis van de muis en C.elegans om de optimale conservering en het contrast te illustreren om 3D-volumebeeldvorming uit te voeren met een gerichte ionenbundel scanning elektronenmicroscoop. Standaardprotocollen hebben vaak last van een gebrek aan membraancontrast waar het verbeterde protocol een sterk membraancontrast biedt. De dwarsdoorsnedebeelden van C.elegans met verbeterd protocol en standaardprotocol tonen een onderscheidend verschil.
Naast de dwarsdoorsnedebeelden van nervus tibialis, helpt het verbeterde protocol om een sterker membraancontrast te laten zien in vergelijking met het standaardprotocol. Na de nabewerking worden de elektronenmicroscoopgegevens gevisualiseerd met behulp van IMOD, een beeldverwerkings- en modelleringsprogramma. Het met blauw gemarkeerde gebied toont gesegmenteerde axonen.
Het rood gemarkeerde gebied toont de Remak-bundels. De geel-en oranje-gemarkeerde gebieden tonen myeline omhulsels. En het turquoise gemarkeerde gebied toont mitochondriën.
Virtueel relikwie en het driedimensionale model illustreert de fijnweefselarchitectuur en helpt de functie ervan te begrijpen. Andere volume scanning elektronenmicroscopie methoden kunnen worden gebruikt, zoals seriële blok-gezicht scanning elektronenmicroscopie en array tomografie. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor transmissie elektronenmicroscopie en andere monstertypes, zoals monsters uit het centrale zenuwstelsel.
Osmium tetroxide, thiocarbohydrozide en uranylacetaat zijn giftige chemicaliën en moeten zorgvuldig worden gebruikt. De hars is ook schadelijk en moet met zorg worden gebruikt. Persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen en labjas moeten worden gedragen voor het volledige protocol.
Overzicht
Deze studie presenteert een verbeterd protocol voor monstervoorbereiding dat hogedrukvriestechniek combineert met magnetronondersteunde verwerking voor een verbeterde behoud van de ultrastructuur en contrast bij beeldvorming. Met behulp van de tibia-zenuw van muizen en Caenorhabditis elegans als modelsystemen, demonstreert deze techniek significante voordelen ten opzichte van standaardprotocollen wat betreft membraancontrast en 3D-beeldvormingsmogelijkheden.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Microscopie
- Beeldvormingstechnieken
- Monsterpreparatie
Achtergrond
- Het behoud van de ultrastructuur is essentieel voor effectieve beeldvorming.
- Standaardprotocollen schieten vaak tekort in het bieden van voldoende contrast voor specifieke weefsels.
- Het combineren van meerdere technieken kan de resultaten van de beeldvorming verbeteren.
Gebruikte methoden
- Hoogdrukbevriezing en magnetronondersteunde monstervoorbereiding
- Muistibiaalzenuw en Caenorhabditis elegans
- Focused ion beam scanning elektronenmicroscopie (FIB-SEM)
Belangrijkste resultaten
- Het verbeterde protocol levert een beter membraancontrast op in vergelijking met standaardmethoden.
- Dwarsdoorsnedebeelden illustreren duidelijke verschillen in de structurele visualisatie.
- De bevindingen ondersteunen de effectiviteit van het protocol voor gedetailleerde 3D-volumebeeldvorming.
Conclusies
- Deze studie toont aan dat het combineren van specifieke verwerkingstechnieken de beeldkwaliteit aanzienlijk verbetert.
- Het protocol is relevant voor diverse biologische monsters en kan helpen bij het begrijpen van de weefselarchitectuur.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol vult een kritiek hiaat in de ultrastructurele beeldvorming op, waarbij standaard hogedrukvriezen onvoldoende contrast levert voor volume-beeldvorming in FIB-SEM. Door het membraancontrast te verbeteren middels magnetron-ondersteunde kleuring en minimale inbedding in hars, maakt deze methode een betrouwbare 3D-reconstructie van neurale weefsels mogelijk. Dit ondersteunt de validatie van targets en het mechanistisch minimaliseren van risico's in pipelines voor neurowetenschappelijke ontdekkingen door het leveren van voorspellende, getrouwe structurele gegevens.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door behoud van de ultrastructuur en verbeterd membraancontrast in neurale weefsels.
- Operationele waarde: Vermindert onduidelijkheid in studies naar target engagement door heldere visualisatie van axonale en myelines architecturen te bieden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor met kwantitatieve ultrastructurele resultaten voor downstream compound-screening.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid door consistente contrastverbetering en minimale harsinbedding.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt ziekterelevante modellering door de fijne weefselarchitectuur in monsters van het centrale zenuwstelsel te behouden.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie via de reproduceerbare generatie van 3D-volumedata.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetidentificatie tot preklinische evaluatie, in het bijzonder voor programma's gericht op neurowetenschappen waarbij structurele validatie vereist is.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door het in kaart brengen van subcellulaire structuren die cruciaal zijn voor de neurale functie.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via reproduceerbare, hoog-contrast monsters die geschikt zijn voor geautomatiseerde FIB-SEM imaging-workflows.
- Analytica: Genereert kwantitatieve morfometrische read-outs (bijv. axondiameter, myelinedikte) die comparatieve analyse tussen verschillende condities mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Legt een link met preklinische continuïteit door het modelleren van weefselarchitectuur die relevant is voor ziektemechanismen bij neuropathieën.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor ultrastructurele validatie over meerdere neurale doelprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie door vermindering van mechanistische ambiguïteit in de neurale ultrastructuur.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de monstervoorbereiding voor imaging-campagnes met een hoog volume.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen via betrouwbare structurele biomarkers, waardoor biologische risico's in een laat stadium bij CNS-programma's worden verminderd.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van neurale targets op basis van gevalideerde ultrastructurele fenotypen.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in hogedrukvriezen, microwave-ondersteunde verwerking en elektronenmicroscopie is vereist.
- Toegang tot hogedrukvriezers, microwave-processors, FIB-SEM en sputtercoaters is essentieel.
- Standaardisatie tussen teams van histologie, beeldvorming en data-analyse-eenheden is noodzakelijk voor consistente resultaten.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen (bijv. muis, C. elegans, menselijk weefsel) vereist optimalisatie van de kleurings- en inbeddingstijden.
- Praktische beperkingen omvatten de omgang met toxische reagentia (osmiumtetroxide, uranylacetaat) en verlengde verwerkingstijden voor vries-substitutie en polymerisatie.
