Directe inspuiting van een lentivirale Vector hoogtepunten meerdere Motor trajecten in het ruggenmerg Rat
15 maart 2019
Dit protocol toont injectie van een retrogradely vervoerbare virale vector in rat ruggenmerg weefsel. De vector is overgenomen in de synaps en vervoerd naar de cel lichaam van doel neuronen. Dit model is geschikt voor retrograde tracering van belangrijke spinale trajecten of targeting cellen voor gen-therapie-toepassingen.
Virale vectoren kunnen genetisch materiaal in cellen introduceren om defecte genen te compenseren, belangrijke groeieiwitten te up-reguleren of markers te produceren die neurale circuits kunnen traceren. De invoering van virale vectoren in het zenuwstelsel is een uitdaging als gevolg van aangeboren biologische barrières. Directe injectie in ruggenmergweefsel omzeilt deze barrières, waardoor toegang tot cellichamen of synapsen.
Correct gericht op de L1 naar L4 spinale niveaus kan moeilijk zijn. Het is belangrijk om oriëntatiepunten te gebruiken om het doel te verifiëren en te onthouden dat deze segmenten lijn naar de T11 tot T13 wervels. Sluit de injector op de dag van de procedure aan op de micropomp en plaats de micropomp in een micromanipulator met een vernierschaal.
Gebruik een spuit met een flexibele naald om een gekleurde kleurstof zorgvuldig in een van de glazen naalden te laden en de glasnaald in de injector te steken. Bevestig vervolgens dat de naald correct in de ringen is gezaaid en dat de injectordop op de geschroefde is en dat de stalen injectornaald ongeveer driekwart van de lengte van de glazen naald wordt verlengd. Ontdooi vóór het begin van de procedure ten minste één microliter, plus een klein volume extra virus per injectie uit vriesopslag, en bevestig een gebrek aan respons van teensnuifje in een verdoofde rat.
Scheer langs de dorsale middellijn van de heupen naar de inferieure hoek van het schouderblad van het dier, trek de huid strak voor een gemakkelijker en nauwkeuriger scheren, en desinfecteren de blootgestelde huid met sequentiële 5% jodium en 70% ethanol scrubs. Breng oogheelkundige zalf aan op beide ogen. Plaats het dier vervolgens op een steriele doek en plaats gaas onder de blaas om urine te verzamelen.
Om de plaats van de huidincisie te identificeren, drukt u de vingers voorzichtig op de laatste rib om de L1-wervel te lokaliseren. Met behulp van deze wervel als een mijlpaal en het houden van de huid strak door zachte verspreiding tijdens het indrukken stevig met de scalpel, gebruik maken van een nummer 10 chirurgische blad om een drie tot vier centimeter gevilde incisie eindigt net inferieur aan L1 om de spier bloot te stellen. Gebruik tangen en scharen om te voelen voor de spineuze processen.
Maak kleine rostral bezuinigingen om ruimte om veilig te grijpen op een bovenste proces met rat tand tang. En maak twee lange, diepe sneden zo dicht mogelijk bij de processen mogelijk. Na het veiligstellen van de laterale spieren op zijn plaats, duidelijk de spier rond de processen om de vorm van hun hoofd te bepalen.
Visualiseer vervolgens de vormen van de hoofden van de spineuze processen om de plaats van de laminectomie te identificeren. De T11 en de verbindende T12 en T13 processen zullen de plaats van de laminectomie zijn. Zodra het doelgebied correct is geïdentificeerd, spreidt u de wervels voorzichtig uit om de tussenwervelbanden te onthullen en gebruikt rongeurs kleine beten van de spineuze processen en het dorsale aspect van de wervels.
Duidelijk het bot uit de buurt van de middellijn, zodat de middellijn bloedvat kan worden waargenomen, waardoor een venster dat duidelijk onthult het ruggenmergweefsel en is vrij van puin. Bevestig vervolgens stabiliserende tangen aan de spineuze processen rostral en caudal aan het laminectomievenster om het dier in een ruggenmerghouder te beveiligen. En hef de buik van het dier op om het effect van ademhalingsbewegingen te ontkennen.
Om het virus in de injector te laden, pipette ongeveer vijf microliter van de ontdooide voorraad op een stuk Parafilm, en plaats de glasnaalden zodat de punt zich in de daling bevindt. Gebruik de micropomp om maximaal vier microliter van het virus terug te trekken met een snelheid van 20 tot 100 nanoliter per seconde, en stel de controller te injecteren voordat het vrijgeven van een kleine hoeveelheid virus uit de naald tip om ervoor te zorgen dat het niet wordt geblokkeerd. Veeg een overtollig virus af met een laboratoriumdoek en plaats de micromanipulatoren zodat de vernierschaal zichtbaar is.
Plaats de naald op de middellijn van het ruggenmerg en gebruik de vernierschaal op de micromanipulator om de naald lateraal 0,8 millimeter te leiden. Laat vervolgens de naald naar het ruggenmerg totdat het inspringt, maar niet doorboren, de dura, en gebruik een snelle draaiende beweging om de dura met de naald te doorboren totdat de naaldpunt is gezonken tot een diepte van 1,5 millimeter. Zodra de naald is op zijn plaats, het programma van de injector om het virus te leveren met een snelheid van 400 nanoliter per minuut, en bevestigen dat het virus is het invoeren van het ruggenmerg door het observeren van de voortgang van de kleurstof front.
Zodra de injectie is voltooid, laat de naald twee tot vijf minuten rusten in het ruggenmerg om de verspreiding van het virus te vergemakkelijken, voordat u de naald langzaam terugtrekt voor positionering op de volgende injectieplaats. Na de laatste injectie, verwijder het dier uit de ruggenmerghouder om het verwijderen van alle apparaten die worden gebruikt om de laterale spier te verspreiden mogelijk te maken. Sluit vervolgens de spier met een 4.0 chromische catgut hechting en nietje van de huid met negen millimeter wondclips.
Vier weken na een succesvolle injectie wordt significante GFP-expressie waargenomen in de neuronen in de grijze stof van het thoracale ruggenmerg aan de zijkant, ipsilateraal aan de injectie. In de witte stof wordt GFP-expressie waargenomen in de axonen in het ipsilaterale koord, vooral in gebieden die typisch zijn voor de propriospinale axonen. Een hogere vergroting van de grijze stof neuronen onthult een voorbeeld van een typische signaalexpressie in neuronale cellichamen en dendrieten.
GFP expressie in neuronen kan ook worden waargenomen in hersenstam kernen, zoals binnen de pontine reticulaire vorming. De belangrijkste factoren voor een succesvolle spinale injectie procedure zijn correcte wervel targeting en ervoor te zorgen dat het virus is het invoeren van het weefsel Als een rostrale dwarslaesie wordt uitgevoerd voorafgaand aan deze procedure, directe injectie kan worden gebruikt om neuronen die verbindingen rond de schade te herstellen traceren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de injectie van een retrogradement transporteerbare virale vector in ruggenmergweefsel van ratten, wat het traceren van neurale circuits en potentiële toepassingen van gentherapie mogelijk maakt. De procedure zorgt ervoor dat de vector bij de synaps wordt opgenomen en naar het cellichaam van de doelneuronen wordt getransporteerd, wat inzichten in spinale paden faciliteert.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Gentherapie
- Neuroanatomie
Achtergrond
- Virale vectoren kunnen defecte genen compenseren en genetisch materiaal in cellen introduceren.
- Directe injectie in het ruggenmerg omzeilt biologische barrières voor een effectieve targeting.
- Het correct targeten van de spinale niveaus is cruciaal voor succesvolle resultaten.
- Referentiepunten zoals wervels helpen bij de chirurgische benadering.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het injecteren van virale vectoren in het ruggenmerg.
- Om retrograde tracing van spinale banen mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar toepassingen van gentherapie te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Het protocol omvat chirurgische injectie direct in het ruggenmerg van de rat.
- Het doelgebied beslaat de wervelniveaus L1 tot L4, waarbij gebruik wordt gemaakt van referentiepunten voor nauwkeurige targeting.
- Een zorgvuldige toediening van virale vectoren met specifieke tijdlijnen voor injectie en monitoring wordt gedetailleerd beschreven.
- Post-injectie observaties richten zich op de expressie van GFP in neuronen.
Belangrijkste Resultaten
- Een succesvolle injectie leidt tot een significante GFP-expressie in naburige neuronen en axonen.
- Onthulde neuronale paden tonen de effectiviteit van het retrograde transport van de virale vector aan.
- GFP-expressiepatronen wijzen op een succesvolle targeting en opname in het thoracale ruggenmerg.
- Conclusies benadrukken het belang van nauwkeurige vertebrale targeting voor succesvolle toepassingen.
Conclusies
- Deze studie biedt een betrouwbare methodologie voor injecties van virale vectoren in het ruggenmerg.
- De procedure vergroot ons begrip van de neuronale connectiviteit en potentiële gentherapiestrategieën.
- Het heeft implicaties voor het traceren van neurale circuits en het targeten van specifieke neuronale populaties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Directe injectie van lentivirale vectoren in het ruggenmerg maakt gerichte aflevering van genetisch materiaal aan specifieke neuronale populaties mogelijk, waardoor biologische barrières die systemische benaderingen beperken, worden omzeild. Deze methode ondersteunt mechanische risicoreductie bij target-validatie door nauwkeurige tracering van motorische banen, zoals de rubrospinale en reticulospinale banen, mogelijk te maken. De benadering biedt predictieve zekerheid in preklinische modellen door neuronale connectiviteitspatronen te onthullen die relevant zijn voor de functie en het herstel van motorische circuits.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door specifieke spinale motorische routes en hun onderlinge verbindingen te traceren.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode voor functionele targetvalidatie via retrograad transport van virale vectoren naar neuronale cellichamen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door inzicht te geven in de betrokkenheid van routes en de efficiëntie van de neuronale opname in ziekterelevante systemen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door neuronale targets met een hoge anatomische getrouwheid te definiëren.
- Operationele waarde: Waarborgt assay-standaardisatie door consistente virale levering aan propriospinale interneuronen en hersenstamkernen.
- Schaalbaarheidswaarde: Faciliteert hergebruik van het platform over verschillende ruggenmergsegmenten en letselmodellen voor betrouwbare evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Toont continuïteit aan van ontdekking naar preklinische validatie door GFP-expressie in het thoracale ruggenmerg en de pontine reticulaire formatie in kaart te brengen.
- Mechanistische risicoreductie: Benadrukt leeftijdsonafhankelijke integratiepatronen die risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling in neurodegeneratieve modellen informeren.
- Voorspellend vertrouwen: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door neuronale populaties te identificeren die na letsel verbindingen herstellen.
Integratie van pipeline en workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van doelwitidentificatie via lead-optimalisatie tot preklinische validatie, in het bijzonder voor aandoeningen van de motorische circuits.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door retrograde tracing van spinale paden mogelijk te maken om de architectuur van motorische circuits te verduidelijken.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde virale injectie en kwantitatieve GFP-expressie-metingen in gedefinieerde neuronale populaties.
- Analytica: Biedt kwantitatieve metingen van de transductie-efficiëntie en axonaal transport, wat helpt bij het vergelijken van condities tussen experimentele groepen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug naar preklinische continuïteit door neuronen te traceren die verbindingen rond letselplaatsen herstellen, wat inzicht geeft in herstelmechanismen.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor targeting van het ruggenmerg over meerdere ziektemodellen en therapeutische modaliteiten.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doeltreffende validatie door mechanistische ambiguïteit bij de betrokkenheid van spinale motorische banen te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van landmark-gebaseerde targeting en gecontroleerde parameters voor virale aflevering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege biologische risicoreductie van targets die betrokken zijn bij de functie van motorische circuits.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van neuronale opnamepatronen en banespecifieke transductie-efficiëntie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in spinale chirurgie bij knaagdieren en microsurgische technieken voor nauwkeurige targeting van de wervels.
- Is afhankelijk van microspuitpompen, micromanipulatoren met noniusverdeling en steriel chirurgisch instrumentarium.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de virale titer, het injectievolume en de postoperatieve monitoringsprotocollen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing op basis van de leeftijd van de knaagdieren en letselmodellen, vanwege de waargenomen leeftijdsafhankelijke integratie in de corticospinale banen.
- Wordt beperkt door de noodzaak van een precieze dorsale laminectomie en spinale stabilisatie om weefselschade tijdens de naaldinsertie te voorkomen.
