Name: Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer organotypische snijculturen van muizen cerebellum voorbereiden en immunokleuring toepassen om myelinisatie en remyelinisatie te bestuderen. Deze methode behoudt weefselarchitectuur en ondersteunt live imaging en drugsontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon en Dr. Thomas Roux voor waardevolle opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, ICM, ARSEP subsidies R13123DD, R17127DD van de ANR (tot A.D.) en FRM fellowship, SPF20110421435 (tot A.D.), FDT20170437332 (naar M.T.). Wij danken de CELIS faciliteit voor de cultuur van de cel en de icm. Quant imaging platform.

Alle werkzaamheden waarbij dieren worden institutionele beleidslijnen en door de UPMC, INSERM en de Franse en Europese gemeenschapsrichtlijn 86/609/EEG vastgestelde richtsnoeren nageleefd.
1. voorbereiding van de voedingsbodem en cultuur wordt ingevoegd (Hands-on tijd ≈ 10-15 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
<ol><li>Bereiden van 40 mL gestolde voedingsbodem, die uit 50 bestaat % BME, 25% Henks evenwichtig zoutoplossing (1 x), 25% warmte-geïnactiveerd paard serum, aangevuld met 2 mM glutamine afgeleide, 100 IU/mL penicilline-streptomycine en 4.5 mg/mL D-Glucose. Breng de pH op 7.4.</li>
	<li>Filter-steriliseren het medium door een 0,22 μm filter aangepast op een 50 mL kunststof spuit. Opmerking: Kweekmedium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor ten minste een week.</li>
	<li>Voor een standaard nest van 6 pups, gebruik twee steriele 6-Wells-platen. Voor elke plaat, verwijder het klepje en voeg 1 mL gestolde voedingsbodem per putje.</li>
	<li>Plaats één cultuur invoegen in elk afzonderlijke putje door het ingedrukt houden van de kunststof rand met steriel pincet. Zet het deksel terug op de plaat. Opmerking: De cerebellaire segmenten verzameld uit één pup (6-8) kunnen worden verzonden op twee membranen (3-4 cerebellaire segmenten per membraan invoegen).</li>
</ol>2. voorbereiding van de dissectie Medium (Hands-on tijd ≈ 5 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
<ol><li>100 mL dissectie medium, dat uit Gey de evenwicht zoutoplossing aangevuld met D-Glucose en 1 x 4.5 mg/mL penicilline-streptomycine (100 IU/mL elk bestaat) voor te bereiden.</li>
	<li>Filter-steriliseren het medium door een 0,22 μm filter eenheid. Opmerking: Het medium van de dissectie kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor ten minste een maand.</li>
	<li>Voeg 5 mL van koude dissectie medium tot 60 mm cel cultuur gerechten. Bereiden een 60 mm cel cultuur schotel voor elke pup te worden ontleed.</li>
	<li>Houd de dissectie gerechten op ijs tot gebruik.</li>
</ol>3. voorbereiding van de dissectie materiaal (Hands-on tijd ≈ 15 min)
<ol><li>Reinig de Bank met 100% ethanol.</li>
	<li>Het steriliseren van alle hulpmiddelen van de dissectie, een scheermesje en het weefsel chopper van kunststof platform met 100% ethanol.</li>
	<li>Fix het scheermesje en het plastic platform op de chopper weefsel en de snijdikte tot 300 µm aan te passen.</li>
	<li>Zorg ervoor dat alle de ethanol is verdampt voordat de dissectie.</li>
</ol>4. CerebellumDissection en voorbereiding van de secties (Hands-on tijd ≈ 15-20 min per dier)
<ol><li>Plaats een van de 60 mm cel cultuur gerechten met het medium van de ijskoude dissectie onder de binoculair Microscoop en verwijder de bovenste plaat.</li>
	<li>Swab het hoofd bont met 70% ethanol (zorgvuldig vermijden van het raken de ogen van het dier) en het dier met behulp van grote scherpe schaar, overeenkomstig de goedgekeurde procedure onthoofden. Opmerking: De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 Muizen zonder specifieke seks of stam bias.</li>
	<li>Gebruik kleine schaar te snijden de huid langs de middellijn van het hoofd vanaf de nek en omhoog naar de snuit van de muis.</li>
	<li>Aanhouden van het hoofd en de schedel bloot, vouwen terug de huid ventrally onder het hoofd en de twee plooien van de huid tussen de vingers knijpen.</li>
	<li>Invoegen van de kleine schaar zachtjes in het achterhoofdsgat en snijd de schedel door een lateraal incisie aan de zijkant en knip rondom de hoofd schedel. Houd de punt van de schaar als parallel en dicht bij de schedel mogelijk tijdens het snijden, om te voorkomen beschadiging van het hersenweefsel.</li>
	<li>De dorsale deel van de schedel met behulp van fine-straight pincet ophalen. Terwijl het zorgvuldig tillen het dorsale deel van de schedel, snijd de daaraan vastzittende hersenvliezen (doorschijnend geïrrigeerde membraan rond het hersenweefsel) eventueel met kleine schaar om te voorkomen beschadiging van het hersenweefsel.</li>
	<li>Boete-straight pincet zorgvuldig te introduceren (of als alternatief gebruik een spatel) tussen de ventrale schedel en de hersenen, zachtjes flip uit de hersenen en snijd de optiek en trigeminus zenuwen met een kleine schaar.</li>
	<li>Het helpen van de hersenen te laten vallen door de zwaartekracht in de 60 mm cel cultuur schotel ijskoude dissectie medium bevattende ondersteboven draaien van het hoofd net boven de schotel en laat de laatste verklevingen met kleine schaar indien nodig.</li>
	<li>Met behulp van fijne pincet, oriënteren de hersenen met de dorsale zijde naar de onderzoeker, en de ventrale zijde liggend op de bodem van de schotel.</li>
	<li>Onder de binoculair Microscoop, kunt de verlostang boete-straight immobiliseren van de hersenen aan de reukkolf kant en raak de hindbrain, zoals het beschadigd kan raken. De hindbrain te scheiden van de rest van de hersenen (voorgrond- en veroorzaakt, zie schema op figuur 1Aa), met behulp van fine-straight pincet. Als u wilt het cerebellum scheiden van de rest van de hindbrain, gebruik de fijne pincet te snijden van de cerebellaire steeltjes onder het cerebellum (zie schema op figuur 1Aa').</li>
	<li>Zodra het cerebellum geïsoleerd is, zorgvuldig scheur weg de hersenvliezen met behulp van fine-straight pincet (zie schema op figuur 1Aa').
</li>
	<li>Houd het cerebellum zachtjes met de mooie gebogen verlostang en plaats het met de dorsale zijde boven op de plastic platform loodrecht naar de chopper razor blade (zie schema op figuur 1Bb).</li>
	<li>Gecombineerd een overmaat van dissectie medium rond het cerebellum met behulp van een steriele dun-einde Pipetteer tip aangepast op een 1 mL Pipetteer (zie schema op figuur 1Bb).</li>
	<li>Ervoor zorgen dat het cerebellum plat legt, maar is niet uitgerekt, eenmaal geplaatst op het platform om optimale Sagittaal segmenten tijdens vectorafbeeldingsbestanden (zie schema op figuur 1Bb).</li>
	<li>Snij 300 μm dik Sagittaal secties van het cerebellum met de chopper weefsel (zie schema op figuur 1Bb'). De kracht en de snelheid van het blad moeten worden geoptimaliseerd op site.</li>
	<li>Voeg voorzichtig een druppel van dissectie medium op het gesneden cerebellum. Met behulp van een wide-boring Pipetteer tip geplaatst op een pipet 1 mL, langzaam het gesneden cerebellum gecombineerd en breng dit terug in de 60 mm cel cultuur schotel met ijskoude dissectie medium (zie schema op figuur 1Bb'').</li>
	<li>Reinig de weefsel chopper van kunststof platform met 100% ethanol tussen elke cerebellum snijden. Laat de ethanol verdampen alvorens het volgende cerebellum op het platform te plaatsen.</li>
	<li>Gebruik twee boete-straight pincet (of als alternatief titanium naalden) om te scheiden van de afzonderlijke segmenten en selecteer 6-8 segmenten van de vermis (zie schema op figuur 1Cc en 1Cc').</li>
	<li>Nemen van een 6-well plaat met inzetstukken van de cultuur en de overdracht van maximaal 4 geselecteerde segmenten op één cultuur invoegen samen met een dissectie medium, met behulp van een tip van de wide-boring Pipetteer aangepast op een pipet 1 mL (zie schema op figuur 1Cc').</li>
	<li>Plaats van de segmenten in het midden van de cultuur invoegen met behulp van de dissectie medium of pincet te duwen en trek ze voorzichtig in de juiste locatie, om deze om te worden met elkaar in contact te vermijden (zie schema op figuur 1Cc').</li>
	<li>Verwijder eventuele overmaat van dissectie medium rond de segmenten met behulp van een dun-einde pipette uiteinde. Zorgen dat de plakjes plat lag op het membraan (zie schema op figuur 1Cc').</li>
	<li>Plaats de 6-well-plaat in de incubator onmiddellijk na de segmenten op het membraan hebben toegevoegd.</li>
</ol>5. plakjes cultuur en demyelinisatie (Hands-on tijd ≈ 15-20 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
<ol><li>Vervang het kweekmedium met 1 mL per putje van voorverwarmde en gebufferde kweekmedium vers om de 3 dagen na de voorbereiding van het segment.</li>
	<li>Voor demyelinisatie, alle kweekmedium hieronder de cultuur wordt ingevoegd na 6 dagen in vitro (DIV) te verwijderen en te vervangen door 1 mL per putje van voorverwarmde verse kweekmedium dat 0, 5 mg/mL LPC. Incubeer gedurende 15-17 uur bij 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Na incubatie, de inserts te wassen door ze te plaatsen in een petrischaal van 25 mm met 1 mL voorverwarmde kweekmedium. Opmerking: De inserts moeten in contact met het medium, maar niet door haar worden gedekt.</li>
	<li>Onmiddellijk overdracht de cultuur invoegt in een nieuwe 6-well plaat met verse voorverwarmde kweekmedium.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium met 1 mL voorverwarmde verse kweekmedium elke 2-3 dagen tot de segmenten fixatie.</li>
</ol>6. Immunohistochemistry (Hands-on tijd ≈ 1:30-2 h)
Opmerking: Voer de stappen uit 6.1. 6.3. onder een zuurkast. Expositie aan paraformaldehyde (PFA) voorkomen en verwijzen naar het product veiligheid gegevensblad voor voldoende manipulatie en bescherming.
<ol><li>Gebruik pincet te heffen van elke cultuur wordt ingevoegd door het ingedrukt houden van de kunststof rand en verwijder het kweekmedium onder de membraan inzetstukken van elk putje.</li>
	<li>Bevestigen van de cerebellaire segmenten gedurende 30 minuten door toevoeging van 2 mL van 4% PFA in 1 x PBS pH 7.4 op de membraan inserts. Opmerking: Het tijdstip van fixatie is afhankelijk van de fase van de myelinisering bestudeerd: 4 DIV komt overeen met het begin van de myelinisering, 7 DIV aan volledig myelinated segmenten. In het geval van LPC behandeling, 9 DIV komt overeen met het hoogtepunt van demyelinisatie, 11 DIV aan het begin van de remyelination en 14 DIV aan volledig remyelinated segmenten.</li>
	<li>Wassen van de inzetstukken met de plakjes driemaal met 2 mL 1 x PBS gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Scheiden van de segmenten van de membraan inserts onder de binoculair Microscoop met behulp van een 25 x 30 x vergroting, door ze met behulp van een scalpel of een borstel zachtjes te duwen. Ook om te voorkomen dat het risico van beschadiging van de segmenten terwijl ze loskoppelen van het membraan, gebruiken een scalpel te snijden het membraan met de segmenten nog steeds gehecht.</li>
	<li>Breng de zwevende segmenten in de putjes van de plaat van een 4-well met 1 x PBS, met behulp van een penseel.</li>
	<li>De PBS van elk putje gecombineerd en segmenten van-20 ° C gedurende 15 tot 20 minuten vooraf gekoelde 100% ethanol uit te broeden. Deze stap vergemakkelijkt antilichaam penetratie in myelinated vezels.</li>
	<li>De 100% ethanol gecombineerd en wassen eenmaal kort met 1 x PBS en vervolgens tweemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De PBS gecombineerd en de segmenten gedurende 30 tot 45 minuten met een oplossing die 1 x PBS, 5% NGS, de niet-ionogene wasmiddel 0,3% bij kamertemperatuur te blokkeren van niet-specifieke antilichaam fixatie sites uit te broeden.</li>
	<li>De blokkerende oplossing gecombineerd. Geen wassen is noodzakelijk.</li>
	<li>Incubeer de plakjes 's nachts met de primaire antilichamen verdund in het blokkeren van de oplossing bij 4 ° C. Om te visualiseren de myeline op cerebellaire organotypic segmenten, MBP (kip, 1/150 of muis IGg2b, Smi99, 1/200) of PLP (Rat, hybridoma, 1/5 tot 1/10) te gebruiken antilichamen. Opmerking: Om weer te geven van de uitdrukking van meer dan één antigeen in hetzelfde segment, een dubbel- of triple kleuring procedure uitvoeren (Zie Figuur 1 als voorbeeld). Zorgen om uit te voeren de incubatietijd gelijktijdig, primaire antilichamen worden geproduceerd in verschillende soorten. Gebruik vervolgens hun overeenkomstige secundaire antilichamen, gekoppeld aan verschillende fluorophores (Zie Tabel van materialen voor knooppunten en paranodal marker18 antilichamen).</li>
	<li>Op de tweede dag, spoel de plakjes driemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Incubeer gedurende 3 uur met de secundaire antilichamen verdunde oplossing (1/500 verdunning) in het donker bij kamertemperatuur te blokkeren. Opmerking: Optimalisatie van antilichaam verdunnings- en incubatie tijd misschien wel vereist bij het gebruik van andere antistoffen dan degene die zijn beschreven hier.</li>
	<li>Spoel de plakjes driemaal in 1 x PBS gedurende 10 minuten in het donker.</li>
	<li>Onder een binoculaire loep, mount de plakjes op een glasplaatje. 100 µL van 1 x PBS plaats op de dia en breng de plakjes in de PBS met een borstel. Ontvouwen van de segmenten, indien nodig en ze plat op de dia. Verwijder eventuele overmaat van PBS. In het geval dat de immunolabeling wordt uitgevoerd met de segmenten nog steeds verbonden met membranen, monteren met de plakjes geconfronteerd met het dekglaasje aan, met het membraan op de glasplaatje.</li>
	<li>Breng een druppel van montage medium direct op het glas dekglaasje aan en zachtjes betrekking hebben op de segmenten. Gekoppelde dia's kunnen worden opgeslagen voor enkele maanden bij 4 ° C in het donker.</li>
</ol>

<ol><li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Desmazières, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains%3A+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Multiple+Sclerosis+Houndmills+Basingstoke+England%22%5BJournal%5D)">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li>
<li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li>
<li>Fünfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li>
<li>Chang, K. -J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+myelination%3A+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li>
<li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity%3A+activity-dependent+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li>
<li>Nave, K. -A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+the+nervous+system%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li>
<li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li>
<li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li>
<li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li>
<li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nodes+of+Ranvier%3A+Molecular+Assembly+and+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495(2015).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li>
<li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores%2C+and+causes+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Medina-Rodríguez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules%3A+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage%3A+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li>
<li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304(2014).</li>
<li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li>
<li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li>
<li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li>
<li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li>
<li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologia.+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li>
</ol>

De auteurs geen strijdige belangen of belangenconflicten.

Hier, we detail een protocol voor het genereren van een ex vivo model overeenkomt met de muis cerebellaire organotypic segment culturen, aangepast van eerder gepubliceerde methoden15,16,19 en de daaropvolgende myeline immunokleuring van deze preparaten. Deze strategie biedt de mogelijkheid om te visualiseren van myeline onderdelen met een hoge resolutie in zowel gezonde en pathologische staten.
Cerebe...

Neuronen zijn zeer gepolariseerde cellen, die bestaan uit een compartiment somato-dendritische die ingangen ontvangt van haar omgeving en een axon die zorgt voor de generatie en de verspreiding van elektrische impulsen naar andere cellen. Snelle voortplanting en tijdige levering van informatie is essentieel voor de goede werking van het zenuwstelsel. In gewervelde dieren, wordt het door de myelinisering, waardoor verhoging van axonale geleiding snelheid1vergemakkelijkt. Myeline is een gespecialiseerde structuur gevormd door samengeperste lagen van plasmamembraan gegenereerd door de myelinating-glia, namelijk oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) en Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). Zowel in het centraal zenuwstelsel en de PNS, axoglial interacties rijden de vorming van gespecialiseerde axonale domeinen: de knooppunten van Ranvier en hun omliggende domeinen, de paranodes en juxtaparanodes2. De axonale segmenten geïsoleerd door myeline of groeispurt, afgewisseld met de knopen van Ranvier, die overeenkomen met kleine unmyelinated domeinen verrijkt in spanning-gated natrium kanalen (nbv). De hoge concentratie en het snelle activering van nbv kanalen op de knooppunten van Ranvier toestaan de regeneratie van de actie potentieel, en samen met de isolerende eigenschappen van de myeline omhulsels, zorgen voor de geleiding van het efficiënte en snelle saltatory van de zenuw impuls langs de axon3.
Naast haar rol bij het versnellen van de snelheid van de geleiding van de zenuw impuls, ondersteunt myelinating glia metabole de axon, behoud van de lange termijn integriteit en deelnemen aan haar overleving4,5. Bovendien, het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat die myeline is dynamisch gemoduleerd gedurende het hele leven, dus vermoedelijk deel te nemen aan de verordening en de plasticiteit van de verschillende functies van het zenuwstelsel. Aanpassingen van de distributie, aantal, lengte en dikte van myeline omhulsels langs axonen kunnen dus een nieuwe manier om te fijn afstemmen van verschillende netwerken6,-7,8vormen. Dus, de evolutionaire verwerving van myeline is een belangrijke proces voor sensorische, motorische en cognitieve functies en de verstoring van de interactie tussen axonen en glia is steeds meer beschouwd als een bijdrage tot de ontwikkeling of verworven neurologische ziekten9.
Myeline samenstelling heeft gekenmerkt, met de specifieke functie van een hoog percentage van lipiden (70%) in vergelijking met eiwitten (30%) in tegenstelling tot andere cellulaire membranen10. In tegenstelling tot de myeline lipiden zijn meeste van myeline eiwitten echter specifiek voor myeline, met inbegrip van myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwit (PLP), 2', 3'-cyclische nucleotide 3'-fosfodiësterase (NPM), myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG), myeline-Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), PMP-22 en P010. Verschillende histologische methoden om vlek myeline bestaan op basis van de samenstelling van lipide, zoals snel blauwe Luxol11, Soedan zwart B12, Baker's zuur hematin methode13, evenals zilver14kleuring. Deze benaderingen doen echter niet altijd mogelijk voor een voldoende contrast en resolutie te visualiseren van individuele vezels. Een alternatieve benadering voor het detecteren van myeline is door middel van immunohistochemistry gericht tegen myeline eiwitten. Verschillende antilichamen richten van de myeline-specifieke antigenen met een hoge specificiteit en kunnen routinematig worden gebruikt voor het detecteren van myelinated structuren. De antilichaam-antigeen interactie kan verder worden onthuld met behulp van een secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorophore gericht tegen het primaire antilichaam en gevisualiseerd met voldoende fluorescentie microscopie. Hier beschrijven we een immunochemical protocol om vlekken van myeline op ex vivo cerebellaire segmenten, een model dat voor een goede bewaring van de architectuur van zenuwweefsel zorgt. Bovendien, de organisatie en de grootte van het Purkinje-cellen (de enige myelinated neuron van het cerebellum) laten een klassiek model voor elektrofysiologische studies en ze zijn ook ideaal vast of live-imaging studies te verrichten.
De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 muizen, een tijd die overeenkomt met de vroege begin van Purkinje cel myelinisering, een proces dat meestal door één week ex vivo (6-7 dagen in vitro DIV)15 bereikt wordt. Bovendien, dit model is aangepast aan het onderzoeken van demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS), zoals een uitgebreide demyelinisatie kan worden opgewekt in cerebellaire plakjes met behulp van de myelinotoxic-samengestelde lysophosphatidylcholine (of lysolecithin, LPC), die wordt gevolgd door een spontane remyelination16,17. Endogene remyelination plaatsvindt van twee dagen na de LPC verwijdering uit het kweekmedium en is bijna een week na de behandeling te voltooien.
De voltooiing van dit protocol duurt ongeveer 3 weken, met inbegrip van een halve dag voor cerebellaire segment culturen voorbereiding, een week voor volledig myelinated segmenten, gevolgd door 2 dagen te bereiken van het hoogtepunt van demyelinisatie en nog een week voor hun volledige remyelination. Immunohistochemistry kan bovendien worden uitgevoerd in 2 dagen. Het protocol hier beschreven is aangepast aan een standaard nest van 6 muizen pups en moet worden aangepast met betrekking tot het aantal dieren die worden gebruikt voor de geplande experiment.

<table><tbody><tr><td>BME medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s Balanced Salt Solution (10x HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Heat-inactivated Horse Serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin&ndash;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Gey&rsquo;s Balanced Salt Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose Solution (45%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.330</td><td>Gekoeld bij -20&deg;C</td></tr><tr><td>Triton&reg; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>500622</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Solution</td><td>EuroMEDEX</td><td>ET330-A</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td><td>Merck Millipore</td><td>06-896</td><td>Verdunning 1/300</td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td><td>Merck Millipore</td><td>AB9348</td><td>Verdunning 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1019</td><td>Verdunning 1/200</td></tr><tr><td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td><td>Gift van Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td><td></td><td>Verdunning 1/5 tot 1/10</td></tr><tr><td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8809</td><td>Verdunning 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td><td>Abcam</td><td>ab34151</td><td>Verdunning 1/500</td></tr><tr><td>Goat Secondary Antibodies geconjugeerd met Alexa Fluor 488, 594, 647 of 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>Verdunning 1/500</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkapper</td><td>McIlwain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vuilmesjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote schaar</td><td>F.S.T</td><td>14101-14</td><td></td></tr><tr><td>Kleine schaar</td><td>F.S.T</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Fijne rechte pincetten</td><td>F.S.T</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen fijne pincetten</td><td>F.S.T</td><td>11297-00</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur schaaltjes (60 mm en 100 mm)</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-, 6-well culture plates</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell culture inserts (0,4 &micro;m, 30 mm diameter)</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Celcultuur incubator</td><td></td><td></td><td>37&deg;C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Fijne punt pipette tips</td><td>Dutscher</td><td>134000CL</td><td></td></tr><tr><td>Breedbuik pipette tips</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079G</td><td></td></tr><tr><td>Steriele spuit</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>20 of 50 mL</td></tr><tr><td>Steriele spuitfilters</td><td>Terumo Europe</td><td></td><td>0,22 &micro;m</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>Borstel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>RS France</td><td></td><td>76 mm x 26 mm x 1,1 mm</td></tr><tr><td>Glazen dekglasjes</td><td>RS France</td><td></td><td>22 mm x 22 mm</td></tr><tr><td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>5511</td><td></td></tr><tr><td>Binoculaire microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en immunokleuring van myelinating organotypic cerebellaire segment culturen

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

In het zenuwstelsel, de myeline is een complexe membraan structuur gegenereerd door myelinating gliale cellen, welke ensheathes axonen en vergemakkelijkt de snelle elektrische geleiding. Myeline wijziging heeft aangetoond dat het optreden in diverse neurologische aandoeningen, waar het wordt geassocieerd met functionele tekorten. Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een ex vivo model bestaande uit muis organotypic cerebellaire segmenten, die kunnen worden gehandhaafd in cultuur voor verscheidene weken en verder worden aangeduid om te visualiseren van myeline.

Voorbeelden van representatieve myeline immunostainings in organotypic cerebellaire plakjes verkregen P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figuur 2A), evenals PLP-GFP transgene muizen (figuur 2B), samen met Purkinje cellen kleuring. Cerebellaire segmenten myelinate van de witte stof tracks regio van de segmenten naar de periferie van de folia en myelinisering van de cellen Purkinje gebeurt meestal na 6 tot en met 7 DIV. Bij 7 DIV is ...

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Deze methode maakt het mogelijk om het basismechanisme van myelinatie en remyelinatie op cellulair en tissulair niveau te bestuderen. Deze techniek bevindt zich op het kruispunt tussen primaire culturen en in vivo benaderingen. Het is een snel en toegankelijk model met als belangrijkste voordeel van het behoud van de weefselarchitectuur.Het aantonen van de procedure zal Worden Melina Thetiot, een postdoctoraal onderzoeker en Remi Ronzano, een promovendus uit mijn laboratorium. Om te beginnen, steek een kleine schaar zachtjes in de foramen magnum en snijd de schedel door het maken van een laterale incisie naar de zijkant, en snijd dan rondom het hoofd schedel. Om het dorsale deel van de schedel op te halen, gebruik een fijne, rechte tang om het dorsale deel van de schedel zorgvuldig op te tillen.Introduceer vervolgens voorzichtig de tangen tussen de ventrale schedel en de hersenen. Draai voorzichtig de hersenen uit en snijd de optische en trigeminuszenuwen met een kleine schaar. Draai vervolgens het hoofd of het dorsale deel van de schedel ondersteboven net boven een 60 millimeter celcultuurschotel met ijskoud dissectiemedium om de hersenen te helpen dalen door de zwaartekracht.Met behulp van fijne tangen, oriënteren van de hersenen met de rug kant naar boven en de ventrale kant liggen. Onder de verrekijker microscoop, gebruik maken van de fijne, rechte tangen om de hersenen immobiliseren aan de voorhersenen kant. Scheid vervolgens de achterhersenen van de rest van de hersenen.Snijd de cerebellar peduncles onder het cerebellum om het cerebellum te scheiden van de rest van de achterhersenen. Zodra het cerebellum is geïsoleerd, gebruik dan fijne, rechte tangen om de hersenvliezen voorzichtig weg te scheuren. Houd het cerebellum voorzichtig vast met de fijne, gebogen tangen en plaats het met de rugzijde op het plastic platform, loodrecht op het scheermesje van de haker.Vervolgens, met een steriele, dunne eind pipet tip bevestigd aan een een milliliter pipet, aspirate elke toegang van dissectie medium rond het cerebellum. Dan, met een weefsel chopper, slice 300 micrometer dikke saggital secties van het cerebellum. Voeg vervolgens voorzichtig een druppel dissectiemedium toe aan het gesneden cerebellum.Dan, met een breed zwijn pipet tip bevestigd aan de een milliliter pipet, langzaam aanzuigen van de gesneden cerebellum en breng het terug in de 60 millimeter cel cultuur schotel met ijskoud dissectie medium. Gebruik vervolgens twee fijne, rechte tangen om afzonderlijke segmenten te scheiden. Dan, met een breed zwijn pipet tip bevestigd aan de een milliliter pipet, overdracht tot vier geselecteerde plakjes van de vermis, samen met een aantal dissectie medium op een cultuur insert van een zes put plaat.Verwijder elke toegang van dissectie medium rond de plakjes met behulp van een dunne einde pipet tip. Voor demyelinatie, verwijder alle cultuur medium onder de cultuur inserts na zes dagen in vitro, en vervang het met een milliliter per put van de voorverwarmde, verse cultuur medium met 0,5 milligram per milliliter LPC. Incubeer gedurende 15 tot 17 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide milieu.Na incubatie, was de inzetstukken door ze te plaatsen in een 25 milliliter petrischaal met een milliliter van voorverwarmd kweekmedium. Breng vervolgens onmiddellijk de cultuurmesels over in een nieuwe, zes putplaat, met vers, voorverwarmd cultuurmedium. Om te beginnen met immunohistochemie, gebruik eerst tangen om cultuur inserts lift en verwijder de cultuur medium eronder.Voeg vervolgens twee milliliter van 4%PFA in 1x PBS, ph 7.4, toe aan de membraanwisselplaten om de cerebellar-plakjes te bevestigen. Na 30 minuten, was de plakjes drie keer met twee milliliter van 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Vervolgens, onder de verrekijker microscoop, met behulp van een 25x tot 30x vergroting, gebruik maken van een scalpel of een borstel om voorzichtig los te maken van de plakjes van het membraan inserts.Gebruik vervolgens een borstel om de drijvende plakjes over te brengen in de putten van een vier putplaat, met 1x PBS om het antilichaamverbruik te beperken. Vervolgens, aspirate de PBS van elke put en de plakjes in voorgekoelde 100% ethanol bij min 20 graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten uitbroeden. Na incubatie, aspirate de 100%ethanol en was de plakjes kort met 1x PBS.Was ze vervolgens twee keer op kamertemperatuur met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Om niet-specifieke antilichaamfixatieplaatsen te blokkeren, de PBS aan te trekken en de plakjes uit te broeden in een oplossing die 1x PBS, 5%NGS en 0,3% niet-ionisch wasmiddel gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur bevat. Voeg vervolgens primaire antilichamen verdund in de blokkerende oplossing en inculbaat van de plakjes op vier graden Celsius 's nachts.Na nachtelijke incubatie, was de plakjes drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voeg vervolgens de secundaire antilichamen, verdund in de blokkeringsoplossing, bij één tot 500 verdunningsverhouding toe en broed de plakjes bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie uur uit. Na incubatie met het secundaire antilichaam, was de plakjes drie keer in 1x PBS in het donker gedurende 10 minuten elke wasbeurt.Plaats vervolgens onder een verrekijkermicroscoop 100 microleters van 1x PBS op de glijbaan en breng met een borstel de plakjes over in de PBS en vlak ze af op de glijbaan. Verwijder elke toegang tot PBS. Tot slot, plaats een druppel montagemedium direct op de glazen deksel slip en voorzichtig de plakjes te bedekken.Myeline immunostainings in organotypic cerebellar plakjes, verkregen uit postnatale dagen 9 tot 10 C57 zwarte zes wilde type muizen werden waargenomen op 11 dagen in vitro met knooppunten van ronviae verrijkt in spanning gated natrium kanalen, geflankeerd door het paranodal axoglial knooppunt domein. Dezelfde resultaten werden waargenomen voor PLP-GFP transgene muizen. Myelinatie van de parkengy cellen wordt meestal bereikt na een week in de cultuur.LPC-behandeling demyelineert de plakjes volledig, die spontaan remyelineren en zes dagen na demyelinatie volledig zijn gemyelineerd. Deze procedure moet maximaal 25 minuten duren. Het is echt het meest kritieke punt.Organotypic slice cultuur zijn geschikt voor live imaging studie van myeminatie dynamiek. Het kan ook worden gebruikt voor het richten van drugs screening experimenten. Deze techniek maakt een eenvoudige, kwantitatieve benadering mogelijk om myelinatie- en remyelinatieprocessen te bestuderen.De onderzoekers moeten de basisveiligheidsprocedures volgen die op dierenwelzijn, bovenmatig en scherp myelinatie van toepassing zijn.

preparation-immunostaining-myelinating-organotypic-cerebellar-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze methode beschrijft de generatie van organotypische cerebellaire culturen en het effect van bepaalde apoptotische stimuli op de levensvatbaarheid van de verschillende cerebellaire celtypen.

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

We beschrijven een protocol dat toelaat om en kwantitatief beoordelen van de morfologie van de dendritische structuur van afzonderlijke Purkinje cellen gekweekt in organotypische cerebellum slice culturen. Dit protocol is bedoeld om studies te bevorderen over de mechanismen van Purkinje cel dendritische ontwikkeling.

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

This video describes a method to generate tissue slices from the mouse cerebellum. The cerebellar slices can be used for organotypic culturing that provides insights into neurodevelopmental mechanisms, including myelination dynamics.

Cerebellum Dissection and Slice Preparation: A Method to Generate Tissue Slices from Mouse Cerebellum

This video illustrates a technique for obtaining cerebellar organotypic slices from a mouse pup's brain and culturing the slices in media supplemented with nutrients and growth factors to mimic cerebellar development in vitro. Additionally, specific cerebellar slices are treated with a test compound, and the compound's neuroprotective ability is analyzed using an immunofluorescence staining technique.

Analyzing Purkinje Cell Survival in Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Een techniek om NG2-cellen en oligodendrocyten te bestuderen met behulp van een slice-kweeksysteem van de voorhersenen en het cerebellum wordt beschreven. Deze methode maakt onderzoek van de dynamica van proliferatie en differentiatie van cellen binnen de oligodendrocytlijn mogelijk, waarbij de extracellulaire omgeving gemakkelijk kan worden gemanipuleerd terwijl de weefselcytoarchitectuur behouden blijft.

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

Hier beschrijven we een techniek voor het bestuderen van de hippocampus postnatale neurogenese met de organotypische slice cultuur techniek. Deze werkwijze maakt in vitro manipulatie van volwassen neurogenese en maakt de directe toepassing van farmacologische middelen aan de gekweekte hippocampus.

Organotypische Slice Culturen voor Studies van Postnatale Neurogenese

Tijdens de postnataal ontwikkeling van de cerebellum, vertonen onrijpe granulecellen afkomstig uit de germinale zone verschillende modaliteiten van migratie om hun uiteindelijke bestemming te bereiken en neuronale netwerken te vestigen. Dit protocol beschrijft de bereiding van cerebellaire plakjes en de confocale macroscopische benadering die wordt gebruikt om de factoren die neuronale migratie reguleren te onderzoeken.

Ex vivo beeldvorming van postnatale cerebellaire Korrel Cell Migration met behulp van confocale Macroscopie

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Cerebellaire granule uitwendige laag is de plaats van de grootste doorvoer versterking in de zich ontwikkelende hersenen. Hier presenteren we een protocol voor genetische modificatie om deze laag te richten op het hoogtepunt van proliferatie via ex vivo elektroporatie en cultuur van cerebellaire plakjes uit embryonale dag 14 kippenembryo's.

Ex Vivo Cultuur van Chick Cerebellaire Slices en Ruimtelijk Gerichte Elektroporatie van Korrel cel precursoren

Organotypische segment culturen zijn een krachtig hulpmiddel om neuroontwikkelingsof degeneratieve/regeneratieve processen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol dat de neuroontwikkelingsdood van Purkinje-cellen in muizen cerebellaire segment culturen modelheeft. Deze methode kan profiteren van onderzoek in neuroprotectieve Drug Discovery.

Purkinje-celoverleving in Organotypische cerebellaire segment culturen

Leer organotypische snijculturen van muizen cerebellum voorbereiden en immunokleuring toepassen om myelinisatie en remyelinisatie te bestuderen. Deze methode behoudt weefselarchitectuur en ondersteunt live imaging en drugsontwikkeling.

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Meer video's verkennen