Een High-throughput Shigella-specifieke bactericide Assay
27 februari 2019
Hier presenteren we een protocol voor het meten van de Shigellacidal activiteit van antilichamen in het serum. Serum is vermengd met bacteriën en exogene aanvulling, geïncubeerd, en het reactiemengsel is verguld op agar platen. Levensvatbare bacteriën vormen kolonies die zijn geteld, met behulp van een geautomatiseerde kolonie enumerator, en gebruikt om te bepalen van de bactericide titer.
Het Shigella onderzoeksveld mist momenteel goed gedefinieerde testen om de functionele rol van antilichamen gegenereerd door immunisatie of infectie te onderzoeken. Deze test vertegenwoordigt een goed gedefinieerde methode om deze immuunreacties te kwalificeren en bactericide activiteit van Shigella specifieke antilichamen te meten. Het belangrijkste voordeel van deze test is dat het zorgt voor een hoge doorvoeranalyse van meerdere monsters.
De technieken die in dit protocol worden gebruikt, verminderen de hands-on tijd en de totale testtijd om directe bacteriële doden van antilichamen en serummonsters te meten. Om te beginnen, incubeer de monsters in een warm water bad op 56 graden Celsius gedurende 30 minuten te verwarmen en activeren van de testmonsters. Verkrijg een testplaat en 20 microliter van de testbuffer voor de kolommen één tot en met twaalf rijen A tot en met G.Voeg 20 microliter testbuffer toe aan kolommen één en twee van rij H.Load 30 microliter van elk testmonster en dupliceer tot rij H van de testplaat.
Gebruik een meerkanaals pipet om 10 microliters uit putten 3H tot en met 12H te verwijderen om drievoudige seriële verdunningen van de testmonsters uit te voeren. Breng de monsters naar de overeenkomstige putten in rij G en pipet op en neer 8 tot 10 keer om het monster goed te mengen. Verwijder vervolgens 10 microliter uit deze putten.
Breng over op de overeenkomstige putten in rij F en pipet op en neer 8 tot 10 keer te mengen. Zet dit seriële verdunningsproces voort door middel van rij A.Na het mengen van de putten in rij A, verwijderen en weggooien 10 microliters uit putten 3A tot en met 12A, zodat het uiteindelijke volume in alle putten is 20 microliters. Haal een flesje bevroren doel bacteriële voorraad en ontdooien bij kamertemperatuur.
Verdun vervolgens de bacteriën in 20 milliliter testbuffer. volgens de vooraf bepaalde optimale verdunningsfactor. Met behulp van een multi-channel pipet, voeg 10 microliter van verdunde bacteriën aan elke put van de testplaat.
Haal een flesje bevroren Baby Rabbit Compliment en een flesje bevroren warmte geactiveerd BRC. Gebruik koud stromend water om de flesjes te ontdooien tot kamertemperatuur. Meng vervolgens 100 microliters warmtegeactiveerde BRC met 400 microliter testbuffer.
Voeg 50 microliters van deze 20 procent warmte geactiveerde BRC-oplossing toe aan alle putten in kolom één. Meng een milliliter van inheemse BRC met vier milliliter van testbuffer. Voeg 50 microliter van dit mengsel van 20 procent toe aan alle putten in de kolommen twee tot en met twaalf.
Plaats de plaat een een plaat shaker gedurende 10 tot 15 seconden om voorzichtig mengen van de testplaat. Broed de testplaat twee uur lang in een microbiologische incubator. Verwijder ondertussen de deksels van de twee LB Agar-platen en plaats de platen 40 tot 60 minuten in een biologische veiligheidskast om te drogen.
Wanneer de incubatie is voltooid, breng je de testplaat 10 tot 20 minuten in nat ijs en incubbate om de reactie te stoppen. Met behulp van een twaalfkanaals pipet, meng de putten in rij H en spot plaat 10 microliters van het reactiemengsel op de bodem van een LBA-plaat. Kantel onmiddellijk de plaat en laat de vlekken ongeveer 1,5 tot 2 centimeter lopen.
Herhaal deze procedure voor rijen G, F en E en plaats ze boven de vorige rij. Broed de LBA-platen bij kamertemperatuur tot de oplossing in de LBA-platen wordt opgenomen. Doe vervolgens de deksels op de platen en breng ze ondersteboven in een microbiologische incubator om 's nachts uit te broeden.
De volgende dag, voeg 25 milliliter van overlay Agar op 55 graden Celsius, met 100 microgram per milliliter TTC en 0,1 procent natrium azide aan elke LBA plaat. Incubeer op 37 graden celsius gedurende twee uur om de overlevende bacteriën om een rode kleur te ontwikkelen. Gebruik vervolgens een digitale camera om de platen te fotograferen.
Breng de afbeeldingen over naar een computer en gebruik de geïntegreerde kolonie opsommen van NIST om de afbeeldingen te analyseren zoals beschreven in het tekstprotocol. Representatieve LBA-platen tonen aan dat kleurontwikkeling heeft plaatsgevonden na de nachtelijke incubatie en overlay toevoeging, met alle overlevende kolonies zichtbaar in het rood. Bacteriële doden is duidelijk te zien voor alle monsters getest in de eerste drie verdunningen.
Een afname van bacteriële doden wordt gezien als monsters verder op de plaat worden verdund en het serum minder geconcentreerd is. Microkolonie tellingen worden vervolgens uitgevoerd met behulp van de NIST software. De gemiddelde CFU-telling voor elke verdunning van elk monster wordt vervolgens berekend, evenals de waarde van 50 procent.
Deze 50 procent doden waarde wordt vervolgens toegepast op de gemiddelde CFUs voor elke serum verdunning om de waarden die nodig zijn om de SBA KI te berekenen te bepalen. Dit protocol is gebaseerd op consistente en uniforme bacteriële beplating op LB Auger. Goede spot beplating en kanteltechniek zal zorgen voor de groei van discrete microkolonies en nauwkeurige kolonie tellen. Deze techniek maakt gebruik van levende virulente Shigella en vereist de juiste aseptische techniek en PPE om ervoor te zorgen dat de bacteriën veilig worden behandeld volgens BSL 2 procedures.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het meten van de Shigellacidale activiteit van antilichamen in serum. De methode maakt hoge doorvoeranalyse mogelijk en vermindert de hands-on tijd terwijl de bactericide activiteit van Shigella-specifieke antilichamen wordt beoordeeld.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Microbiologie
- Serologie
Achtergrond
- Het Shigella-onderzoeksgebied mist gedefinieerde assays voor het onderzoeken van antilichaamreacties.
- Dit protocol kwalificeert immuunreacties en meet bactericide activiteit.
- Het maakt efficiënte analyse van meerdere monsters mogelijk.
- Gebruikt levende virulente Shigella onder BSL 2-condities.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare assay vast te stellen voor het meten van Shigellacidale activiteit.
- Om de evaluatie van immuunreacties van immunisatie of infectie te vergemakkelijken.
- Om een methode te bieden die de hands-on tijd minimaliseert en de doorvoer maximaliseert.
Gebruikte methoden
- Hitte-activatie van serummonsters.
- Drievoudige seriële verdunningen van testmonsters.
- Inoculatie van assayplaten met verdunde bacteriën en complement.
- Kolonietelling met behulp van geautomatiseerde software na incubatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van bacteriedodende activiteit over verschillende verdunningen.
- Duidelijke visualisatie van overlevende kolonies in rood na incubatie.
- Kwantificering van CFU-tellingen en bepaling van 50% dodelijkheidswaarden.
- Demonstratie van de betrouwbaarheid en efficiëntie van de assay.
Conclusies
- Het protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het beoordelen van antilichaamfunctie.
- Het verbetert het begrip van immuunreacties op Shigella.
- Toekomstige toepassingen kunnen onderzoek naar vaccineffectiviteit omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput Shigella-specific serum bactericidal assays (SBAs) address a critical gap in functional antibody evaluation for vaccine and immunotherapy development. By enabling robust, reproducible quantification of bactericidal activity, this assay supports predictive confidence in early discovery and translational research. Its standardized, scalable workflow enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement for Shigella-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of functional antibody-mediated bacterial killing for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying immune effector function against Shigella.
- Facilitates comparative evaluation of candidate antigens or immunization strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, high-throughput platform for screening serum samples across multiple conditions.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization and cross-lab comparison.
- Reduces manual labor and increases throughput using 96-well plates and automated colony counting.
Translational & Preclinical Research
- Enables assessment of functional antibody responses pre- and post-antigen exposure in preclinical models.
- Supports translational biomarker development by linking bactericidal titers to protective immunity.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation for vaccine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This SBA protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical evaluation, providing a standardized readout for functional antibody activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-mediated bacterial clearance and immune mechanism elucidation.
- Screening: Offers reproducible, quantitative bactericidal titers for candidate and cohort comparison.
- Analytics: Utilizes automated colony enumeration and 50% killing index calculations for robust data outputs.
- Translational Research: Aligns functional antibody measurements with preclinical and clinical immune response endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, transferable assay platform for multi-site and multi-program deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and functional immune response assessment.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, reducing labor and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing standardized, quantitative functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vaccine and immunotherapy candidates based on functional antibody activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, microbiology, and aseptic technique for BSL-2 pathogens.
- Needs access to 96-well plate handling, automated colony counting software, and microbiological incubators.
- Demands cross-team standardization for assay setup, plating, and data analysis.
- Adaptable to various serum sources and Shigella strains with protocol optimization.
- Live virulent Shigella use necessitates strict biosafety and PPE compliance.
