Name: Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Leer het zaaien en implanteren van een biosynthetisch weefsel-geïnjecteerd tracheaal implantaat in een muismodel. Deze methode helpt onderzoekers regeneratiemechanismen en beenmergmononucleaire cellen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen erkennen van Robert Strouse en de Research Information Solutions & innovaties divisie in landelijk Children's Hospital voor hun steun in grafisch ontwerp. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de NIH (NHLBI K08HL138460).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) in landelijk Children's Hospital.
1. steiger productie
<ol><li>Bereid een polymeer nanofiber voorloper oplossing door: 1) oplossen 8 wt % PET in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol en verwarming van de oplossing tot 60 ° C en door 2) 3 wt % PU in 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Eenmaal afgekoeld, combineren de oplossingen voor het maken van een definitieve polymeer mengsel van PET en PU (20:80).</li>
	<li>Electrospin de PET+ PU-oplossing op een Inox staafjes diam. (1 mm diameter) met behulp van een naald van 20 G botte uiteinde op een 60 mL spuit gevuld met de PET:PU oplossing met behulp van een hoogspannings-DC power supply ingesteld op + 14 kV op de naald, een andere hoogspannings-DC power supply ingesteld op -3 kV , een debiet van 5 mL/h en een afstand van 20 cm tip-naar-substraat. De staaf van 350 toeren per minuut draaien tijdens vezel afzetting.</li>
	<li>Totdat de electrospinning om de gewenste steiger wanddikte van 300 µm wordt bereikt. Schuif de steiger van de staaf, dan houd het onder vacuüm 's nachts te verwijderen van alle resterende oplosmiddel.</li>
	<li>Het steriliseren van de steiger met behulp van een ultraviolet licht dosering van 350 mJ/cm2 vóór.</li>
</ol>2. het beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MNC) oogsten
<ol><li>Euthanaseren van een 6-8 weken oud, vrouwelijke C57BL/6 muis met een cocktail van ketamine (200 mg/kg), xylazine (20 mg/kg) en ketoprofen (10 mg/kg). Controleer volledige euthanasie door staart-snuifje methode. Zorg ervoor dat lokale richtsnoeren voor euthanasie.</li>
	<li>Onder steriele condities, verwijder de huid over het dijbeen en zijn verbeend bot met behulp van fijn schaar en pincet micro-Adson bloot te stellen. Dumont #5 pincet en Dumont #5/45 pincet gebruiken om de fascia en de pezen te verwijderen. Scheiden van de botten en snijd elk van hen aan de beide uiteinden. Met behulp van een spuit 5 mL en een 25G naald, spoel het beenmerg in een petrischaal met 30 mL Rosewell Park Memorial Instituut (RPMI) media. Filtreer deze RPMI met het beenmerg door een 70 µm nylon cel zeef in een tube van 50 mL.</li>
	<li>Plaats in een kabinet van bioveiligheid, 5 mL van polysurcrose en natrium diatrizoate in een tube van 15 mL. Zachtjes toevoegen de RPMI met het beenmerg mononucleaire cellen langs de zijkant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de twee lagen. Centrifugeer bij 461 x g gedurende 30 min met "rem 1" bij 24 ° C. Opmerking: Op onze centrifuge, rem 1 staat voor de langste uitgeput tijd tijdens het vertragen.</li>
	<li>Uit de drie lagen gevormd, negeren de (roze) toplaag van plasma en verzamelen de middelste (doorzichtig) laag bestaande uit de mononucleaire cellen van het beenmerg. Gooi de neerslag van rode bloedcellen.</li>
	<li>Verdun de beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een 1:1 verhouding en centrifuge op 461 x g gedurende 10 minuten met "rem 9" bij 24 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en verdunnen van de pellet met 5 mL PBS. Centrifugeer bij 461 x g gedurende 10 minuten met "rem 9" bij 24 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en verdunnen van de pellet met ~ 10 mL RPMI.</li>
	<li>Verdun 10 µL van de BM-MNC oplossing met een gelijk volume 0,4% trypan blauw in een tube van 1 mL. Plaats 10 µL van de oplossing in een cel tellen kamer dia. Met behulp van een geautomatiseerde cel counter cellen tellen. Herhaal de stap en het gemiddelde aantal cellen berekenen. Opmerking: Een gemiddelde cel tellen van 1 X 108 cellen is verkregen uit het gebruik van twee muizen van de donor. Dit zou gelijk aan twee dijbeen, en twee zijn verbeend die beenmerg is geïsoleerd uit.</li>
	<li>De BM-MNC oplossing bij 461 x g gedurende 10 minuten met "Rem 9" Centrifugeer bij 24 ° C. Verwijder het supernatant en verdunnen van de concentratie van de cel op 107 cellen/graft. Opmerking: We hebben studeerde efficiëntie tussen 1, 10 en 100 miljoen cellen zaaien en vonden dat 10 miljoen cellen per graft levert de hoogste seeding efficiëntie.</li>
</ol>3. cel zaaien op de transplantaten
<ol><li>Meten van de lengte van de steigers en indien nodig, snijd ze tot een lengte van 5 mm.</li>
	<li>Vooraf nat het schavot met 5 µL van RPMI voor 5 min. verwijderen de RPMI.</li>
	<li>Voeg toe 5 µL van de BM-MNC oplossing aan het lumen van de steiger voor 10 min.</li>
	<li>Passeren van een naald 21G via het lumen van de prothese en de prothese in 1000 µL van RPMI's nachts bij 37 ° C in een broedstoof uit te broeden.</li>
</ol>4. graft implantatie
Opmerking: Zorg moet worden genomen om aseptische techniek tijdens de prothese implantatie procedure.
<ol><li>6-8-week-oude vrouwelijke C57BL/6 muizen als geadresseerden gebruiken voor de cel geplaatste protheses. Enrofloxacin (10mg/kg) injecteren subcutaan 24 uur voor de ingreep en net voordat de incisie.</li>
	<li>Weeg de muis en beheren van een dosis van 0,1 mL/10 g van de verdoving cocktail van ketamine (100 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) en ketoprofen (5 mg/kg) als analgesie intraperitoneally.</li>
	<li>Controleer als het vliegtuig van de verdoving is bereikt door de staart-snuifje methode. Voor het bevestigen van het niveau van sedatie, een steriele ophthalmic zalf van toepassing op de ogen en knippen van de haren op de chirurgische site van kin sleutelbeenderen. Plaats het dier op een pad in een dorsale ligfiets positie. Desinfecteer de chirurgische site met eerst een Povidon-jodium prep pad, gevolgd door een prep pad van alcohol (70% alcohol), en eens te meer een Povidon-jodium prep pad.</li>
	<li>Plaats het dier onder de ontleden Microscoop met haar hoofd weg van de chirurg. Maak een insnijding van de middellijn gaande van de sleutelbeenderen tot op het bot van de hyoid met behulp van fijn schaar en pincet micro-Adson. Reinig de fascia met Dumont #5 en Dumont #7 fijne pincet, samen met een steriel katoenen doekje als nodig en voeg een zelfstandige behoud Colibri oprolmechanisme.</li>
	<li>Open de riem spieren (Figuur 3A) met een Dumont #5 en Dumont #7 fijne Tang bloot het kraakbeen van de schildklier, cricoid kraakbeen en de luchtpijp. Botweg de luchtpijp te scheiden van de terugkerende laryngeal zenuwen die parallel lopen aan weerszijden, gevolgd door ze scheiding van de luchtpijp van de slokdarm (Figuur 3B).</li>
	<li>Met behulp van een naald van 20G en chirurgische marker, vlek het voorste gedeelte van de luchtpijp.</li>
	<li>Identificeren van de luchtpijp en maak een incisie onder de derde ring van de trachea kraakbeen en transect van de luchtpijp met behulp van een paar Vannas-Tübingen voorjaar schaar en een paar fijne pincet Dumont #7. Houd het met de fijne gebogen verlostang en beveiligen de distale luchtpijp aan het borstbeen met behulp van steriele 9-0 nylon Sutuur (geologie) als u wilt maken van een tijdelijke tracheostomy (Figuur 3C). Opmerking: Een alternatieve hechtdraad materiaal dat gebruikt kan worden is de 9-0 PDS voor tracheale implantatie en spier reapproximation.</li>
	<li>Met een naald van 20G en een chirurgische marker, vlek de prothese te vertegenwoordigen het voorste gedeelte.</li>
	<li>De prothese invoegen de proximale-posterior, proximale-laterale implantaat en proximale-anterior hechtingen, in die volgorde met 9-0 steriele nylon hechtdraad (Figuur 3D), Dumont #7 fijne pincet en de houder van een naald.</li>
	<li>Draai de dierlijke 180° om haar staart uit de buurt van de chirurg. Laat de tijdelijke tracheostomy. De distale luchtpijp is onvolledig verbeelde toestaan van het gebruik van de resected segment als een stomp voor retractie. Wanneer niet langer nodig is, is het segment van de luchtpijp 5 MM volledig verwijderd.</li>
	<li>De distale wapendrager voltooien door het plaatsen van de hechtingen op de dezelfde manier als de proximale anastomose.</li>
	<li>Opnieuw onderlinge aanpassing van de positie van de prothese en de spieren van de riem. Sluit de incisie met 9-0 steriele nylon hechtingen in een lopende patroon.</li>
	<li>Subcutaan injecteren van 0,1 mL van buprenorfine (0,1 mg/kg) en plaats het dier in een herstel kooi geplaatst op een verwarming pad zonder andere dieren in de kooi.</li>
	<li>Observeer de muis totdat het bewuste en kundig voor ambulate, dan de muis naar een nieuwe kooi met zacht beddengoed, vochtige chow en medicinale water (ibuprofen, 30 mg/kg) gedurende 48 uur. Na deze periode door de muis te keren naar een normale kooi met andere muizen. Opmerking: Muizen die handhaven van respiratoire nood of activiteit daalde na implantatie worden waargenomen door personeel van het laboratorium en/of dier in een 32 ° C incubator. Als dit zo voor meer dan 48 uur doorgaat, moeten vervolgens de muizen worden euthanized.</li>
</ol>5. histologie en Immunohistochemistry
Opmerking: De haematoxyline en eosine vlekken werden uitgevoerd met behulp van standaard techniek door landelijke kinder ziekenhuis morfologie Core. Immunohistochemistry werd uitgevoerd volgens de onderstaande stappen.
<ol><li>Deparaffinize van de dia's met behulp van xyleen 1) voor 5 min, 2) xyleen gedurende 5 minuten, 3) 100% ethanol voor 5 min, 4) 90% ethanol voor 5 min, 5) 70% ethanol voor 5 min, 6) gedistilleerd H2O (dH2van O) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>De dia's in de citraat buffer onderdompelen en plaatsen in de snelkookpan water gevulde. Verwarm gedurende 10 min laat vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur. Wassen met 0,1% bovien serumalbumine in PBS (BSA-PBS) voor 5 min. spoelen met dH2O. Opmerking: Verwarming kan ook worden gedaan met een warm waterbad of magnetron gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Laat de dia's met 3% normale geit serum in PBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Wassen met 0,1% BSA-PBS voor 5 min. broeden in primair antilichaam met concentraties voor keratine 5 (1:1000)6, keratine 14 (1:250)6 en F4/80 (1:100)7 voor 18u 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Wassen met 0,1% BSA-PBS tweemaal voor 10 minuten elk wassen. Met passende secundair antilichaam bij concentratie van 1:500 voor K5/K14 en 1:300 F4/80 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen. Wassen met 0,1% BSA-PBS tweemaal voor 10 minuten elk wassen.</li>
	<li>Monteren met 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) met montage media en glas cover slips. Laat het zitten voor 30 min vóór imaging.</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
<li>Cole, B. B., Smith, R. W., Jenkins, K. M., Graham, B. B., Reynolds, P. R., Reynolds, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+basal+cells%3A+A+facultative+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tracheal basal cells: A facultative progenitor cell pool.</a> American Journal of Pathology. 177 (1), 362-376 (2010).</li>
<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
<li>Grimmer, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using tissue-engineered cartilage.</a> Archives of Otolaryngology - Head and Neck Surgery. 130 (10), 1191-1196 (2004).</li>
<li>Wood, M. W., Murphy, S. V., Feng, X., Wright, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+in+a+canine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology+-+Head+and+Neck+Surgery+%28United+States%29%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction in a canine model.</a> Otolaryngology - Head and Neck Surgery (United States). 150 (3), 428-433 (2014).</li>
<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Ontwikkeling van een muismodel voor weefsel ontworpen tracheas is essentieel in het begrip van de factoren die hebben beperkte klinische vertaling van de TETGs; namelijk graft ineenstorting, stenose en vertraagde epithelialization4. Een paar factoren die aan deze beperkingen bijdragen omvatten selectie van graft materiaal, het productieproces, de steiger ontwerp en de cel protocollen zaaien. Dit model zorgt voor snellere evaluatie van deze factoren om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire ...

Lange-segment tracheale gebreken kunnen presenteren als zeldzame aangeboren aandoeningen zoals volledige tracheale ringen tracheale agenesie, evenals trauma, maligniteit en infectie. Wanneer meer dan 6 cm in volwassenen of 30% van de trachea lengte bij kinderen, worden deze gebreken niet behandeld door chirurgische reconstructie. Pogingen om de luchtweg vervangen door autoloog weefsel, dode foetussen transplantaties en kunstmatige constructies hebben geteisterd door chronische infectie, granulatie, mechanische storing en stenose.
Weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) kunnen potentieel deze problemen aangepakt terwijl het vermijden van de noodzaak van levenslang bij immuunsuppressie. In het laatste decennium, zijn TETGs getest in diermodellen en klinisch gebruikt in zeldzame gevallen voor gebruik in schrijnende gevallen1,2,3. In zowel de klinische als de grote dierproeven, post-operatieve herstel van weefsel ontworpen airway vervanging vereist vele interventies voor de bestrijding stenose (gedefinieerd als > 50% luminal vernauwing) en onderhouden van de luchtwegen bij. Extra TETG werk heeft getracht om deze stenose door evaluatie van de rol van cel seeding keuze, vascularisatie en steiger ontwerp. Cel seeding keuzes en steiger ontwerp voor het herstel van de inheemse luchtpijp structuur/functie hebben hoofdzakelijk gericht geweest op de luchtwegen epitheliale cellen en chondrocyten ontpit op verschillende resorbeerbare, niet-resorbeerbare en decellularized steigers. Zoals vascularisatie waarschijnlijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van stenose speelt, hebben andere groepen gericht op het optimaliseren van in vitro of heterotopic modellen voor het versnellen van revascularisatie of neoangiogenesis4. Succesvolle vascularisatie ook behoud van een mechanisch bevoegde en functionele TETG bereiken blijft echter een uitdaging. Ondanks de recente vooruitgang blijft minimaliseren van stenose een belangrijke belemmering klinische vertaling.
Om te onderzoeken dit histopathologisch antwoord op TETG implantatie in vivo, ontwikkelden we een schapen model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. De prothese was samengesteld uit een gemengde polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) electrospun steiger bezaaid met beenmerg-afgeleide mononucleaire cellen (BM-MDL). In dit kleine cohort bewezen we dat geplaatste autologe BM-MDL opnieuw epithelialization versnelde en vertraagd stenose5. Hoewel zaaien met autologe BM-MDL verbeterd overleven, blijft de cellulaire mechanisme waarmee BM-MDL de vorming van functionele neotissue moduleren onduidelijk.
Onderzoek op het cellulaire niveau vereist ontwikkeling van een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging. Gelijkaardig aan de schapen studie, wij gebruikt een PET:PU electrospun steiger bezaaid met BM-MDL. Consistent met de schapen model, TETG stenose ontwikkelde in de loop van de eerste twee weken na implantatie1,2,3 ,5. Dit stelde dat de lymfkliertest model gerecapituleerd de pathologie waargenomen eerder, zodat we kunnen verder ondervragen de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de luchtweg stenose.
In dit verslag detailleren wij ons protocol voor weefsel ontworpen tracheale vervanging in het muismodel met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie (Figuur 1, Figuur 2).

<table><tbody><tr><td>0.9% Sodium chloride injectie</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>10cc serologische pipet</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1.5in. Naald</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>1mL Spuit</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25cc serologische pipet</td><td>Falcon</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1in. Naald</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>50cc buis</td><td>BD</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol prep pads</td><td>Fisher Healthcare</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr><tr><td>Baytril (enrofloxacin) oplossing</td><td>Bayer Healthcare, LLC</td><td>NDC 0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>Zwarte polyamide monofilament hechtdraad, 9-0</td><td>AROSurgical Instruments Corporation</td><td>T05A09N10-13</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6, vrouwelijk</td><td>Jackson laboratories</td><td>664</td><td>6-8 weken oud</td></tr><tr><td>Citraat Buffer pH 6.0 20x concentraat</td><td>ThermoFisher</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Colibri retractoren</td><td>F.S.T</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>Wattenstaafjes met katoen</td><td>Fisher scientific</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 14 Monoclonale Antilichaam</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 - Fijne Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 Rat anti-muis antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Fijne schaar- Scherp-bluntje</td><td>F.S.T</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Cover Glasses</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield Montage Media met DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td></td></tr><tr><td>Geit-anti muis IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Geit-anti Konijn IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Geit-anti Rat IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>Jodium prep pads</td><td>Professional disposables international, Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>Keratin 5 Polyclonal Antilichaam, Gezuiverd</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride injectie</td><td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson forceps</td><td>F.S.T</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Niet-geweven sponzen</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>Oftalmische zalf</td><td>Dechra Veterinary products</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (Polyethyleen tereftalaat & Polyurethaan) scaffol</td><td>Nanofiber solutions</td><td></td><td>Op maat besteld</td></tr><tr><td>Petri schotel</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH Naaldhouder/Forceps</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Trimmer</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingen Spring Scissors</td><td>F.S.T</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>Warm water recirculator</td><td>Gaymar</td><td>TP-700</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine steriele oplossing</td><td>Akorn animal health</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

zaaien en implantatie van een biosynthetic weefsel-engineered tracheale graft in een muismodel

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

Behandelingsopties voor aangeboren of secundaire lange segment tracheale gebreken historisch beperkt gebleven als gevolg van een onvermogen om functionele weefsel vervangen. Weefselengineering houdt grote belofte als een mogelijke oplossing met haar vermogen om te integreren van cellen en signalering moleculen in een 3-dimensionale steiger. Recent werk met weefsel ontworpen tracheale transplantaties (TETGs) heeft gezien enig succes, maar hun vertaling heeft is beperkt door de stenose van de graft, graft ineenstorting en epithelialization vertraagd. Om te onderzoeken de mechanismen die deze kwesties rijden, hebben we een muismodel voor weefsel ontworpen tracheale graft implantatie. TETGs werden gebouwd met behulp van electrospun polymeren polyethyleentereftalaat (PET) en polyurethaan (PU) in een mengsel van PET en PU (20:80 percentage gewicht). Steigers werden vervolgens bezaaid met behulp van beenmerg mononucleaire cellen geïsoleerd van 6-8 week-oude C57BL/6 muizen door kleurovergang centrifugeren. Tien miljoen cellen per graft waren uitgezaaid op het lumen van de steiger en toegestaan om te broeden 's nachts vóór implantatie tussen de derde en zevende de tracheale ringen. Deze transplantaties in staat waren om de bevindingen van stenose recapituleren en vertraagd epithelialization zoals blijkt uit de histologische analyse en gebrek aan keratine 5 en keratine 14 basale epitheliale cellen op immunofluorescentie. Dit model zal dienen als een instrument voor het onderzoeken van cellulaire en moleculaire mechanismen die betrokken zijn in het remodelleren van de ontvangst.

Figuur 1 illustreert een schematische voorstelling van TETG zaaien en implantatie. Beenmerg is gekapt uit C57BL/6 muizen en gekweekt in vitro. BM-MDL waren geïsoleerd door dichtheid centrifugeren en ontpit op de TETG. Geplaatste TETGs waren een syngeneic C57BL/6 ontvangende muis ingeplant.
Figuur 2 is een overzicht van de PET:PU TETG steiger productieproces. Pe...

Graft stenose vormt een kritische obstakel in weefsel ontworpen airway vervanging. Om te onderzoeken cellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan stenose, gebruiken we een lymfkliertest model van weefsel ontworpen tracheale vervanging met geplaatste beenmerg mononucleaire cellen (BM-MNC). Hier, detail we onze protocol, met inbegrip van de steiger productie, BM-MNC isolatie, graft zaaien en implantatie.

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

Klinische toepassingen van weefsel-engineered luchtpijp zijn beperkt als gevolg van grafttenose en vertraagde epitheelialisatie. Een muismodel van orthotopische tracheale vervanging maakt de studie van de cellulaire mechanismen die regeneratie drijven mogelijk. Lange segment defecten van de luchtwegen kunnen groter zijn dan wat de huidige therapieën in staat zijn om te genezen.De weefsel-engineered luchtpijp biedt het potentieel om een vervangend orgaan voor deze voorwaarden te creëren. Dit model kan worden toegepast op dieren met transgene en lijntraceringseigenschappen. We kunnen dan moduleren de gastheer factoren die bijdragen aan graft regeneratie.Een van de belangrijkste uitdagingen bij het produceren van de steigers zal zijn het meten en bepalen dat de elektrospinning parameters zijn hetzelfde elke keer. Dus elke keer dat je een steiger produceert, moet je de tip-to-collector afstand, de vochtigheid en de temperatuur meten om ervoor te zorgen dat de steigers elke keer hetzelfde zijn. Cruciaal voor het succes van dit model is verfijning van de microchirurgische technieken en het onderhoud van het juiste verdovingsvlak om spontane ventilatie gedurende de hele procedure mogelijk te maken.Aangezien de gastheer luchtpijp heeft een interne diameter van ongeveer een millimeter, graft en inheemse weefsel behandeling en hechting plaatsing zijn belangrijk en het best visueel aangetoond. Begin met het oplossen van acht gewichts procent polyethyleentereftalaat, of PET, in hexafluoroisopropanol en het verwarmen van de resulterende oplossing tot 60 graden Celsius. Terwijl de oplossing wordt opgewarmd, los drie gewichts procent polyurethaan, of PU, in hexafluoroisopropanol, het combineren van de oplossingen zodra de PET-oplossing is afgekoeld.Laad een spuit van 60 milliliter uitgerust met een 20-gauge botpuntnaald met het polymeermengsel. Gebruik de spuit en een hoogspanningsstroomvoeding die is ingesteld op positieve 14 kilovolt op de naald, een andere hoogspanningsstroomvoeding die is ingesteld op min drie kilovolt, een stroomsnelheid van vijf milliliter per uur en een afstand van 20 centimeter tot substraat tot elektrospin het polymeer op een roestvrijstalen staaf met een diameter van één millimeter die bij 350 rotaties per minuut wordt gedraaid. Blijf elektrospinning tot een 300-micrometer steiger wanddikte is bereikt.Dan, schuif de steiger van de staaf, plaats het schavot onder vacuüm 's nachts om eventuele resterende oplosmiddel te verwijderen, en steriliseren het steiger met een ultraviolet licht dosering van 350 millijoule per centimeter in het kwadraat voor ongeveer 15 minuten. Onder steriele omstandigheden, verwijder de huid uit de achterste ledematen van een zes tot acht weken oude, vrouwelijke, C57-Black/6 muis met fijne schaar en micro-Adson tangen, en gebruik Dumont nummer vijf tangen en Dumont nummer 5/45 tangen om de fascia en de pezen te verwijderen. Scheid de botten om elk van hen te snijden aan beide uiteinden, en gebruik een vijf-milliliter spuit uitgerust met een 25-gauge naald om het beenmerg te spoelen in een petrischaal met 30 milliliter van RPMI medium.Wanneer alle botten zijn gespoeld, filter het beenmerg door een 70-micrometer nylon cel zeef in een 50-milliliter conische buis, en breng de buis naar een biosafety kabinet. Voeg voorzichtig de gefilterde mononucleaire celoplossing toe langs de zijkant van een buis van 15 milliliter met vijf milliliter polysucrose en natriumditrizoaat zonder de lagen te mengen, en scheid het plasma van de witte en rode bloedcellen door dichtheidgradiëntscheiding. Verzamel aan het einde van de centrifugatie de middelste heldere laag bestaande uit de beenmergmonnucleaire cellen en was de beenmergmonnucleaire cellen bij een één-op-één verhouding in PBS door centrifugatie.Resuspend de pellet in vijf milliliter PBS voor een tweede wasbeurt, gevolgd door resuspension in 10 milliliter van verse RPMI medium voor het tellen. Verzamel vervolgens de cellen met een extra centrifugatie en verdun de cellen tot een een keer 10 tot de zeven cellen per vijf microliter van verse RPMI-concentratie. Voordat u het steiger zaait, snijdt u het polymeer zo nodig tot een lengte van vijf millimeter en bevochtig het steiger met vijf microliters rpmi-medium gedurende vijf minuten.Verwijder aan het einde van de incubatie het overtollige medium en laad het steigerlumen met vijf microliter van de beenmergmonnucleaire celoplossing gedurende 10 minuten. Steek vervolgens een naald van 21 meter door het lumen van het schavot en plaats het transplantaat 's nachts in een 37-graden Celsius-incubator. Na inductie van algemene anesthesie, bevestig een gebrek aan reactie op teen knijpen in de ontvanger dier, en van toepassing zalf op de ogen van het dier.Clip het haar op de chirurgische site van kin tot sleutelbeenderen, en plaats het dier op een chirurgische pad in een dorsale ligfiets positie. Met behulp van aseptische techniek, desinfecteren de chirurgische site met een sequentiële povidone-jodium, 70%ethanol, povidone-jodium veeg serie, en beweeg de muis onder een ontleden microscoop met het hoofd op 12 uur. Gebruik fijne schaar en micro-Adson tangen om een middellijn incisie van de sleutelbeentjes aan het tongbeen te maken, en gebruik Dumont nummer vijf en nummer zeven fijne tangen en een steriel wattenstaafje om de fascia schoon te maken voordat u een zelfbehoudende Colibri-oprolmechanisme in de incisie plaatst.Gebruik de tangen om de riemspieren te openen om het schildklierkraakbeen, cricoid kraakbeen en luchtpijp bloot te stellen en de luchtpijp botweg te scheiden van de terugkerende laryngeale zenuwen die parallel lopen aan weerszijden van het weefsel, gevolgd door omtrekscheiding van de luchtpijp van de slokdarm. Met behulp van een 20-gauge naald en chirurgische marker, vlek het voorste gedeelte van de luchtpijp. Maak een incisie onder de derde tracheale kraakbeen ring met behulp van een paar Vannas-Tubingen voorjaar schaar en een paar Dumont nummer zeven fijne tangen om een drie-ring sectie van luchtpijp resect.Houd de luchtpijp met de fijne gebogen tangen, gebruik een steriele 9-0 nylon hechting om het distale uiteinde van de luchtpijp aan het borstbeen te beveiligen om een tijdelijke tracheostomie te creëren, en gebruik de 20-meter naaldmeter en chirurgische marker om het voorste gedeelte van het transplantaat te bevlekken. Om het transplantaat te implanteren, gebruik je een 9-0 steriele nylon hechting, Dumont nummer zeven fijne tangen en een naaldhouder om de proximale achterste, proximale-laterale en proximale voorste steken in te brengen en het dier 180 graden te draaien. Wanneer de muis in positie is, laat u de tijdelijke tracheostomie los en maak een laterale incisie vijf millimeter verwijderd van het voorste gedeelte van het transplantaat om de distale anastomose te vergemakkelijken.Om de distale anastomose te voltooien, plaatst u de hechtingen op een vergelijkbare manier als de proximale anastomose en benaadt u de graftpositie en riemspieren opnieuw. Sluit vervolgens de incisie met 9-0 steriele nylon hechtingen in een looppatroon en plaats het dier alleen in een herstelkooi die op een verwarmingskussen is geplaatst met controle tot volledig herstel. Twee weken na de implantatie kunnen enkele basale epitheelcellen worden waargenomen door basale celkeratine vijf en 14 kleuring in weefsel-engineered tracheale graft weefselsecties.Basale cellen worden ook gedetecteerd op het luminale oppervlak van het transplantaat op zeven dagen na implantatie. Bij explantatie en histologische analyse is grafttenose geïdentificeerd als de belangrijkste factor bij het transplanteren van geïmplanteerde muizen die tekenen van ademhalingsproblemen en stridor vertonen. Merk op dat telescopische van de graft en inheemse luchtpijp is een veel voorkomende bevinding als gevolg van de chirurgische techniek.Kleuring voor F4/80 onthult gastheermacrofagen binnen het stenotische gebied van het transplantaat in combinatie met de aanwezigheid van de basale epitheelcellen. Vermijd manipulatie van de terugkerende laryngeale zenuwen, en zorg ervoor dat de proximale en distale hechtingen op hun plaats zijn om een luchtdichte afdichting bij de anastomose mogelijk te maken. Aangezien dit protocol betrekking heeft op beenmergmonnucleaire cellen die zijn afgeleid van bioveiligheidsniveau één a-agentmuizen, is het belangrijk om passende persoonlijke beschermingsmiddelen te dragen om besmetting te voorkomen.

seeding-implantation-biosynthetic-tissue-engineered-tracheal-graft

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Belangrijke doorbraken in de identificatie van stamcellen wordt voortdurend gemaakt. Voor het vertalen van deze ontdekkingen, moet echter nieuwe methoden voor cellulaire levering worden bedacht. Hier heb ik melden dat de luchtwegen een veilige route voor stamceltransplantatie naar de longen te geven.

Tracheotomie: een methode voor de transplantatie van stamcellen voor de Lung

Deze video laat zien en vergelijkt twee experimentele modellen te bestuderen van de ontwikkeling van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) in muizen, de heterotope en orthotope tracheale transplantatie model.

Heterotope en orthotope Tracheale transplantatie in Muizen worden gebruikt als modellen voor de ontwikkeling van de obliterans luchtwegaandoeningen Study

Om onze kennis van cellulaire en moleculaire neotissue vorming te verbeteren, werd een muizenmodel van het TEVG recent ontwikkelde. De transplantaten werden geïmplanteerd infrarenale vena cava tussenvoeging enten in C57BL / 6 muizen. Dit model behaalt dezelfde resultaten als die bereikt bij onze klinische onderzoek, maar over een veel kortere tijd-cursus.

Implantatie van de vena cava inferior Interpositie Graft in muismodel

Hier presenteren we een protocol om tissue engineered vaartuig enten die functioneel zijn voor het enten in muizen door dubbel zaaien gedeeltelijk geïnduceerde pluripotente stamcellen genereren (PiPSC) - afgeleide gladde spiercellen en PiPSC - afgeleide endotheelcellen op een gedecellulariseerde schip steiger bioreactor.

Generatie en enten van-Weefselmanipulatieproducten Schepen in een muismodel

Laryngotracheale stenose is het resultaat van pathologische litteken afzetting die de tracheale luchtweg kritisch vernauwt en geen effectieve medische therapieën mist. Met behulp van een PLLA-PCL (70% poly-L-lactide en 30% polycaprolactone) stent als een lokale drug delivery systeem, potentiële therapieën gericht op het verminderen van litteken proliferatie in de luchtpijp kan worden bestudeerd.

Ontwerp van een biocompatibele drug-Eluting tracheale stent in muizen met Laryngotracheale stenose

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

Het doel van dit manuscript is om de microchirurgische stappen te beschrijven die nodig zijn om een heterotope larynxtransplantatie bij muizen uit te voeren. De voordelen van dit muismodel ten opzichte van andere diermodellen van larynxtransplantatie zijn de kosteneffectiviteit en de beschikbaarheid van immunologische testen en gegevens.

Een heterotopisch muismodel voor het bestuderen van larynxtransplantatie

Het muizen intrapulmonale tracheale transplantatie (IPTT) model is waardevol voor het bestuderen van obliteratieve luchtwegaandoeningen (OAD) na longtransplantatie. Het biedt inzicht in longspecifiek immunologisch en angiogeen gedrag bij luchtwegvernietiging na allotransplantatie met een hoge reproduceerbaarheid. Hier beschrijven we de IPTT-procedure en de verwachte resultaten.

Intrapulmonale tracheale transplantatie bij muizen: een model voor het onderzoeken van obliteratieve luchtwegaandoeningen na longtransplantatie

Dit artikel beschrijft hoe bio-engineered muizenlongen kunnen worden gemaakt met behulp van decellularisatie- en recellularisatiemethoden. Het beschrijft ook de daaropvolgende orthotope longtransplantatie.

Transplantatie van bio-engineered long met behulp van gedecellulariseerde muizenlongen en primaire menselijke endotheelcellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implantatie van een weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van de muis met behulp van de manchettechniek, waardoor een geschikt diermodel wordt geboden voor het onderzoeken van mechanismen voor de regeneratie van vasculair weefsel.

Implantatie van weefselgemanipuleerd vasculair transplantaat in de halsslagader van muizen via manchettechniek

Leer het zaaien en implanteren van een biosynthetisch weefsel-geïnjecteerd tracheaal implantaat in een muismodel. Deze methode helpt onderzoekers regeneratiemechanismen en beenmergmononucleaire cellen te bestuderen.

Zaaien en implantatie van een Biosynthetic weefsel-engineered tracheale Graft in een muismodel

Meer video's verkennen