Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

Nanoplasmon-enhanced verstrooiing, of nPES, is een eenvoudig en niet-invasief alternatief voor de chirurgische biopsie die tijdrovende en arbeidsintensieve exosoomzuivere zuiveringsstappen kan overslaan, waardoor de toepassing van exosoomanalyse naar klinische instellingen wordt uitgebreid. Deze nPES-test is een snelle procedure om specifieke biomarkers te analyseren op het buitenste membraan van exosomen die geen afzonderlijke isolatie- en zuiveringsstappen vereisen. We hebben alleen een zeer klein klinisch monster nodig voor deze test.

Daarom kan deze methode het gebruik van nPES uitbreiden naar het bestuderen van genetisch gemanipuleerde of PDX-muismodellen. Er zijn een paar stappen in dit protocol die misschien ontmoedigend lijken. Echter, met een paar praktijk loopt, iedereen met fundamentele natte lab vaardigheden kunnen leren om succesvol uit te voeren nPES.

Om te beginnen met de procedure, combineren 40 microliters van een suspensie van NeutrAvidin-gefunctionaliseerde gouden nanorods met 200 microliters van koude, pH zeven fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Centrifugeren het mengsel op 8500 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten, en verwijder de supernatant. Herhaal dit wasproces nog twee keer, en dan resuspend de nanorods in 40 microliters van koude PBS.

Voeg vervolgens 150 microliter koude PBS en 10 microliter van een 0,5 milligram-per-milliliter oplossing van de juiste biotinylated antilichamen aan de suspensie. Meng op vier graden Celsius gedurende twee uur om antilichaam-geconjugeerde gouden nanorods te verkrijgen. Was de nanorods drie keer door centrifugatie in 200 microliter porties koude PBS bij 6500 keer g bij vier graden Celsius gedurende elk 10 minuten.

Daarna, resuspend de gewassen antilichaam-geconjugeerde nanorods in 200 microliters van koude PBS, en bewaar ze op vier graden Celsius voor maximaal 24 uur. Om te beginnen met de voorbereiding van de dia, verdun de gewenste exosoom vangen antilichamen tot 025 milligram per milliliter in PBS. Pipette één microliter van deze oplossing in elke put van een eiwit A/G-behandelde dia die met optisch-rangglas wordt gesteund.

Breng de schuif vervolgens over naar een bevochtigingsdoos om ervoor te zorgen dat putten niet opdrogen tijdens incubatie. Broed de glijbaan een uur lang in op 37 graden Celsius om de vangantilichamen te immobiliseren. Vervolgens, aspirate de resterende oplossing om niet-gebonden antilichamen te verwijderen.

Was de putten door het toevoegen en aspirating een microliter van PBS drie keer. Laad vervolgens snel elke put met één microliter pbs-gebaseerde blokkeringsbuffer en ontcubeer de dia twee uur lang bij 37 graden Celsius. Bij het uitvoeren van ongeveer 15 monsters, moeten we gebruik maken van een single-channel pipet te laden blokkeren buffer op 120 putten in minder dan vijf minuten om de verdamping van blokkerende agent te voorkomen.

Begin met het voorbereiden van een oplossing van antilichaam-geconjugeerde gouden nanorods tijdens het blokkeren van dia's. Ongeveer 30 minuten voor het blokkeren van afwerkingen, snel dooi plasma of serum monsters in een kamertemperatuur waterbad. Vortex de ontdooide monsters gedurende 30 seconden om ervoor te zorgen dat de suspensies homogeen zijn.

Vervolgens, centrifugeren de monsters op 500 keer g gedurende 15 minuten om eiwit aggregaten en ander puin neerslaan. Breng 10-microliter aliquots van de supernatant over naar verse buizen en maak één-op-één verdunningen met PBS. Meng de verdunde monsters door zachte vortexing of inversie naar gelang van het geval.

Wanneer het blokkeren van de dia is voltooid, de blokkeringsbuffer aangezogen en de putten drie keer wassen met één microlitergedeelten pbs. Laad onmiddellijk de monsters in de putten met één microliter per put en acht replica's per monster. Laad exosoom normen in de juiste putten op dezelfde manier.

Broed de glijbaan 12 tot 18 uur in een koelkast bij vier graden Celsius. Dan, aspirate de putten, en was elke put een keer met een microliter van PBS. Laad een microliter van de antilichaam-geconjugeerde gouden nanorod suspensie in elke put, en broed de dia op 37 graden Celsius gedurende twee uur.

Daarna, aspirate de nanorod suspensie, en was de dia in PBS aangevuld met 1%polysorbate 20 gedurende 10 minuten met behulp van een mixer. Vervolgens, aspirate de putten, en was de glijbaan in gedeïsized water gedurende 10 minuten op een roterende mixer. Verwijder het water en laat de glijbaan drogen in een schone petrischaal voordat u de glijbaan naar de donkere veldmicroscoop brengt.

Zet een omgekeerde microscoop uitgerust met een donkere veld olie-onderdompeling condensor, een 4x doelstelling, en een gemotoriseerde fase. Sluit de microscoop aan op een computer via een digitale camera en open de beeldsoftware. Plaats vervolgens de monsterschuif ondersteboven op het microscooppodium en breng een kleine druppel onderdompelingsolie aan waar de condensatorlens de dia ingaat.

Geef het zicht door de microscoop weer in de beeldsoftware. Pas de belichtingstijd aan op een hoge concentratienorm om ervoor te zorgen dat het beeld niet verzadigd is. Open vervolgens het hulpprogramma voor het scannen van grote afbeeldingen en stel de objectieve vergroting in op 10x.

Kies ervoor om de actieve sluiter te sluiten tijdens de fasebeweging en 20 milliseconden te wachten voordat deze wordt vastgelegd. Stel de stiksels overlap in op 20% en selecteer stiksels via het optimale pad. Kies ervoor om een grote afbeelding te maken in de scan.

Stel de camera in om handmatig scherp te stellen aan het begin van de scan en schakel elke 20 velden een automatische stapsgewijze focus in. Kies vervolgens om de linker-, rechter-, boven- en onderkantslimieten voor het doelscanveld in te stellen en het scangebied te definiëren door de microscoopfase naar elk van de gewenste limieten te verplaatsen. Pas vervolgens de focus, de condensor en de gebiedsverlichting aan om een helder, goed verlicht beeld te verkrijgen.

Geef het te maken afbeeldingsbestand een naam en start de scan. Wanneer deze is voltooid, opent u de afbeelding en slaat u deze op 1/8-schaal op. Open de software voor beeldanalyse.

Open vervolgens het menu Plug-ins, klik op DSM-scan, definieer het aantal kolommen en rijen, stel het formaatpercentage in op 25, stel de diameter van de spot in pixels in op 190 tot 200, stel het diameterbereik in op 32 en stel de toenamediameter in pixels in op acht. Stel de lage en hoge DSM-limieten in op nul en 62, de aangrenzende afstand op 100 en de aftrekkende bias op nul. Voer het DSM-algoritme uit en sla de resulterende gegevens op.

De DSM-analysetechniek toonde een goede reproduceerbaarheid voor serieverdunde PANC-1 exosoommonsters variërend van 0,24 tot 1,2 microgram per microliter. Een sterke lineaire correlatie werd waargenomen tussen de scatter respons van de gouden nanorods en de exosoom eiwitconcentratie. Een significant verschil in overvloed aan serumexosomen die de aan kanker geassocieerde biomarker EphA2 uitdrukken, werd waargenomen tussen patiënten met alvleesklierkanker en gezonde patiënten.

Vanaf de toevoeging van het blokkeermiddel verder, snelle en nauwkeurige pipetting is van cruciaal belang om de verdamping van monsters te voorkomen, de invoering van kruisbesmetting, en krassen op het oppervlak van de dia. Na deze procedure voeren we statistische analyses uit om een correlatie te onderzoeken tussen de expressie van de exosomale biomarker van belang en het verschillende stadium van de ziekte dat wordt bestudeerd. Na het opzetten van deze technologie, en we zijn in staat om exosomale biomarkers te vinden voor vroeg stadium alvleesklierkanker.

Momenteel breiden we deze ontdekking uit naar andere vormen van kanker en infectieziekte. Meestal zijn de monsters behandeld in deze test ofwel patiënt monsters of gezuiverd exosoom monsters van kanker cellijnen, die speciale veiligheidstraining noodzakelijk.