Externe Laboratoriumbeheer: Respiratoir Virus diagnostiek

Een toename van de recente epidemieën, zoals het Zika- en ebolavirus, heeft de noodzaak van een meer gecoördineerde en wendbare reactie op wereldschaal aangetoond. Om dit te bereiken hebben we een innovatieve, schaalbare, intramodale laboratoriumeenheid ontworpen die tijdens dergelijke uitbraken wereldwijd kan worden gebruikt in gebieden met beperkte middelen. Hier presenteren we onze intramodale, uitbreidbare, mobiele zeecontainerlaboratoria.

In het volgende artikel presenteren we onze BSL-2- en BSL-3-benadering van de diagnose van het ademhalingsgriepvirus. Snelle influenza virus diagnostiek door RCT-PCR. Houd er rekening mee dat alle BSL-2-veiligheidseisen moeten worden verantwoord voordat u de geïnstalleerde laboratoriumunit wilt betreden.

Dit omvat dressing met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, handen wassen, handschoenen dragen en het ontsmetten van alle werkplekken die u van plan bent te gebruiken. Opmerking, als u bleekmiddel gebruikt om uw werkruimte en benodigdheden te ontsmetten, moet u ook 70% ethanol gebruiken om alle gebieden die aan bleekmiddel zijn blootgesteld, schoon te maken, omdat bleekmiddel kan worden gemengd met andere chemicaliën in de werkruimte om giftige dampen te creëren. Gooi alle bleekmiddelen in hun eigen aangewezen afvalbak.

Als monster swabs worden genomen van patiënten, worden ze vervoerd naar het laboratorium faciliteit van het veld of kliniek en doorgegeven aan de lab technician via de pass-through venster. Dit venster kan niet van beide kanten worden geopend. In het BSL-2 doorgangsvenster moet het buitenoppervlak van buizen met monsters volledig worden ontsmet met bleekmiddel en met rust gelaten worden om twee minuten te zitten.

Open het doorgangsvenster en verzamel de te registreren monsters. Veeg alle monsters die resten van bleekwater hebben, en veeg het interieur van de pass-through venster met bleekmiddel, gevolgd door 70% ethanol oplossing. Voeg streepjescodes toe aan elke monsterbuis en uw vier lege buizen die zijn aangewezen voor aliquots.

Verplaats je monsters naar de ventilatieopening. Scan de barcode op elke buis en zorg ervoor dat de juiste voorbeeldidentificatie-informatie wordt weergegeven op het tabletsysteem of laptopscherm. Voltooi het registratieproces.

Monster aliquot. Zodra de reageerbuizen zijn gelabeld, gebruik maken van een gecertificeerde en ontsmet klasse II bioveiligheid kast om aliquots van monsters te nemen. Bij het nemen van aliquoten moet u verse steriele of wegwerppipetten voor elk monster gebruiken en ze in biogevaarlijke afvalcontainers weggooien om kruisbesmetting te voorkomen.

Zorg ervoor dat elke buis goed is afgesloten en gesloten. Gebruik een aliquot per exemplaar voor onmiddellijke extractie. Bewaar alle andere aliquots in de vriezer voor toekomstig gebruik.

Voordat u naar het werkstation verhuist, reinigt u alle oppervlakken en apparatuur op de werkplek met bleekmiddel, gevolgd door een ethanoloplossing van 70%. Zodra uw barcode PCR monsters zijn aliquoted verplaatsen ze naar een werkstation aangewezen voor extractie. Bereid uw buffer AVL carrier RNA mengsel voor de lyse stap.

Het monster en de lysis buffer master mix moeten op kamertemperatuur worden gehouden. Label een 1,5 milliliter centrifugebuis. Zet de pipetpunt op 560 microliter.

Breng een schone pipettip aan. Voeg een lyse buffer toe aan elke buis. Gooi de tip weg in de afvalcontainer.

Neem vervolgens uw PCR-aliquot-voorbeeld. Plaats het in de voorbereide lysis buffer buis aangewezen voor aliquot een, en herhaal dit voor eventuele extra monsters. Gooi oude pipettip weg en breng een schone pipettip aan.

Breng een schone pipettip aan. Voeg 140 microliter van een buffer toe aan de bedieningsbuis. Sluit elke buis stevig.

Pulse-vortex voor 15 seconden. Herhaal dit met eventuele extra aliquots of monsters. Microcentrifuge elk monster gedurende vijf seconden.

Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Na 10 minuten kort centrifugeren uw buizen om eventuele druppels te verwijderen uit de binnenkant van het deksel van elke buis. Voeg 560 microliter ethanol toe aan het monster.

Verander je pipettip. Herhaal dit met eventuele resterende of extra monsters. Sluit elke monsterbuis stevig.

Pulse-vortex elk monster gedurende 15 seconden. Microcentrifuge de monsters gedurende vijf seconden. Verkrijg een schone opvangbuis van twee milliliter.

Voeg de draaikolommen toe. Label ze aan uw monsters. Breng 630 microliter van het monster over om dienovereenkomstig aan de kolom te voldoen.

Beveilig je petten. Ga naar de centrifuge. Verdeel uw monsters gelijkmatig in de centrifuge.

Centrifuge op 6000 g's gedurende een minuut om de lyse buffer te verwijderen. Ga terug naar het werkstation. Vervang uw inzamelbuizen.

Voeg de resterende lysisbuffer toe en herhaal de centrifugatiestap. Gooi uw originele aliquot monster buizen, waarna, gooi de eluate en was de spin kolom met de buffer AW1. Herhaal deze procedure met elk monster of eventuele extra monsters.

Zet de doppen op elk monster vast en vercentrifuge op zes g's. Herhaal dit met de tweede wasbuffer AW2 bij 20 g' s. Plaats de kolom ten slotte in een schone buis van 1,5 milliliter.

Open de kolom en voeg 60 microliter buffer AVE. Incubate bij kamertemperatuur gedurende een minuut en centrifuge op zes g's gedurende een minuut. Het monster is nu klaar voor PCR-analyse.

Onder BSL-3 voorwaarden experimenteel protocol zal hetzelfde blijven, maar veiligheidsmaatregelen zullen precedent boven alles. Voor het invoeren van de BSL-3 lab kijken door het transparante venster om er zeker van negatieve druk is vastgesteld in de handschoenenkastje eenheid. Het zal duidelijk zijn dat negatieve druk is vastgesteld wanneer de bal in de muur zichtbaar is.

Zodra de negatieve druk is vastgesteld open de deur en voer het apparaat. Was onmiddellijk uw handen en ga dan verder met uw PPE checklist. Ga over tot het aantrekken van de PPE in de volgende volgorde: onder handschoenen, jurk, schoenhoezen, masker, gezichtsschild, tweede paar handschoenen.

Zet de machine aan en laat de druk in het handschoenenkastje stabiliseren. Gebruik een bleekmiddel spray oplossing om alle gebieden te ontsmetten en levert u van plan om binnen en buiten het handschoenenkastje te gebruiken. Gooi alle bleekmiddelafvalproducten in een bleekmiddelcontainer.

Gebruik 70% ethanol oplossing schoon te maken over alle gebieden waar bleekmiddel is gebruikt. Breng uw monsters over via het doorgangsvenster. Monsters moeten zijn bespoten met bleekmiddel oplossing en met rust gelaten voor ten minste een minuut in de pass-through alvorens ze binnen in de BSL-3 eenheid.

Ontvang vervolgens uw monsters in de BSL-3-eenheid en maak ze grondig schoon voordat u doorgaat naar de registratie- en etiketteringsstap. Zodra monsters zijn geregistreerd en buizen zijn gelabeld, plaats de monsters in het dashboardkastje via de luchtsluislade. Open beide deuren niet in één keer.

Open en sluit elke deur in twee verschillende stappen voor veiligheidsmaatregelen. Zodra monsters veilig zijn verplaatst naar het dashboardkastje interieur, volg dezelfde stappen als eerder beschreven voor het maken van monster aliquots in het handschoenenkastje. Zodra monsters zijn aliquoted verplaatsen de monsters in de luchtdichte container.

Spray bleekmiddel oplossing in het handschoenenkastje om buizen en alle andere oppervlakken te ontsmetten. Wacht vijf minuten en breng vervolgens 70% ethanol oplossing aan om het bleekmiddel te wassen. Na grondige ontsmetting verplaatsen alleen de monsters die nodig zijn voor PCR-analyse voor de lysis stap terug in het handschoenenkastje.

Voer in het handschoenenkastje alleen de lysestap van de extractieprocedure uit. Zodra de cellen zijn gelyseerd, sluit u de doppen op elk monster goed af en plaatst u ze in de luchtsluispassage onder druk. Ontsmet het handschoenenkastje opnieuw met bleekmiddel gevolgd door 70% ethanol oplossing.

Verplaats de monsters uit het handschoenenkastje en breng ze over naar het werkstation voor de resterende stappen van de extractieprocedure. Na extractie brengen uw monsters naar het doorgangsvenster voor PCR-analyse. Nadat monsters zijn verwijderd en overgedragen, ontsmet u uw laboratoriumwerkruimte buiten het handschoenenkastje.

Voordat u uw PBM verwijdert, wacht u tot de luchtcirculatie in het apparaat veilig een behoorlijk aantal filtercycli heeft bereikt voordat u begint met het verwijderen van uw PBM. Onmiddellijk na het verwijderen en verwijderen van alle PPE in de PPE afvalcontainer, ga je over tot het wassen van je handen in het lab gootsteen met zeep en water voor het verlaten van het apparaat. PCR-versterking en detectie.

Verwijder de geëxtraheerde RNA-monsters uit het doorgangsvenster. Bereid een master mix in een 1,5-milliliter buis met de volgende componenten voor elke gerichte test: water, primers en sondes, aanval mengsel, en 2X buffer. Vortex en draai je master mix, waarna, aliquot de master mix in elk van de strip buizen.

Breng de PCR-kit terug naar opslag bij de aanbevolen temperaturen zodra de mastermix is bereid. Voeg de monsters toe aan elk van de stripbuizen met behulp van een aparte punt tussen elke stripbuis. Draai de monsters op 1,500 rpm gedurende een minuut, waarna monsters klaar zijn om te worden geladen op de real-time PCR-eenheid.

Zodra monsters op het PCR-instrument zijn geladen, duurt het ongeveer 90 minuten om één run te voltooien. Real-time PCR-test is een gevoelige methode voor robuuste detectie van het virus. Dit is te zien in de tabel met het label:PCR Analyzed Results.

Voordat u uw resultaten verzamelt en het lab verlaat, verwijdert u PPE en ontsmet u elk werkstation adequaat ter voorbereiding van de volgende diagnostische test. Representatieve resultaten. De laboratoriumworkflow is vertegenwoordigd in het diagram dat persoonlijke bescherming benadrukt.

De snelle diagnostische test van influenza wordt uitgevoerd via RT-PCR analyse. De procedure bestaat uit vier hoofdstappen en individuele werkruimten worden toegewezen voor elke fase van het protocol. Het doel van dit project is het valideren van een nieuwe modulaire snel inzetbare laboratoriumfaciliteit en we hebben dit met succes gedaan, evenals het ontwikkelen van trainingsprogramma's voor laboratoriumpersoneel dat werkt in omgevingen met lage hulpbronnen tijdens epidemieën en uitbraken.