Name: Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer hoe u maligne en niet-maligne B-cellen isoleert uit lck:eGFP zebrafish voor onderzoek naar acute lymfatische leukemie. Deze methode helpt bij het bestuderen van het adaptieve immuunsysteem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Megan Malone-Perez zebrafish ziekenverpleger, en de OUHSC stroom cytometry kern. Dit werk werd gesteund door subsidies van Hyundai Hope op wielen, het centrum van Oklahoma voor de vooruitgang van wetenschap en technologie (HRP-067), een pilot-project award van NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF houdt de E.L. & Thelma Gaylord begiftigd Chair in Pediatric hematologie-oncologie van het Children's Hospital Foundation.

Alle procedures waarbij zebrafish werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) op de Universiteit van Oklahoma Health Sciences Center.
1. het isoleren van niet-kwaadaardige B en T-lymfocyten van transgene lck:eGFP vis
<ol><li>Anesthetize de vis met behulp van 0,02% tricaïne (MS-222) in vis systeem water.</li>
	<li>Onderzoeken van 2 – 6 maand oud vis voor TL thymi, die zich bevinden op het aspect van de dorsomedial van de branchial holte van zebravis en andere teleosts14. Gebruik een epifluorescence Microscoop (470/40 excitatie golflengte en 525/50 emissie filter) te detecteren GFP.</li>
	<li>Bereiden in 50 mL filter-gesteriliseerde 1 x Roswell Park Memorial Instituut Medium (RPMI) met 1% foetale boviene serum en 1% penicilline-streptomycine (sorteren media). Ongebruikte sorteren media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.</li>
	<li>De vis euthanaseren door deze te plaatsen in een bekerglas van 0,2% tricaïne voor ongeveer 5 min, gevolgd door ijs bad onderdompeling. Bevestig dood door de beëindiging van de operculaire (gill) beweging.</li>
	<li>Plaats de euthanized vis in een petrischaal en ontleden van lymfoïde organen van belang, met behulp van de fluorescente microscoop te ontleden de GFP+ thymi14, en de lichte microscopie Veldinstellingen de nier merg en milt15ontleden. Resultaten die hier gepresenteerd werden verkregen met behulp van 3 maand-oude vis. Lymfocyt proporties en absolute aantallen variëren per leeftijd en genotype (zie bespreking voor verder detail).</li>
	<li>Plaats elke ontleed orgel in een tube van 1,5 mL met 500 µL van koude media sorteren.</li>
	<li>Meng het weefsel op het ijs met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.</li>
	<li>Gehomogeniseerde weefsel passeren een 35 µm mesh filter voor het genereren van een enkel celsuspensie. Houd de cellen op het ijs tot analyse.</li>
</ol>2. het isoleren van maligne lymfocyten van Double-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP zebravis
<ol><li>
Beginnen bij 2-4 maanden, microscopisch scherm rag2:hMYC; lck:eGFP vis voor abnormale GFP patronen. Opmerking: B cellen zijn GFPlo op de achtergrond van de lck:eGFP , dus B-ALL praktijk vereist te herkennen; T-ALL is duidelijk, omdat T-cellen GFPHallo zijn. Bijgevolg, het rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgene lijn heeft twee fenotypes: helder-belichting fluorescerende T-ALL, die meestal ontstaan uit de zwezerik en uit te breiden naar het lichaam, en vaag-TL B-ALL.<ol>
<li>De vis met behulp van de "lage" belichtingsinstellingen (200 ms, 2,4 x winst) om heldere T-ALL (figuur 1A) en "hoge blootstelling" te identificeren met behulp van een fluorescente microscoop, scherm (1.5 s, 3.4 x winst) om te identificeren dim B-ALL (figuur 1A). WT besturingselementen en vooraf leukemische vis hebben GFP gelokaliseerd alleen in de thymus (figuur 1B).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anesthetize en onderzoeken van de vis zoals beschreven in stappen 1.1-1.2.</li>
	<li>Categoriseren van de vis die op basis van de omvang van GFP fluorescentie, met behulp van een eenvoudig drie categorieënsysteem: Opmerking: Niveau 1: Fluorescentie blijkt als een serie tumor met slechts beperkte lokale verspreiding. Niveau 2: Fluorescentie blijkt dan de thymus, waarbij < 50% van het lichaam. Niveau 3: Fluorescentie overschrijdt 50% van het lichaam.</li>
	<li>Scheid de vis met allemaal van die zonder kanker. Toezicht vooraf leukemische vis (dat wil zeggen, de vis zonder GFP+ tumoren) eens maandelijks voor de ontwikkeling van nieuwe ALL. Door ~ 9 maanden, alle rag2:hMYC, lck:eGFP vis ontwikkelen T-ALL, B-ALL, of beide.</li>
	<li>Voor T - of B-ALL cel isolatie, selecteer niveau 3 vis (alle waarbij > 50% van het lichaam), die opbrengst meer dan 2 x 106 alle cellen, en meestal veel meer.</li>
	<li>Euthanaseren van de vis zoals in stap 1.4. Opmerking: Er zijn twee methoden voor het verkrijgen van alle cellen: hele lichaam homogenisering en een peritoneale wassen techniek16. De methoden verschillen in het absolute aantal cellen verzameld voor het sorteren, en dus de hoeveelheid FACS tijd vereist en kosten (zie bespreking voor verder detail).</li>
	<li>Voor beide methoden, eerst plaatst u de euthanized vis in een petrischaal en het hoofd met inbegrip van de serie regio met een scheermesje, verwijderen. Dit kan apart als gewenst, of voor histologisch kleuring gebruikt worden verwerkt.</li>
	<li>
Peritoneale Wash methode
	<ol>
<li>Met behulp van een pipet P1000, wassen de vis peritoneale holte met 500 µL van koude sorteren van media, het verzamelen van de cellen en de media in een tube van 5 mL.</li>
		<li>Met behulp van een verse pipette uiteinde, injecteren een extra 200-300 µL van koude sorteren media in de lichaamsholte. Vervolgens met behulp van het uiteinde van de pipet, zachte druk uitoefenen op het lichaam van de vis te extruderen van de cellen uit de lichaamsholte. Het verzamelen van deze media en toevoegen aan de tube van 5 mL.</li>
		<li>Herhaal stap 2.8.2 2 tot 3 keer. Houd de verzamelde cellen sorteren van media op het ijs.</li>
		<li>Filter de celsuspensie al een maaswijdte van 35 µm filter voorafgaand aan stroom cytometry/FACS en houden van de cellen op het ijs tot analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hele lichaam homogenisering
	<ol>
<li>Na het verwijderen van het hoofd van de vis, het lichaam in een tube van 1,5 mL met 200 µL van het sorteren van de media te plaatsen.</li>
		<li>Meng het lichaam met behulp van een stamper micro-buis homogenizer.</li>
		<li>Voeg een extra 300 µL van koude media sorteren. Filter de celsuspensie al een 35 µm mesh filter. Sorteer media toevoegen als nodig te wassen van alle cellen door het filter, totdat alleen weefsel puin op het filter blijft. Houd de cellen op het ijs tot analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cytometrische analyse van normale of kwaadaardige B-lymfocyten
<ol><li>Set flow cytometrische analyse en/of FACS parameters volgens fabrikant gids.</li>
	<li>
Gewenste aantal gebeurtenissen te karakteriseren in eerste instantie het monster te verwerven. 1 x 10,4 , 5 x 104 gebeurtenissen vóór sorteren aan de hand van specifieke poorten voor latere sorteren stappen te analyseren.
	<ol>
<li>Poorten bepalen: Define lymfocyt en progenitor cel poorten met voorwaartse scatter (FSC) en kant scatter (SSC) parameters, met uitzondering van cellulaire puin (figuur 2A-C)17. FSC en SSC corresponderen met de cel grootte/diameter en granulariteit, respectievelijk. Opmerking: GFP-, GFPloen GFPHallo cellen verschillen 10-tot-100-Vouw in termen van de intensiteit van de fluorescentie GFP, maken van de scheiding van deze populaties eenvoudig (cijfers 2-5). Live-dode discriminatie kan worden beoordeeld op dit punt met behulp van propidium jodium (PI) of 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) levensvatbaarheid kleuring. Eerdere experimenten met PI typisch tonen > 95% levensvatbaarheid van cellen van het GFP+ na FACS.</li>
		<li>Het uitsluiten van de cel paren, volgens de parameters van de FACS machine wordt gebruikt.</li>
		<li>Binnen de lymfe en/of precursor poorten, bepaalt het aantal en percentage van GFP+ cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik phycoerythrin (PE) en GFP intensiteiten, gate definiëren voor GFP- vs. GFPlo vs. GFPHallo cellen. Opmerking: B cellen dim GFP fluorescentie vertonen en T-cellen in lck:eGFP lijnen helder GFP weergeven. Vele lymfoïde organen of tumor monsters bevatten beide populaties GFP+ . B-bloedlijn cellen/B-ALL GFPlo en T-bloedlijn cellen/T-ALL zijn GFPHallo. Gates onderscheid maken tussen GFP-, GFPloen GFPHallo cellen te definiëren en verzamelen van deze bevolkingsgroepen afzonderlijk (figuur 2A-C, figuur 3A-C, figuur 4A en figuur 5a).</li>
	<li>Sorteren van de bevolking van elke cel in verschillende 15 mL polypropyleen buizen met 2 mL media sorteren, of rechtstreeks in verschillende 1,5 mL tubes met een geschikte buffer voor verdere analyses (bijv. RNA, DNA of eiwit extractie, allo-transplantatie, enz.).</li>
	<li>Houd gezuiverde cellen op ijs voorafgaand aan verdere analyses.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Wij bieden een protocol om te isoleren van de B-cellen uit lck:eGFP transgene zebrafish, het toevoegen van deze tot andere D. rerio modellen met B-bloedlijn etiketten3,4en ontwikkeld. Enigszins verrassend, ging de identificatie van GFPlo B cellen in deze lijn onopgemerkt sinds de bijbehorende beschrijving in 2004. In het algemeen lck wordt beschouwd als T-cel-specifieke6, maar recente studies gevonden ...

Zebravis bieden krachtige kenmerken, zoals genetische oorlogsmachinerie, hoge vruchtbaarheid, optische translucentie en snelle ontwikkeling die studeren gewervelde ontwikkelen met behulp van genetische benaderingen te vergemakkelijken. Deze voordelen, samen met de gedeelde kenmerken van teleost en zoogdieren Haematopoiese, maken D. rerio ideaal voor in vivo analyses van lymphopoiesis en lymfocyt functie, vanaf hun vroegste verschijning in larven in de volwassenheid. Bloed ontwikkeling in zebrafish berust op goed geconserveerde genetische processen die worden gedeeld met zoogdieren, en deze uit te breiden naar het adaptieve immuunsysteem. Moleculaire mechanismen bestuur lymfoïde ontwikkeling zijn bovendien opmerkelijk bewaard tussen zebravis en zoogdieren1.
In de afgelopen 2 decennia, transgene D. rerio lijnen dat etiket specifieke bloed lineages en mutant lijnen tekort aan deze geslachten zijn2,3,4,5gemaakt. Een van deze, de transgene lijn van lck:eGFP , gebruikt de zebravis lymfocyt eiwit tyrosine kinase (lck) promotor voor GFP expressie6. Dit gen, die sterk wordt uitgedrukt door zowel T-bloedlijn precursoren en volwassen T-lymfocyten, kan in vivo bijhouden van de ontwikkeling van de serie T-cel en ex vivo zuivering van T-bloedlijn cellen door FACS7. Eerder, we gebruikten deze regel in een voorwaarts-genetische ENU mutagenese scherm te identificeren germline mutanten vatbaar voor T-ALL en te bestuderen somatically verworven genetische gebeurtenissen gekoppeld aan T cel oncogenese8,9.
Ons laboratorium verder breidden het nut van lck:eGFP zebrafish. In dubbel-transgene rag2:hMYC (menselijke MYC), lck:eGFP D. rerio waarvan bekend is dat het ontwikkelen van T-ALL 10, ontdekten we dat B-bloedlijn allemaal ook optreden11. In tegenstelling tot T-ALL in dit model, die lichten helder als gevolg van hoge GFP expressie, B-ALL zijn vaag-belichting fluorescerende als gevolg van lage GFP niveaus, waardoor vis met B-ALL te onderscheiden Grove van degenen met T-ALL door fluorescent microscopie. Deze differentiële GFP-expressie staat ook de scheiding van GFPlo B-ALL cellen van GFPHallo T-ALL cellen met behulp van FACS11. Bovendien, lage lck expressie is niet uniek voor zebrafish B-ALL, als menselijke B-ALL ook express lage niveaus van LCK11,12. Ook de normale B-bloedlijn cellen van D. rerio, muizen en mensen ook lage niveaus van lckexpress /Lck/LCK, met onrijpe B-cellen die de hoogste expressie11,13. Op basis van het per cel express B-bloedlijn cellen lckeGFP zebrafish of afgeleide regels 1-10% zoveel GFP als T-lymfocyten. Deze GFPlo cellen uitdrukkelijke karakteristiek B-cel mRNAs zoals pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, en anderen, en gezuiverd kan worden uit het beenmerg, thymus, milt of randapparaat bloed11. Daarom beide B - en T-bloedlijn cellen kunnen, geïsoleerd uit lckeGFP zebrafish, en in het geval van rag2hMYC, lckeGFP dieren, B - en T-ALL cellen ook11.
Hier presenteren we ons protocol naar efficiënt FACS-zuiveren niet-maligne B cellen van lck:eGFP zebrafish, en niet-kwaadaardige of kwaadaardige B-cellen van de rag2hMYC; lck:eGFP vis, met behulp van verschillende weefsels van de bron. Deze cellen kunnen eveneens worden gekwantificeerd door stroom cytometry zonder FACS isolatie, indien gewenst. Ontdekking van lage lck expressie- en dus lage GFP expressie-door B cellen opent nieuwe deuren voor experimentele mogelijkheden voor lckeGFP zebrafish, zoals in vivo B cel developmental studies. Dus, deze transgene lijn, eerst gemeld in 2004, heeft nieuw leven zoals we willen gebruiken om te achterhalen van de nieuwe inzichten inzake de zebravis adaptieve immuniteit.

<table><tbody><tr><td>35 &micro;m mesh</td><td>Sefar Filter technology</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tube</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>Zie Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>Versie 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Pestle micro-tube homogenizers</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Transfer pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Zie Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

malignant en non-malignant b cellen isoleren uit lck:egfp zebravis

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) zijn een krachtig model om te studeren lymfocyt ontwikkeling. Zoals zoogdieren bezitten D. rerio een adaptieve immuunsysteem waarin B en T-lymfocyten. Studies van zebravis lymphopoiesis zijn moeilijk, omdat de antistoffen herkennen D. rerio cel oppervlakte markeringen zijn doorgaans niet beschikbaar, complicerende isolatie en karakterisatie van verschillende lymfocyt bevolking, met inbegrip van B-geslacht cellen. Transgene lijnen met geslacht-specifieke fluorophore expressie worden vaak gebruikt voor het omzeilen van deze uitdaging. De transgene lck:eGFP lijn is gebruikt voor het bestuderen van D. rerio T cel ontwikkeling en is ook gebruikt voor model T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie (T-ALL). Hoewel lck:eGFP vis wijd gebruikt zijn voor het analyseren van de T-bloedlijn, zijn ze niet gebruikt om te studeren van B-cellen. Onlangs ontdekten we dat veel zebrafish B-cellen ook express lck, weliswaar op lagere niveaus. Lck:eGFP B cellen express bijgevolg eveneens lage niveaus van GFP. Op basis van deze bevinding, ontwikkeld wij een protocol om te zuiveren van B-bloedlijn cellen uit lck:eGFP zebrafish, die wij hier rapporteren. Onze werkwijze wordt beschreven hoe u gebruik maken van een TL-geactiveerde cel sorter (FACS) om te zuiveren van B-cellen van de lck:eGFP vis of verwante lijnen, zoals dubbel-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP vis. In deze lijnen, B-cellen, zodat vooral onvolwassen B-cellen, uitdrukkelijke GFP op laag maar detecteerbare niveaus, ze kunnen worden onderscheiden van T-cellen, die zeer GFP uitdrukken. B cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg, thymus, milt, bloed of andere weefsels. Dit protocol biedt een nieuwe methode om te zuiveren van D. rerio B-cellen, waardoor studies gericht op onderwerpen zoals B cel ontwikkeling en B-lymfocyt maligniteiten.

We gebruikten stroom cytometry te analyseren en FACS om GFPlo en GFPHallo cellen van zwezerik, beenmerg van de nier en milt van lck:eGFP transgene zebrafish te isoleren. Analyse van 3-maand-oude vis bleek dat de zwezerik bevatte meestal GFP+ lymfocyten. GFP+ cellen werden grotendeels beperkt tot de lymfoïde poort eerder beschreven door Traver et al.17. Twee verschillende populaties van GFP+ , GFPl...

Transgene lck:eGFP zebrafish express GFP zeer in T lymfocyten en zijn gebruikt voor het bestuderen van de T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie. Deze regel kan worden gebruikt voor studie B-cellen, die lck op lagere niveaus uitdrukken. Dit protocol beschrijft zuivering van kwaadaardige en niet-kwaadaardige B-cellen uit lck:eGFP zebrafish.

Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

We hebben onlangs ontdekt dat veel B-cellen in LCK GFP zebravissen lage niveaus van GFP uitdrukken. Dit maakt deze lijn een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van B-cellen en T-cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we nu B-cellen en T-cellen van LCK GFP-zebravissen kunnen bestuderen of dat we B-ALL- en T-ALL-cellen kunnen bestuderen van vissen met kanker.Deze methoden maken B-celontwikkeling en B-ALL-studies bij zebravissen mogelijk. Die relevant zijn voor het begrijpen van het adaptieve immuunsysteem en het is maligniteiten vaak voor bij pediatrische kanker. Als u nog nooit gedaan deze dissecties voordat u wensen om uw techniek te verfijnen een paar keer totdat u verkrijgen goede thymus en merg monsters.Visuele demonstratie zal kijkers helpen om fluorous en B-ALL in vis te herkennen en om de juiste instellingen te selecteren voor het discrimineren van B- en T-cellen voor hun isolatie. Na verdovend met 0,02%Tricaine in vissysteem water gebruik maken van de GFP filter op een epifluorescentie microscoop om twee tot zes maanden oude zebravis te onderzoeken voor fluorescerende thymi op de dorsale mediale aspect van de branchial cavity. Na het lokaliseren van de thymus plaats geëuthanaseerde vis in een petrischaaltje en gebruik de fluorescerende microscoop om de GFP positieve thymi te verwijderen.En brightfield microscopie instellingen om het niermerg en milt te oogsten. Plaats elk verzameld orgaan in een buis van 1,5 milliliter met 500 microliter koud sorteermedium en gebruik een stampermicrotubehomogenis om de weefsels op ijs te homogeniseren. Dan, stam het gehomogeniseerde weefsel door middel van een 35 micrometer mesh filter om een enkele cel suspensie te genereren en plaats de cellen op ijs.Vanaf twee tot vier maanden gebruik maken van een fluorescerende microscoop om dubbeltransgene rag2:hMYC LCK EGFP vissen met behulp van lage blootstelling instellingen om heldere T-cel acute lymfoblastische leukemie of T-ALL en hoge blootstelling instellingen om dim B-ALL dieren te identificeren scherm. Wild type controle en pre-leukemische vissen hebben GFP gelokaliseerd alleen in de thymus. Categoriseer de vis op basis van de omvang van GFP fluorescentie met behulp van een eenvoudig systeem van drie categorieën.Niveau één vissen tonen een fluorescerend signaal als thymische tumor met slechts een beperkte lokale verspreiding. Niveau twee vissen tonen een fluorescerend signaal voorbij de thymus waarbij minder dan 50% van het lichaam. En niveau drie vissen tonen een fluorescerend signaal dat zich uitstrekt tot meer dan 50% van het lichaam.Scheid de vis met ALLE van degenen zonder kanker. En monitor de pre-leukemische vis zonder GFP positieve tumoren eenmaal per maand voor de ontwikkeling van nieuwe ALL. Voor T of B-ALL celisolatie gebruik maken van een scheermesje om het hoofd en thymische regio van een geëuthanaseerd niveau drie vissen te verwijderen en plaats het lichaam in een petrischaaltje.Gebruik een P-1000 pipet om de vis peritoneale holte te wassen met 500 microliter koude sorteermedium, het verzamelen van de cellen en medium in een vijf milliliter buis. Met behulp van een verse pipet tip injecteren twee tot drie extra 200 tot 300 microliter volumes van koude sorteermedium in de lichaamsholte en gebruik de punt van de pipet om zachte druk uit te oefenen op het vislichaam om de cellen uit de lichaamsholte in de vijf milliliter buis extruderen. Dan, stam de cel suspensie door middel van een 35 microliter mesh filter.En plaats de cellen op ijs tot hun analyse door stromingscytometrie. Voor het hele lichaam homogenisatie gebruik maken van een stamper microbuis homogenisator om het lichaam van de vis homogeniseren en voeg een extra 300 microliter van koude sorteermedium aan de buis. Filtreer de celsuspensie door een meshfilter van 35 micrometer en was het filter zo nodig met extra sorteermedium totdat er alleen weefselresten op het filter achterblijven.Plaats vervolgens de cellen op ijs tot hun analyse. Voor flow cytometrische analyse van de geïsoleerde cellen stellen de stroom cytometer parameters volgens de richtlijnen van de fabrikant. En verwerven 10.000 tot 50.000 gebeurtenissen om de voorwaartse verstrooiings- en zijverstrooiingsparameters in te stellen voor het definiëren van de lymfocyten- en voorvadercelpoorten en om het cellulaire puin uit te sluiten.Sluit de celverdu doubletten uit en gebruik de lymfoïde en/of voorloperpoorten om het aantal en het percentage van de GFP-positieve cellen te bepalen. Met behulp van phycoerythrin en de GFP intensiteiten definiëren poorten voor de GFP negatief versus GFP laag versus GFP hoge cellen. Leren waar de poorten te plaatsen voor het isoleren van de GFP lage en GFP hoge cellen is van cruciaal belang voor het verkrijgen van pure B en T cel populaties.Twee verschillende GFP positieve populaties, GFP lage B cellen en GFP hoge T cellen kunnen worden verkregen uit de thymus. B-cellen die in het niermerg van drie maanden oude zebravissen express lage niveaus van GFP. GFP hoge cellen zijn echter schaars, wat aangeeft dat slechts een klein percentage van de T-lymfocyten aanwezig zijn in het merg op drie maanden oud.Ook miltmonsters tonen hogere percentages GFP laag dan GFP hoge cellen. Bij dubbeltransgene vissen die nog geen acute lymfolastische leukemie hebben ontwikkeld, is de GFP-expressie in de thymus, het merg en de milt vergelijkbaar met die bij enkeltransgene LCK EGFP-vissen. Het aantal lymfocyten per orgaan wordt echter verhoogd.Vermoedelijk, als gevolg van MYC gedreven uitbreiding van onvolwassen B en T cel populaties waarin de rag2 promotor actief is. Bij dubbeltransgene vissen met B en of T-ALL die fluorescerende kankers hebben ontwikkeld door zes maanden B-ALL zijn zwak fluorescerende kankers die meestal GFP lage cellen. In tegenstelling, helder fluorescerende vissen kunnen haven ofwel geïsoleerde T-ALL of gemengde populaties van zowel GFP lage B-ALL en GFP hoge T-ALL cellen.Inderdaad, zoals beoordeeld door kwantitatieve polymerase kettingreactie analyse GFP lage cellen uitdrukken hogere niveaus van B-cel transcripties. En GFP hoge cellen uitdrukken hogere niveaus van T-cel genen, LCK en de GFP marker. Het is van cruciaal belang om te leren hoe vis te herkennen met B-ALL door microscopie.En hoe de stroom cytometrie poorten goed te definiëren voor het scheiden van GFP lage en GFP hoge populaties. Na deze procedure u DNA, RNA of eiwit isoleren van GFP low en GFP high cells voor PCR, sequencing, what's in blood or in vivo transplantation experiments. Zodra we geleerd LCK GFB vissen hebben fluorescerende B-cellen in aanvulling op T-cellen konden we beide celtypes van hetzelfde dier te bestuderen om B en T-ALL te evalueren.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Beperkende verdunning celtransplantatie assays worden gebruikt om de frequentie van de tumor voortplantende cellen te bepalen. Dit protocol beschrijft een methode voor het genereren van syngene zebravis dat fluorescent-gelabeld leukemie en details over hoe te isoleren en deze leukemie cellen transplantatie op het beperken van verdunning in de buikholte van de volwassen zebravissen ontwikkelen.

Het kwantificeren van de Frequentie van Tumor voortplantende cellen met behulp van beperkte verdunning Cell Transplantation in syngene zebravis

This protocol describes the technique of isolating fluorescently labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) tumor cells from an adult zebrafish and quantifying them using trypan blue dye.

Fluorescently Labeled T-ALL Cells Isolation: A Method to Isolate T-ALL Cells from Adult Zebrafish

The following protocol describes a method for isolating the side population of T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (T-ALL) tumor cells, consisting of stem cells, from an adult Zebrafish. The side population lacks prominent cell markers and hence we use Hoechst 33342 dye efflux assay to isolate them.

Side Population Assay: A Method to Isolate Side Population of Tumor Cells from Zebrafish

Hier presenteren we een protocol voor celtransplantatie van zebravis skeletspier en embryonaal rabdomyosarcoom (ERMS) in volwassen immuungecompromitteerde rag2E450fs homozygoot mutante zebravissen. Dit protocol maakt een efficiënte analyse van regeneratie en maligne transformatie van spiercellen mogelijk.

Normale en maligne Muscle Cell Transplantation in immuungecompromiteerde Adult zebravis

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.

Zebravismodel van neuroblastoommetastase

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

We gebruikten celproliferatiekleuring om slapende cellen te identificeren in het zebravis T-acute lymfoblastische leukemiemodel. De kleuring wordt vastgehouden in niet-delende cellen en verminderd tijdens celproliferatie, waardoor slapende cellen kunnen worden geselecteerd voor verder onderzoek. Dit protocol biedt een functioneel hulpmiddel om zelfvernieuwing te bestuderen in de context van cellulaire rust.

Identificatie van slapende cellen in een zebravis T-cel acute lymfoblastische leukemiemodel met behulp van celproliferatiekleuring 

Een methode voor het betrouwbaar enten van luciferase-gemerkte menselijke maligne perifere zenuwschede tumorcellen in de heupzenuw van immunodeficiënte muizen wordt beschreven. Het gebruik van bioluminescentie imaging om een ​​goede invoering van de tumor enten en criteria voor willekeurige scheiding van dieren in studiegroepen aan te tonen worden ook besproken.

Orthotope Xenografting van de Mens Luciferase-label maligne perifere zenuwschede tumorcellen voor In vivo Het testen van de kandidaat-therapeutische middelen

Leer hoe u maligne en niet-maligne B-cellen isoleert uit lck:eGFP zebrafish voor onderzoek naar acute lymfatische leukemie. Deze methode helpt bij het bestuderen van het adaptieve immuunsysteem.

Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis

Meer video's verkennen