Name: Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Leer een verbeterde gist one-hybrid methode om transcriptiefactoren te identificeren die binden aan menselijke DNA-sequenties. Deze high-throughput techniek analyseert meer dan 1000 TFs tegelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health [R35-GM128625 naar J.I.F.B.].

1. voorbereiding
<ol><li>
SC −U −H platen (petrischalen 150 mm) Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van de DNA-aas giststammen.<ol>
<li>Los van de drop-out mix, gist stikstof base (YNB), adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met 5 M NaOH (ongeveer 1 mL per liter media; Zie tabel 2 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.</li>
		<li>In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.</li>
		<li>Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C in een waterbad.</li>
		<li>De leucine en het tryptofaan toevoegen aan de media. Meng goed op een bord roer en giet in steriele petrischalen 150 mm (~ 80 mL per schotel). 3-5 dagen bij kamertemperatuur, drogen in plastic zakken verpakken en bewaren bij kamertemperatuur voor maximaal 6 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YAPD rechthoekige platen Opmerking: Deze platen worden gebruikt voor de teelt van het gazon voor de DNA-aas-stam en paring met de TF matrix collectie.<ol>
<li>Los van de poeders (Zie tabel 3 voor samenstelling), met uitzondering van agar, in 950 mL water in een erlenmeyer van 2 L en voeg een roer-bar.</li>
		<li>In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.</li>
		<li>Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar.</li>
		<li>Toevoegen van de glucose, mix goed op een roer plaat en laat afkoelen tot 55 ° C. Giet media in de rechthoekige platen (Zie Tabel of Materials; ~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer voor maximaal 6 maanden. Opmerking: Hoewel het voorgestelde media volume 70 mL per plaat is, kan er 50 – 80 mL per plaat worden gebruikt. De drie kritieke kwesties om te overwegen wanneer gieten platen zijn 1) dat ze worden herverdeeld zodat de agarmedia de zelfde dikte in de plaat heeft (gebruik een geëgaliseerd tabel of oppervlak voor plaat gieten en doen niet giet in stapels van meer dan zeven platen) 2) om de afwezigheid van de bubbels in de agar media (bubbels moeten worden uitgeklapt met behulp van een steriele naald), en 3) de platen voor slechts één dag drogen en verpakken van de platen in plastic zakken om te voorkomen dat storingen in het vastzetten van de gist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −Trp en Sc −U −Trp rechthoekige platen Opmerking: Deze platen zal worden gebruikt voor de teelt van de TF matrix collectie (Sc −Trp) en selecteer diploïde gist na de paring (Sc −U −Trp).<ol>
<li>Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 920 mL water en pH tot 5,9 met NaOH 5M (ongeveer 1 mL / liter van media) (Zie tabel 4 voor samenstelling). Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.</li>
		<li>In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 950 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.</li>
		<li>Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose, meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.</li>
		<li>Voeg de leucine, histidine, en uracil (weglaten van de uracil voor de Sc −U −Trp platen).</li>
		<li>Meng goed op een bord roer en giet in rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en 6 mm slang. Voor 1 dag bij kamertemperatuur drogen, wikkel de platen in plastic zakken en opslaan in de koude kamer voor maximaal 3 maanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal rechthoekige platen Opmerking: deze platen worden gebruikt als uitlezing platen voor eY1H testen.<ol>
<li>Los van de drop-out mix, YNB, adenine hemisulfate en ammoniumsulfaat in 850 mL water (Zie tabel 5 voor samenstelling). Doen niet de pH. Giet in een erlenmeyer van 2 L en toevoegen van een roer-bar.</li>
		<li>In een tweede maatkolf van 2 L, voeg de agar aan 850 mL water (Voeg geen een roer bar als het de agar veroorzaken zal aan de kook in de autoclaaf).</li>
		<li>Autoclaaf gedurende 40 minuten op 15 psi op een vloeibare cyclus.</li>
		<li>10 x BU zouten (1L) voor te bereiden door het combineren van 900 mL water, 70 g gekristalliseerd nb2HPO4∙7H2O en 34.5 g NaH2PO4∙H2O. Mix met behulp van een roer bar te ontbinden poeders en breng de pH op 7.0 met 5 M NaOH. Voeg water tot 1 L en autoclaaf te brengen.</li>
		<li>Bereid de oplossing van de X-gal door 3.5 g X-gal poeder toe te voegen aan een 50 mL plastic buis waarin 42.5 mL dimethyl formamide. X-gal poeder toevoegen aan dimethyl formamide te ontbinden gemakkelijker (dit duurt 30 min). Stockoplossing houden in het donker (gebruik ondoorzichtige 50 ml tube of dekking in folie). Winkel bij-20 ° C.</li>
		<li>Giet onmiddellijk de inhoud van de eerste kolf, met inbegrip van de bar van de roer, in de kolf met agar. Toevoegen van de glucose en de 10 x BU zouten (Zie tabel 5 voor samenstelling), meng goed op een bord roer en afkoelen tot 55 ° C.</li>
		<li>Voeg de leucine, 3AT, en X-gal (Zie tabel 5 voor samenstelling).</li>
		<li>Meng goed op een bord roer en giet in de rechthoekige platen (~ 70 mL per plaat) gebruik een peristaltische pomp (5 mL/sec) en een 6 mm slang. Droge voor 1 dag bij kamertemperatuur, verpakken in plastic zakken, en op te slaan in de koude kamer, bedekt met aluminiumfolie (3AT en X-gal zijn licht gevoelig) voor maximaal 1 maand.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. het spotten van een TF-matrix
<ol><li>
Ontdooien de TF-prooi-array
	<ol>
<li>Ontdooi de gist glycerol voorraad platen met de TF-prooi-array op ijs. Opmerking: TF-prooi matrices kunnen worden gegenereerd als de eerder gepubliceerde10,12,13,18.</li>
		<li>Resuspendeer de gist met behulp van een precisiepipet 12-kanaals binnen 1 – 3 minuten voor de volgende stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De gist spotten in Sc −Trp rechthoekige platen
	<ol>
<li>In de robot HDA (Zie Tabel of Materials), selecteer multi goed 96 platen als bron, 96 agar platen als doelgroep, en 96 lange pin pads. Opmerking: PIN pads zijn niet herbruikbare en moeten worden weggegooid.</li>
		<li>Selecteer het Repliceren vele programma twee kopieën per 96-wells-plaat te maken. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om terug verontreiniging van de bevroren voorraden te voorkomen.</li>
		<li>Selecteer de optie swirl op en neer in de bron te mengen van de gist.</li>
		<li>De gevlekte matrix tas en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genereren van 384 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen
	<ol>
<li>Selecteer in de robot, 96 agar platen als bron, 384 agarplaat als doel en 96 korte pin pads.</li>
		<li>Selecteer het programma van 1:4 matrix . Op deze manier zullen de vier 96 kolonie platen (elk met een verschillende TF) worden geconsolideerd in één 384 kolonie plaat. Gebruik niet de recycle of opnieuw opties om verontreiniging tussen verschillende platen te voorkomen.</li>
		<li>Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 384-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Genereren van 1.536 kolonie arrays in Sc −Trp rechthoekige platen Opmerking: Dit zal resulteren in matrices met vier kolonies voor elke TF-prooi.<ol>
<li>Selecteer in de robot, 384 agar platen als bron, de 1.536 agar platen als doel en 384 korte pin pads.</li>
		<li>Selecteer het programma van 1:4 assay één bron. Het doel is om elke kolonie in vier kolonies te verkrijgen quadruplicates kopiëren. Gebruik de recycle en opnieuw van opties als het gaat om vier keer elke kolonie kopiëren.</li>
		<li>Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Frequentiebanden te versterken van de array 1.536 kolonie in Sc −Trp rechthoekige platen
	<ol>
<li>Selecteer in de robot, 1.536 agar platen als bron, 1.536 agar platen als doel en 1.536 korte pin pads.</li>
		<li>Selecteer het Repliceren vele programma voor 3-4-kopieën te repliceren. Gebruik de recycle en opnieuw optie, maar gooi de pad wanneer u overschakelt op een ander bord van de matrix te voorkomen van kruisbesmetting.</li>
		<li>Tas van de platen en Incubeer de gevlekte 1536-kolonie matrix agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 3 dagen om te gebruiken voor de paring stappen (zie hieronder). Na dat, houden de platen bij kamertemperatuur en kopie weer na 7 dagen voor een nieuwe ronde van screening.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H scherm
<ol><li>
DNA-aas stam gazons voorbereiden paring
	<ol>
<li>Ter plaatse van de gist stammen van de DNA-aas op een Sc −U −H plaat en groeien gedurende 3 dagen bij 30 ° C.</li>
		<li>Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 12 – 16 verschillende stammen past. Incubeer één dag bij 30 ° C.</li>
		<li>Strijk de gist in een 15 cm Sc −U −H plaat met een steriel tandenstoker, zodat elke plaat 4 verschillende stammen past. Incubeer gedurende één dag bij 30 ° C.</li>
		<li>Schraap de gist met een steriel tandenstoker, ervoor niet schraap eventuele agar en toevoegen in een 1,5 buis met 500 µL van steriel water.</li>
		<li>Voeg 10 à 15 steriele glazen bolletjes op een rechthoekig bord van YAPD. Voeg de gist schorsing op het bord en schud grondig in alle richtingen voor 1 min om ervoor te zorgen dat de gist wordt verspreid via alle de plaat.</li>
		<li>De plaat onmiddellijk omkeren en tik op zodat de kralen naar het deksel. Verwijderen en recycleren van de kralen.</li>
		<li>Tas van de platen en agar-zijde naar beneden Incubeer gedurende 1-2 dagen bij 30 ° C. Ga verder met de paring stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Paring van gist DNA-aas en TF matrix stammen
	<ol>
<li>De TF-matrix overbrengen in een YAPD rechthoekige plaat met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Elke TF matrix plaat kan overbrengen naar 3-4 YAPD platen (afhankelijk van het aantal platen in de array) worden gebruikt. De TF matrix platen gebruikt voor de paring moeten 2-3 dagen oud maar niet meer als de paring kan inefficiënt.</li>
		<li>Het gazon van een DNA-aas stam overbrengen in de platen van de YAPD al met de TF-matrix met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma dat Vele repliceren . Gebruik een willekeurige marge in de bron met een radius van ~0.6 mm om te voorkomen dat het nemen van gist van dezelfde plek, en meng op doel om contact tussen giststammen. Gebruik het gazon met de DNA-aas stammen (punt 3.1) als bron, en de platen van de YAPD met de TF-matrix gespot in stap 3.2.1 als doel.</li>
		<li>Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 1 dag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selectie van diploïde gist
	<ol>
<li>De erop gist van de platen YAPD overbrengen aan Sc −U −Trp platen met de robot. Selecteer de 1.536 agarplaat als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren . Meng op bron en op doel.</li>
		<li>Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen (langere incubatietijd leidt tot hoge achtergrond verslaggever activiteit).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Overbrengen van uitlezing platen
	<ol>
<li>De diploïde gist van de Sc −U −Trp platen overbrengen naar de uitlezing rechthoekige platen Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal met behulp van de robot. Selecteer de 1.536 agar platen als bron en doel, en de 1.536 korte pin-pad. Selecteer het programma repliceren .</li>
		<li>Tas van de platen en incubeer agar-kant omhoog bij 30 ° C tot 7 dagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Beeldvorming van uitlezing platen
	<ol>
<li>Voor DNA-aas stammen met hoge achtergrond verslaggever activiteit, door foto's te nemen op dagen 2, 3 en 4. Anders, de foto's te nemen op dagen 4 en 7. Positieve interacties door groei en blauwe kleur van de gist kolonies worden geïdentificeerd en kunnen handmatig worden bepaald, of het kan worden bepaald met behulp van de software van de analyse van de afbeelding.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+transcription+factors%3A+function%2C+expression+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Transcription+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-centered+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li>
<li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li>
<li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li>
<li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li>
<li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li>
<li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50(2012).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li>
<li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li>
<li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De robotic eY1H paring screening beschreven aanpak hier sterk verhoogt de doorvoer ter identificatie van de set van TFs die zich aan een DNA-regio van belang binden, in vergelijking met vorige bibliotheek screening of gekleed screening benaderingen gebaseerd op transformatie. Verder, de TF-DNA-interacties die zijn gedetecteerd door eY1H testen zeer reproduceerbaar, zijn 90% van interacties genotypes zijn positief voor alle vier kolonies per TF getest, en 90% van interacties opnieuw testen in een onafhankelijke scherm van...

Een centraal probleem op het gebied van biomedische is het bepalen van de mechanismen waarmee elk menselijk gen wordt geregeld. Transcriptie is de eerste stap bij het beheersen van gen expressie niveaus, en het is geregeld door sets van transcriptiefactoren (TFs) die uniek voor elk gen zijn. Gezien het feit dat mensen coderen voor > 1500 TFs1,2, identificatie van de complete set van TFs waarmee de expressie van elk gen blijft een open uitdaging.
Twee soorten methoden kunnen worden gebruikt voor het toewijzen van TF-DNA interacties: TF-gecentreerd en DNA-gecentreerd methode3 (figuur 1A). TF-gecentreerde methoden, is een TF van belang voor de binding aan de genomic DNA regio's of om te bepalen zijn DNA-bindende specificiteit gesondeerd. Deze methoden omvatten chromatine immunoprecipitation (ChIP), gevolgd door sequentiebepaling van high-throughput, eiwit bindende microarrays en SELEX4,5,6. In DNA-gecentreerde methoden, is een opeenvolging van DNA van belang om te bepalen van de set van TFs die zich aan het DNA-sequentie binden gesondeerd. De meest toegepaste van dergelijke methoden is gist één-hybride (Y1H) testen, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met reporter genen7,8,9.
Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (bijv. de initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering9,10 (figuur 1B). Het DNA-aas wordt gekloond stroomopwaarts van twee reporter genen (LacZ en HIS3) en beide DNA-bait::reporter constructies zijn geïntegreerd in het genoom van de gist voor het genereren van chromatinized 'DNA-aas stammen.' De TF-prooi, gecodeerd in een plasmide die een TF gesmolten tot het domein (AD) van de activering van de gist Gal4 TF uitdrukt, is ingevoerd in de stam van de DNA-aas te vissen voor TF-DNA interacties. Als de TF-prooi aan de opeenvolging van DNA-aas bindt, dan is de advertentie aanwezig in de TF-prooi zal leiden tot de activering van beide genen verslaggever. Dientengevolge, kunnen cellen met een positieve interactie worden geselecteerd voor groei op platen histidine ontbreekt, evenals het overwinnen van een concurrerende inhibitor, 3-Amino-1,2,4-triazool (3-AT), en gevisualiseerd als blauwe kolonies in aanwezigheid van X-gal. Omdat de potente gist Gal4 AD wordt gebruikt, Y1H assays interacties transcriptionele activators evenals repressors kunnen detecteren. Bovendien, gezien het feit dat de TF-prooien worden uitgedrukt van een sterke gist promotor (ADH1), kunnen interacties worden gedetecteerd zelfs voor TFs die lage endogene expressie niveaus, die zijn uitdagend hebben te detecteren door ChIP11,12.
Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H assays zijn gebaseerd op de invoering van TF-prooien in de DNA-aas giststammen door transformeren gepoolde TF-prooi bibliotheken gevolgd door selectie, kolonie plukken en rangschikken om te identificeren van de interactie TF, of door transformatie van individuele klonen8,9. Dit zijn tijdrovende protocollen, beperking van het aantal DNA-sequenties die kunnen worden getest per onderzoeker. Een recente verbetering van Y1H tests, genaamd versterkt Y1H (eY1H), is sterk toegenomen de screening doorvoer met behulp van een hoge dichtheid matrix (HDA) robotic platform om te paren giststammen DNA-aas met een collectie giststammen elk uiting geven aan een ander TF-prooi10,13 (Figuur 1 c). Deze schermen gebruiken een 1.536 kolonie formaat waardoor voor het testen van de meeste menselijke TFs in viervoud met behulp van slechts drie platen. Verder, gezien het feit dat de TF-DNA interacties worden getest in een paarsgewijze manier, deze aanpak maakt het mogelijk voor het vergelijken van interacties tussen DNA-aas (zoals twee noncoding één nucleotide varianten) en tussen verschillende TFs of TF varianten11,12 ,14.
Met behulp van eY1H assays, hebben we de grootste mens en Caenorhabditis elegans DNA-gecentreerde TF-DNA interacties netwerken tot heden afgebakend. In het bijzonder, hebben we 2,230 interacties tussen 246 menselijke developmental smaakversterkers en 283 TFs12vastgesteld. Verder hebben we gebruikt eY1H testen om te ontdekken van gewijzigde TF binding aan 109 één nucleotide noncoding varianten die zijn gekoppeld aan genetische ziekten zoals ontwikkelingsstoornissen malformatie, kanker en neurologische aandoeningen. Meer recentelijk hebben we gebruikt eY1H om af te bakenen een netwerk bestaande uit 21,714 interacties tussen 2.576 C. elegans gene initiatiefnemers en 366 TFs11. Dit netwerk was behulpzaam om te ontdekken de functionele rol van tientallen C. elegans TFs.
De protocollen voor het genereren van DNA-aas vlekken en evalueren van de niveaus van achtergrond verslaggever activiteit geweest gemeld elders15,16,17. Hier beschrijven we een pijpleiding van de eY1H die kan worden gebruikt om het scherm van een menselijke genomic DNA regio tegen een array van 1,086 menselijke TFs. Zodra een gist stam van de DNA-aas wordt gegenereerd en een TF-prooi-matrix is bevlekt op de overeenkomstige platen, kan het gehele protocol worden uitgevoerd in twee weken (tabel 1). Wat nog belangrijker is, kan het protocol worden heeft zodat een enkele onderzoeker kan scherm 60 opeenvolgingen van DNA-aas gelijktijdig. We gescreend om aan te tonen van het protocol, de initiatiefnemers van de twee genen van cytokine CCL15 en IL17F. Daarnaast tonen we de resultaten van mislukte schermen ter illustratie van de soorten problemen die zich voordoen kunnen bij het uitvoeren van eY1H testen en het oplossen van hen.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazool (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Competitieve remmer voor producten van HIS3-gen</td></tr><tr><td>Adenine sulfaat (hemisulfaat), dihydraat</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Vereist voor goede gistgroei</td></tr><tr><td>Agar High Gel Strength - Bacteriologisch kwaliteit</td><td>American International Chemical</td><td>AGHGUP</td><td>Voedingsmedium voor gistgroei</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Stikstofbron in synthetisch gistmedium</td></tr><tr><td>D+ Glucose Anhydrous</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Vereist voor gistgroei</td></tr><tr><td>Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp en Uracil, adenine rijk zonder giststikstofbase</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Synthetisch compleet medium vereist voor gistgroei</td></tr><tr><td>Edge Multiparameter pH Meter</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Om de pH van selectief medium te meten</td></tr><tr><td>Flat Toothpicks 750 ct</td><td>Diamond</td><td></td><td>Om gisten op petrischalen uit te zaaien</td></tr><tr><td>Glaspebbeltjes</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Om gist te verspreiden bij het maken van lawn</td></tr><tr><td>Glycerol &ge;99%</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Vereist om bevroren giststammen te maken</td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Voor gistgroeiselectie in selectief medium</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Voor gistgroeiselectie in selectief medium</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Voor gistgroeiselectie in selectief medium</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamide</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Om X-gal oplossing te maken</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Voor het doseren van nauwkeurige volumes medium in Singer platen</td></tr><tr><td>Peptone, Bacteriologisch</td><td>American International Chemical</td><td>PEBAUP</td><td>Eiwitbron vereist voor gistgroei</td></tr><tr><td>Petrischaal, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Voor het kweken van gistlokaas voor screening</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Om rechthoekige agar platen te maken voor gebruik met Singer Robot</td></tr><tr><td>Precision Low Temperature BOD Gekoelde Incubator</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Om gistplaten op constante temperatuur te incuberen</td></tr><tr><td>RePads 1,536 kort</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Om de TF-prey array over te brengen, gist te mengen en gist over te brengen naar diploïde selectie- en uitleesplaten</td></tr><tr><td>RePads 384 kort</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Om TF-prey array over te brengen van 384 naar 1,536 kolonie formaat</td></tr><tr><td>RePads 96 lang</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>Om TF-prey array over te brengen van glycerol stock naar agar plaat</td></tr><tr><td>RePads 96 kort</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Om TF-prey array over te brengen van 96 naar 384 kolonie formaat</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR robot</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Voor het overbrengen van gist op hoog-doorvoer wijze</td></tr><tr><td>Natriumhydroxide (Pellets/Certified ACS)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Voor het aanpassen van de pH van selectief medium</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch heptahydraat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Vereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch monohydraat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Vereist voor LacZ reporter activiteit op X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Voor gistgroeiselectie in selectief medium</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranosid)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galactosidase maakt kleurloos X-gal blauw om eiwit-DNA interactie te detecteren</td></tr><tr><td>Gist Extract</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Voedzaam medium voor groei en vermeerdering van gist</td></tr><tr><td>Gist Stikstof Base (poeder) zonder AA, koolhydraat en zonder AS&nbsp;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Vereist voor krachtige gistgroei</td></tr></tbody></table>

verbeterde gist one-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke dna-sequenties

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Het identificeren van de sets van transcriptiefactoren (TFs) die regelen van elk menselijk gen is een enorme taak die vereist integratie van talrijke experimentele en computationele benaderingen. Een dergelijke methode is de gist één-hybride (Y1H) assay, in welke interacties tussen TFs en DNA regio's worden getest in de omgeving van de kern van de gist met behulp van verslaggever genen. Y1H tests omvatten twee componenten: een 'DNA-aas' (b.v.., initiatiefnemers, versterkers, geluiddempers, etc.) en een 'TF-prooi,"die kan worden gescreend voor reporter gene activering. Meest gepubliceerde protocollen voor het uitvoeren van Y1H schermen zijn gebaseerd op het omzetten van TF-prooi bibliotheken of arrays in DNA-aas giststammen. Hier beschrijven we een pijpleiding, verbeterde Y1H genoemd (eY1H) testen, waar TF-DNA interacties zijn ondervraagd door de paring van de DNA-aas stammen met een gekleed verzameling TF-prooi stammen met behulp van een array met hoge dichtheid (HDA) robotic platform waarmee screening in een 1,536 de indeling van de kolonie. Dit zorgt voor een dramatische toename van de doorvoer (60 opeenvolgingen van DNA-aas tegen > 1.000 TFs duurt twee weken per onderzoeker) en reproduceerbaarheid. We illustreren de verschillende soorten van de verwachte resultaten door het testen van sequenties van menselijke promotor tegen een array van 1,086 menselijke TFs, evenals voorbeelden van problemen die zich kunnen voordoen tijdens de schermen en het oplossen van hen.

Drie belangrijke factoren moeten worden beschouwd wanneer analyseren van resultaten van eY1H assays: de achtergrond verslaggever activiteit van de DNA-aas-stam, de sterkte van de activiteit van de verslaggever overeenkomt met TF-DNA interacties, en het aantal positieve kolonies. De achtergrond verslaggever activiteit (bijvoorbeeld autoactivity) van de DNA-aas stam verwijst naar de algemene groei en kleur van de kolonies van de gist in de uitlezing plaat, zelfs in de afwezigheid van een TF-prooi. Ideaal, niet-autoactive s...

Hier presenteren we een verbeterde gist één-hybrid screening protocol ter identificatie van de transcriptiefactoren (TFs) die zich aan een menselijke DNA-regio van belang binden kunnen. Deze methode maakt gebruik van een high-throughput screening-pijpleiding die de binding van ondervragen kan > 1000 TFs in een enkele experiment.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Het doel van verbeterde gist een-hybride testen is het identificeren van de set van transcriptie factoren die binden aan een DNA-sequentie van belang. Het voordeel van deze techniek is dat verbeterde gist een-hybride testen kunnen evalueren meer dan 1000 transcriptie factoren in een enkel experiment. Omgekeerd evalueert chromatineimmunoprecipitatie slechts één transcriptiefactor tegelijk.Deze methode vormt een belangrijk instrument voor functionele genomica om het repertoire van transcriptiefactoren te identificeren die zich binden aan genpromotors en versterkers en om gewijzigde transcriptiefactor te identificeren die bindend is voor niet-coderende varianten. Het aantonen van de procedure zal Dr.Xing Liu een postdoc uit mijn laboratorium zijn. Ontdooi de gist glycerol voorraad platen met de TF prooi array op ijs.Resuspend de gist met behulp van een 12-kanaals pipet en ga naar de volgende stap binnen 1 tot 3 minuten. Om de gist ter plaatse in Sc minus tryptofaan rechthoekige platen, gebruik maken van een hoge dichtheid array robot om multiwell 96 platen te selecteren als de bron, 96 agar platen als het doel, en 96 lange pin pads. Pinpads zijn niet herbruikbaar en moeten worden weggegooid.Selecteer de Spot Veel programma om twee exemplaren per 96 goed plaat te maken. Gebruik de opties voor recyclen of opnieuw bekijken om achterbesmetting van de bevroren voorraden te voorkomen. Selecteer ook de optie om op en neer te wervelen in de bron om de gist te mengen.Volg instructies voor waar en wanneer de platen te plaatsen en laat de robot om de gist ter plaatse in Sc minus tryptofaan rechthoekige platen. Zak de gevlekte array en incubeer het agar kant op 30 graden Celsius voor 2 tot 3 dagen. Om 384 koloniearrays in Sc minus tryptofaanrechthoekige platen te genereren, selecteert u 96 agarplaten als bron, 384 agarplaat als doel en 96 korte pinpads.Selecteer vervolgens het 1:4 array single source programma. Op deze manier worden vier 96 kolonieplaten samengevoegd tot één kolonieplaat van 384. Gebruik de opties voor recyclen of opnieuw bekijken geen besmetting tussen verschillende platen.Zak de platen en incubeer de gevlekte 384 kolonie array agar kant op 30 graden Celsius voor 2 dagen. Om 1536 koloniearrays in Sc minus tryptofaanrechthoekige platen te genereren, selecteert u 384 agarplaten als bron, de 1536 agarplaten als doel en 384 korte pinpads. Selecteer vervolgens het 1:4-testprogramma voor één bron.Het doel is om elke kolonie te kopiëren in vier kolonies te verkrijgen viervoeters. Gebruik de recycle en revisit opties als dit gaat kopiëren elke kolonie 4 keer. Volg de instructies van de robot en laat de robot om de gist ter plaatse in de platen voor zakken en uitbroeden van de gevlekte 1536 kolonie array agar kant omhoog op 30 graden Celsius voor 3 dagen.Om de 1536 kolonie array in Sc minus tryptofaan rechthoekige platen te versterken, selecteert u 1536 agar platen als de bron, 1536 agar platen als het doel, en 1536 korte pin pads. Selecteer het programma Veel repliceren om 3 tot 4 kopieën te repliceren. Gebruik de optie recyclen en opnieuw bekijken, maar gooi het pad weg bij het overschakelen naar een andere plaat van de array om kruisbesmetting te voorkomen.Laat de robot de 1536 koloniearray versterken in Sc minus tryptofaan rechthoekige platen. Tot slot, zak de platen en incubeer de gevlekte 1536 kolonie array agar kant op 30 graden Celsius voor 3 dagen te gebruiken voor paring stappen. Ter voorbereiding van het DNA aas stam gazons voor de paring, ter plaatse de DNA-gist aas stammen op een Sc minus uracil en histidine plaat en groeien voor 3 dagen op 30 graden Celsius.Streep de gist in een 15 centimeter Sc minus uracil en histidine plaat met behulp van een steriele tandenstoker, zodat elke plaat past 12 tot 16 verschillende stammen. Broed de plaat op een dag bij 30 graden Celsius. De volgende dag, streep de gist in een 15 centimeter Sc minus uracil en histidine plaat met behulp van een steriele tandenstoker, zodat elke plaat past 4 verschillende stammen.Broed de plaat voor een dag op 30 graden Celsius. Na incubatie, schraap de gist met behulp van een steriele tandenstoker, zorg ervoor dat geen agar schrapen. Voeg de gist toe in een buis van 1,5 milliliter met 500 microliter steriel water.Voeg nu 10 tot 15 steriele glazen kralen en de gistsuspensie toe aan een YAPD rechthoekige plaat. Schud grondig in alle richtingen voor een minuut om ervoor te zorgen dat de gist is verspreid over de plaat. Keer de plaat onmiddellijk om en tik zo dat de kralen naar het deksel gaan.Verwijder en recycle de kralen. Zak de platen en incubeer ze agar kant naar beneden voor 1 tot 2 dagen op 30 graden Celsius. Ga vervolgens naar de paringsstap.Om de gist DNA-aas en TF-arraystammen te paren, breng je de TF-array over naar een YAPD rechthoekige plaat met de robot. Selecteer de 1536 agar plaat als de bron en het doel, en de 1536 korte pin pad. Selecteer het programma Veel repliceren.Selecteer 4 bronplaten en de opties voor recyclen en opnieuw bekijken. Elke TF-arrayplaat kan worden gebruikt om 3 tot 4 YAPD-platen over te zetten. De TF-matrixplaten die worden gebruikt voor de paring moeten 2 tot 3 dagen oud zijn, maar niet meer omdat de paring inefficiënt kan zijn.Om het gazon van een DNA-aasstam over te brengen naar de YAPD-platen die al de TF-array bevatten, selecteert u de 1536 agarplaat als bron en het doel en de 1536 korte pinpad. Selecteer het programma Veel repliceren. Gebruik een willekeurige verschuiving in de bron met een straal van ongeveer 0,6 millimeter om te voorkomen dat het nemen van gist van dezelfde plek en selecteer Mix on Target om contact tussen giststammen te vergemakkelijken.Gebruik het gazon met de DNA-aas stammen als de bron, en de YAPD platen met de gevlekte TF array als het doel voor zakken de platen en het uitbroeden van hen agar kant omhoog op 30 graden Celsius voor een dag. Voor de selectie van diploïde gist, selecteer de 1536 agar plaat als de bron en het doel, en selecteer de 1536 korte pin pad. Selecteer het programma Repliceren.Selecteer Mix op bron en op doel. Laat de robot de gepaarde gist van de YAPD-platen overbrengen naar de Sc minus uracil- en tryptofaanplaten voordat de platen worden inzakken en ze gedurende 2 tot 3 dagen uitbroeden bij 30 graden Celsius. Selecteer nu de 1536 agar platen als de bron en het doel en de 1536 korte pin pad.Selecteer het programma Repliceren. Breng de diploïde gist van de Sc minus uracil en tryptofaan platen naar de uitlezing rechthoekige 3-AT en X-gal met platen met behulp van de robot. Zak de platen en incubeer ze agar kant op 30 graden Celsius voor maximaal 7 dagen.Voor DNA-aas stammen met een hoge achtergrond reporter activiteit, neem foto's op dag 2, 3 en 4. Anders, foto's nemen op dag 4 en 7. Houd de TF-matrixplaten op kamertemperatuur en kopieer na 7 dagen opnieuw voor een nieuwe screeningronde.Om het type resultaten te illustreren dat kan worden verkregen met behulp van verbeterde gist een-hybride testen, de promotor regio's van de CCL15 en IL17F genen werden gescreend tegen een array van 1086 menselijke TF's. De CCL15 promotor is een voorbeeld van een niet-autoactieve DNA-aas, waar interacties, zelfs zwakke, gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd. De IL17F promotor is een voorbeeld van een autoactief DNA-aas met ongelijke achtergrond reporter activiteit waar sommige interacties kunnen worden gedetecteerd, terwijl voor verschillende TF's, is het onzeker of de reporter activiteit hoger is dan de achtergrond.Er zijn verschillende problemen die kunnen optreden bij het uitvoeren van verbeterde gist een-hybride testen. In dit geval zijn kolonies te klein en niet over te dragen. Typisch, ongeveer 95% van TF prooi kolonies vertonen normale groei.In dit voorbeeld is er geen gistgroei in een deel van de plaat. Dit probleem is over het algemeen gerelateerd aan een storing in de paringsstap als de 1536 pin pad niet in contact te maken met de gist in het DNA-aas stam gazon, in de TF-array, of in de paringplaat. In deze twee voorbeelden worden geen interacties gedetecteerd.Dit probleem is vaak gerelateerd aan ofwel onbedoelde inactiverende mutaties in de reporter genen, in het bijzonder LacZ, of een te hoge autoactiviteit die interacties maskeren. In dit geval presenteert de plaat willekeurige blauwe vlekken die vaak gerelateerd zijn aan bacteriële besmetting. Het belangrijkste om te overwegen is een goede plaat voorbereiding.Ervoor zorgen dat alle componenten worden toegevoegd en dat de agarhoogte uniform is, omdat alle volgende stappen hiervan afhankelijk zijn. Hoewel de meeste reagentia niet gevaarlijk zijn, is het belangrijk om te allen tijde handschoenen te dragen om besmetting van de monsters en platen te voorkomen. Zoals bij elke DNA-bindende test, is het belangrijk om de interacties te valideren die zijn geïdentificeerd met behulp van functionele tests zoals reporter-tests, transcriptiefactor knockdown of knock-out, gevolgd door het meten van expressie van het doelgen.Deze methode heeft het mogelijk gemaakt de identificatie van transcriptiefactoren die genen reguleren die betrokken zijn bij bepaalde biologische processen, evenals transcriptiefactoren met alternatieve binding aan niet-coderingsziekten.This method has allowed the identification of transcription factors that regulate genes involved in particular biological processes as well as transcription factors with alternate binding to non-coding disease-associated variants.

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Hier beschrijven we een plasmide overexpressie scherm...

High-throughput gist Plasmide Overexpressie Screen

We hebben gewijzigd de conventionele gist twee-hybride screening, een effectief middel bij het identificeren van genetische eiwit interactie. Deze wijziging verkort aanzienlijk het proces, vermindert de werkdruk, en het belangrijkst, vermindert het aantal false positives. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar.

Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

In this video, we demonstrate the modified yeast one-hybrid assay, which detects multiple proteins interacting with target DNA. The transformed yeast cells contain the target DNA sequence upstream of the reporter gene. Additionally, they express transcription factor proteins. When the proteins form complexes and bind to the target DNA, the reporter gene is expressed and can be detected enzymatically.

Modified Yeast-One Hybrid Assay to Detect Heteromeric Protein Complex-DNA Interactions

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor de snelle bouw van kunstmatige transcriptiefactoren (ATF) met verwante GFP verslaggevers en kwantificering van de ATFs mogelijkheid om GFP-expressie te stimuleren via flowcytometrie.

Rapid Synthese en Screening van chemisch geactiveerde transcriptie Factoren met GFP gebaseerde Reporters

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

Een strategie voor het genereren van mutaties in histongenen op hun endogene locatie in Saccharomyces cerevisiae wordt gepresenteerd.

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.

Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Diepe sequentiebepaling van gist bevolking geselecteerd voor positieve gist 2-hybrid interacties mogelijk levert een schat aan informatie over interacterende eiwitten van de partner. Hier beschrijven we de werking van specifieke bioinformatica tools en bijgewerkte software voor het analyseren van de reeks gegevens uit dergelijke schermen op maat.

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

Hier zijn vier protocollen voor het construeren en exploiteren van gist Saccharomyces cerevisiae reporter stammen te bestuderen van menselijke P53 trans activatie potentieel, effecten van de verschillende kanker-geassocieerde mutaties, co-uitgedrukt interactie eiwitten, en de effecten van specifieke kleine moleculen.

Gist als chassis voor het ontwikkelen van functionele assays voor het bestuderen van menselijke P53

Leer een verbeterde gist one-hybrid methode om transcriptiefactoren te identificeren die binden aan menselijke DNA-sequenties. Deze high-throughput techniek analyseert meer dan 1000 TFs tegelijk.

Verbeterde gist One-hybride schermen te identificeren van de transcriptiefactor binden aan menselijke DNA-sequenties

Meer video's verkennen