Name: Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer hoe je menselijke enteroiden kweekt uit neonataal darmweefsel om necrotiserende enterocolitis te bestuderen. Dit model maakt ethisch onderzoek naar inflammatoire respons en therapeutische interventies mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het nationale Instituut van gezondheid Instituut van Diabetes en spijsverterings en nier ziekte Grant (K08DK106450) en de Jay Grosfeld Award van de American Pediatric chirurgische Association aan C.J.H.

Institutionele beoordeling van bestuur goedkeuring was verkregen (IRB #2013-15152) voor het verzamelen van weefselmonsters van patiënten die een resectie van de darm aan Ann en Robert H. Lurie kinder ziekenhuis van Chicago, Chicago, IL. Alle protocollen werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtsnoeren en voorschriften voor het welzijn van de mens. Schriftelijke toestemming van de ouders op de hoogte was nodig en verkregen vóór sample collectie in alle gevallen.
1. reagens voorbereiding
<ol><li>Bereiden van voedingsbodems stockoplossing voor hele weefsel collectie: 1 L van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM), 110 mL van foetale boviene Serum (FBS), 11 mL penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%) en 1.1 mL filter-gesteriliseerde insuline (definitieve concentratie van 0,1%.) Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereiden van Chelating Buffer #1: 30 mL voedingsbodems (zoals beschreven in punt 1.1), 600 µL 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (eindconcentratie 10 mM), 300 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL van amfotericine-B (eindconcentratie 0,2%). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.</li>
	<li>Chelating Buffer #2 bereiden: 30 mL voedingsbodems (zoals beschreven in punt 1.1), 300 µL van 0.5 M EDTA (eindconcentratie 5mM), 300 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%) en 60 µL van amfotericine-B (eindconcentratie 0,2%). Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereiden van menselijke Minigut Media: 41.4 mL van DMEM/F-12, 5 mL FBS (laatste 10%), 500 µL van penicilline-streptomycine (eindconcentratie 1%), 500 µL van L-glutamine (eindconcentratie 1%), 500 µL van gentamicine (eindconcentratie 1%), 100 µL van amfotericine-B (finale concentratie 0,2%), 500 µL van 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonzuur (HEPES) (eindconcentratie 10 mM), aanvulling van 500 µL van 100 x N-2 en 1 mL 50 x B-27 aanvullen minus vitamine A voor een totaal volume van 50 mL. Stockoplossing van het winkel bij-20 ° C.</li>
	<li>Bereiden van menselijke Minigut Media voltooid: 10 mL van menselijke Minigut Media (bereid in 1.4), 10 µL van 100 µg/mL Wnt3a (eindconcentratie 100 ng/mL), 10 µL van 100 µg/mL Noggin (eindconcentratie 100 ng/mL), 10 µL van 1 mg/mL R-Spondin (eindconcentratie 1 µg/mL) , 10 µL van 500 µg/mL epidermale groeifactor (EGF) (eindconcentratie 50 ng/mL), 10 µL van 1 M N-Acetylcysteïne (eindconcentratie 1 mM), 10 µL van 10 mM Y-27632 (eindconcentratie van 10 µM), 10 µL van 500 µM A-83 (eindconcentratie 500 nM), 10 µL van 10 mM SB202190 (laatste concentratie 10 µM), 100 µL van 1 M Nicotinamide (eindconcentratie 10 mM) en 1 µL van 100 µM [leu] 15-gastrine 1 (eindconcentratie 10 nM). Total volume 10 mL. Stockoplossing van het winkel bij 4 ° C. Opmerking: Oplossingen moeten gebruikt worden binnen 48 uur.</li>
</ol>2. crypt isolatie en beplating van hele weefsel
<ol><li>
Op het moment van collectie in de operatieve suite, leg het menselijk kleine intestinale weefsel-monster in koude Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS). Het model wassen in koud DPBS tot duidelijk van ontlasting en bloed. Winkel specimen bij 4 ° C in RPMI 1640 Medium tot klaar voor crypt isolatie. Opmerking: Weefsel kan niet worden opgeslagen meer dan 24u.<ol>
<li>Zorg ervoor dat het model duidelijk van ontlasting en bloed. Met behulp van delicate ontleden schaar, verwijder alle overtollige vet of chirurgische clips/nietjes enz. Weeg het model. Opmerking: Streven naar een stuk ongeveer 0,75-2.5 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Snijd het specimen in 0.5 cm stukken en plaats in 30 mL chelaat Buffer #1 (zoals opgesteld in stap 1.2).
	<ol>
<li>Schudden bij lage snelheid gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Filteren van weefsel door 100 µm cel zeef en stroom door negeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Meng het weefsel 30 mL chelaat Buffer #2 (zoals opgesteld in stap 1.3).
	<ol>
<li>Schudden bij lage snelheid gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Filteren van weefsel door een zeef van 100 µm cel en stroom door negeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontdooi 500 mL kelder membraan matrix op ijs voor gebruik in stap 2.8.</li>
	<li>
Toevoegen van weefsel tot 10 mL van koude DMEM in een conische tube van 50 mL en schud krachtig met de hand voor 10 s.
	<ol>
<li>Filtreer door een zeef van 100 µm cel en verzamelen van stroom door (Label #1). Houd buis #1 op het ijs.</li>
		<li>Weefsel toevoegen aan een ander 10 mL koude DMEM in een aparte 50 mL conische buis en schud krachtig met de hand voor 10 s.</li>
		<li>Filtreer door een zeef van 100 µm cel en verzamelen van stroom door (label #2).</li>
		<li>Herhaal dit twee extra keer totdat er vier conische buisjes met stroom door (gelabelde buizen #1-4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filter tube #1 oplossing via een 100 µm cel zeef en overdracht informatiestroom via in 15 mL conische buis (Label #1). Herhaal deze stappen voor #2-4.
	<ol>
<li>Centrifuge 15 mL buizen #1-4 bij 200 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De laminaire flow Hood, verwijder het supernatant uit buizen #1-4 en negeren. Vermijd het verstoren van de wolk van weefsel direct boven de pellet, zelfs als dat betekent dat sommige bovendrijvende vloeistof achterlaat.
	<ol>
<li>Door het langzaam pipetteren, meng de pellet met de overgebleven supernatant in buizen #1-4.</li>
		<li>Breng het mengsel van buizen #1-4 in één enkel 2 mL conische buis.</li>
		<li>Centrifugeer de conische buis bij 200 x g gedurende 20 min bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL van kelder membraan matrix. Opmerking: houden de kelder membraan matrix op ijs te allen tijde en snel te werken voor de volgende stappen. Dit product polymerizes heel snel bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Breng 50 µL specimen/kelder membraan matrix schorsing naar het midden van een goed in een 24-well-plate. Dit moet verschijnen koepel-vormige. Opmerking: Gebruik van gekoelde Pipetteer tips helpt bij overdracht van de vlotter van de schorsing, minimaliseren van de polymerisatie.</li>
		<li>Herhaal 9 keer te vullen 10 totale wells.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de plaat 24-well in 37 ° C, 5% CO2 incubator voor 30 min dat polymerisatie.</li>
	<li>Voeg 500 µL van menselijke Minigut Media Complete (zoals opgesteld in stap 1.5) toe aan elk putje. Om de 2 dagen vervangen.</li>
	<li>Verzamelen enteroids na 5-10 dagen, wanneer de ontluikende is gevisualiseerd. Zie stap 4 en 5 voor collectie instructies.</li>
</ol>3. de inductie van experimentele NEC
<ol><li>10 µL van 5 mg/mL lipopolysaccharide (LPS) aan 500 µL van menselijke Minigut Media Complete (zoals opgesteld in stap 1.5) in elk putje op dag 0 toevoegen. Vervang om de 2 dagen tot de collectie.</li>
</ol>4. voorbereiding voor het insluiten van paraffine
<ol><li>
Zachtjes verwijderen media.
	<ol>
<li>Voeg 1 mL PBS en zachtjes op en neer te ontbinden de kelder membraan matrix met zorg niet aan de enteroids lyse Pipetteer.</li>
		<li>Centrifugeer het mengsel van PBS/enteroid met < 300 x g voor 5 min pellet en verwijderen van PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Toevoegen van 4% paraformaldehyde te repareren bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.</li>
	<li>
Centrifugeer bij < 300 x g voor 5 min pellet, en vervolgens het verwijderen van PBS.
	<ol>
<li>Wassen voorzichtig met 1 mL PBS samen en centrifugeer bij < 300 x g voor 5 min pellet, en vervolgens het verwijderen van PBS.</li>
		<li>Herhaal stap 4.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Smelt een voldoende volume van de weefsel gel (ongeveer 300 µL) verwerking door het gewenste bedrag te plaatsen in een conische buis en verwarmen het in een droge Bad incubator bij 65 ° C gedurende 3 tot 10 minuten tot vloeistof.
	<ol>
<li>Voeg het weefsel verwerking gel om de pellet en meng voorzichtig.</li>
		<li>Een dekglaasje aan, plaats een kleine klonen ring.</li>
		<li>Pipetteer het weefsel verwerking van gel en enteroid mengsel in een klonen ring gemonteerd op een dekglaasje aan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het weefsel verwerking van gel en enteroid mengsel te stollen bij 4 ° C gedurende 1 h staan.
	<ol>
<li>De klonen ring met gestolde mengsel onderdompelen in 70% ethanol in voorbereiding voor het insluiten van paraffine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid collectie voor RNA en eiwit extractie
<ol><li>Zachtjes verwijderen menselijke Minigut Media volledig uit elk putje.</li>
	<li>
Voeg 1 mL PBS en zachtjes Pipetteer omhoog en omlaag om op te lossen de kelder membraan-matrix. Wees voorzichtig niet te distantiëren van de enteroids.
	<ol>
<li>Plaats PBS/enteroid mengsel in een steriele 2 mL conische buis.</li>
		<li>Centrifugeer bij < 300 x g gedurende 5 minuten aan pellet.</li>
		<li>Zachtjes verwijderen PBS, verzorgen als u niet wilt verwijderen van de enteroids.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal stap-serie 5.2 twee meer tijden.</li>
	<li>Bevriezen in-80 ° C tot klaar voor eiwit en/of RNA extractie.</li>
	<li>Gen expressie en eiwit isolatie van de enteroids met behulp van gevestigde qRT-PCR en westelijke bevlekken technieken uit te voeren.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze roman ex vivo menselijke intestinale enteroid model fungeert als een handige methode voor de studie van de intestinale barrière dysfunctie in necrotiserende enterocolitis (NEC). De enteroid verwerkingsmethoden hier gepresenteerd werden aangepast uit de vorige werk van Drs. Misty Good, Michael Helmrath en Jason Wertheim10,11,12.
Details rond de gehele weefsel collectie en timing van de crypte isol...

Menselijke enteroids zijn een ex vivo 3-dimensionale cultuur systeem gegenereerd op basis van stamcellen van intestinale crypten van menselijke intestinale weefselsteekproeven geïsoleerd. Dit baanbrekende model was baanbrekend werk verricht door Hans Clevers et al. in 2007 na de ontdekking van Lgr5 + stamcellen in de crypten van de dunne darm in muizen1. Hun werk legden de basis voor de vaststelling van een ex vivo intestinale epitheliale cultuur van meerdere celtypen die zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2kan worden gepasseerd. Sinds deze ontdekking, hebben enteroids gebruikt als een nieuwe model normale spijsvertering fysiologie, en de pathofysiologie van intestinale ziekten zoals ontstekingsdarmziekte, gastheer-pathogeen interacties en regeneratieve geneeskunde2te gaan studeren.
Het gebruik van enteroids als een ex vivo model voor de studie van intestinale pathofysiologie heeft diverse voordelen ten opzichte van alternatieve technieken. Voor de afgelopen decennia, zijn diermodellen en vereeuwigd intestinale kanker-afgeleide cellijnen gebruikt om te studeren van intestinale fysiologie3,4,5. Eencellige culturen vertegenwoordigen niet de diversiteit van de soorten cellen aanwezig zijn in normale intestinale epitheel, waardoor het ontbreken van cel naar cel cross-talk en segment-specificiteit in eiwit expressie, signalering en pathogene agens veroorzaakte ziekte6. Stamcellen in enteroids onderscheiden in de grote soorten van de epitheliale cellen zoals enterocyten, Paneth cellen, goblet cellen, enteroendocrine cellen en meer3. Ze vertonen polariteit, epitheliale vervoer functies vervullen, en zorgen voor intestinale segment specificiteit6. Sinds enteroids het meerdere celtypen van menselijke intestinaal epitheel recapituleren kan, kunnen zij overwinnen deze erkende beperking van kanker cel-gebaseerde systemen. Na verloop van tijd derivaten van cellijnen zijn subcloned en evolueren tot grotere diversiteit in eiwit expressie en localisatie3vertonen. Integendeel, kan enteroids worden gepasseerd zonder belangrijke genetische of fysiologische veranderingen2. Hoewel talrijke diermodellen voor NEC bestaat, is er wellicht antwoord op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Als gevolg van deze beperkingen, mislukken therapeutics afgeleid van diermodellen 90% van de tijd wanneer het wordt getest in menselijke proeven als gevolg van verschillen in toxiciteit of werkzaamheid3. Enteroids dienen als veelbelovende preklinische modellen die kunnen overwinnen deze tekortkomingen, wat leidt tot een beter begrip van de complexe intestinale pathofysiologie en daarom meer succesvolle en kosteneffectieve therapeutische innovaties. Er zijn ook recente aanwijzingen dat de leeftijd van het weefsel dat een enteroid wordt gegenereerd uit biologisch belangrijke7blijft. Dit is een zeer belangrijk detail voor ons model omdat enteroids zijn gegenereerd op basis van neonatale weefsel, waardoor het behoud van fysiologische relevantie aan patiënten met NEC.
Het nut van enteroids als modellen van aandoeningen bij de mens blijft uitbreiden, in de hoop vinden Vulkaniseert tot ernstige en pervasieve voorwaarden. Necrotiserende enterocolitis (NEC) is een verwoestende intestinale ziekte van pasgeborenen gekenmerkt door intestinale necrose en leidt vaak tot perforatie van de wand van de darm, bloedvergiftiging en dood8. Als gevolg van de complexe en multifactoriële pathofysiologie van NEC, heeft het exacte mechanisme van de ziekte niet nog is volledig toegelicht; verhoogde intestinale permeabiliteit heeft echter duidelijk betrokken bij de ziekte proces8. Aangezien dat de studie van NEC en potentiële therapeutische agenten is ethisch uitdagend bij menselijke proefpersonen, met name kinderen, het is bijzonder wenselijk gebruik te maken van een biologisch relevante enteroid model van NEC met behulp van menselijke neonatale weefsel. Enteroids hebben tot nu toe een beperkte rol in de studie van NEC. Dit protocol beschrijft het gebruik van enteroids die zijn afgeleid van menselijke intestinale weefselsteekproeven als een roman ex vivo model voor de studie van necrotiserende enterocolitis.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R&amp;D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>B-27 supplement minus Vitamin A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Basement Membrane Matrix (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-gastrin 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R&amp;D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Processing Gel (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R&amp;D Systems INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

een nieuwe menselijke epitheliale enteroid model van necrotiserende enterocolitis

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotiserende enterocolitis is (NEC) een verwoestende ziekte van pasgeboren zuigelingen. Het wordt gekenmerkt door meerdere pathofysiologische veranderingen in de menselijke darm epitheel, leiden tot verhoogde intestinale permeabiliteit, verminderde teruggave en toegenomen celdood. Hoewel er talrijke diermodellen van NEC, is er mogelijk reactie op letsel en therapeutische interventies zeer variabel tussen soorten. Bovendien is het ethisch uitdagend om te studeren pathofysiologie van de ziekte of nieuwe therapeutische middelen rechtstreeks in menselijke proefpersonen, met name kinderen. Daarom is het wenselijk om een nieuw model van NEC met behulp van menselijke weefsels te ontwikkelen. Enteroids zijn 3-dimensionale organoids afgeleid van intestinale epitheliale cellen. Ze zijn ideaal voor de studie van complexe fysiologische interacties, cel signalering en verdediging van de gastheer-pathogeen. In dit manuscript beschrijven we een protocol dat culturen menselijke enteroids na isoleren van intestinale stamcellen van patiënten die een resectie van de darm. De crypte cellen worden gekweekt in medium met groeifactoren die differentiatie in de verschillende cel typen inwoner van de menselijke intestinaal epitheel aanmoedigen. Deze cellen worden gekweekt in een synthetische, collagene mix van proteïnen toe die als een steiger dienen, het nabootsen van de extra-cellulaire kelder-membraan. Dientengevolge, ontwikkelen enteroids apicale-basolaterale polariteit. Co beheer van lipopolysaccharide (LPS) in media veroorzaakt een ontstekingsreactie in de enteroids, leiden tot histologische, genetische en eiwit expressie veranderingen vergelijkbaar zijn met die in de menselijke NEC gezien. Een experimenteel model van NEC met behulp van menselijk weefsel kan bieden een nauwkeuriger platform voor drugs- en behandeling testen voorafgaand aan de menselijke proeven, als we streven naar een remedie voor deze ziekte te identificeren.

Onmiddellijk na de beplating verschijnen de vers geïsoleerde intestinale crypten als verlengde staven. Binnen uur vindt de enteroid op een ronde vormgeving (Figuur 1een). In de komende paar dagen begint de enteroids vormen van bollen, zoals te zien in Figuur 1b. Ontluikende voordoet tussen 5-10 dagen (Figuur 1c) en enteroid collectie moet worden uitg...

Enteroids ontstaan als een nieuwe model in de studie van ziekten bij de mens. Het protocol wordt beschreven hoe een enteroid model van menselijke necrotizing enterocolitis met behulp van lipopolysaccharide (LPS) behandeling van enteroids gegenereerd op basis van neonatale weefsel te simuleren. Verzamelde enteroids tonen ontstekingsreactie verwant aan degenen gezien in menselijke necrotizing enterocolitis.

Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroïden zijn driedimensionale organoïden afkomstig van darmeppitheelcellen. Ze zijn ideaal voor de studie van complexe fysiologische interacties, celsignalering en gastheerpathogenverdediging. Ons protocol beschrijft hoe menselijke enteroïden te kweken na het isoleren van darmstamcellen van patiënten die darmresectie ondergaan.Co-toediening van lipopolysaccharide in onze kweekmedia veroorzaakt een ontstekingsreactie in de enteroïden die leiden tot histologische, genetische en eiwitexpressieveranderingen die vergelijkbaar zijn met die bij menselijke necrotiserende enterocolitis. Gezien het feit dat de studie van necrotizing enterocolitis en potentiële therapeutische middelen ethisch uitdagend is bij menselijke proefpersonen, vooral kinderen, is het zeer wenselijk om dit nieuwe, biologisch relevante enteroïde model van necrotiserende enterocolitis te gebruiken met menselijk neonatale weefsel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat enteroïden in staat zijn om de verschillende cellen soorten menselijke darmeptheel samen te vatten en in staat zijn om de erkende beperkingen van diermodellen en celgebaseerde systemen te overwinnen.Helpen om de procedure aan te tonen zal Christie Buonpane, een chirurgische ingezetene, en Carrie Yuan, een laboratoriumtechnicus van ons laboratorium. Plaats op het moment van verzamelen in de operatieve suite het menselijke kleine darmweefselmonster in koude DPBS. Was het monster in de koude DPBS totdat het vrij is van bloed en ontlasting.Bewaar het exemplaar in RPMI 1640 medium op vier graden Celsius tot klaar voor crypte isolatie. Controleer nogmaals of het monster vrij is van ontlasting en bloed. Met behulp van delicate ontleden schaar verwijder overtollig vet of chirurgische clips en nietjes.Gewicht het monster en streven naar een stuk dat is ongeveer 0,75 tot 2,5 gram. Snijd vervolgens het weefsel in stukken van 0,5 centimeter en leg ze in een buis met 30 milliliter chelaatle buffer nummer één. Schud bij een lage snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Vervolgens, filtreer het weefsel door een 100 micrometer cel zeef en gooi de stroom door. Voeg het gefilterde weefsel toe aan een buis met 30 milliliter chelaat buffer nummer twee. Schud bij een lage snelheid gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Filtreer het weefsel door een filter van 100 micrometer en gooi de stroom erdoor weg. Daarna ontdooien 500 microliters van keldermembraanmatrix op ijs voor later gebruik. Voeg wat weefsel toe aan 10 milliliter koude DMEM in een conische buis van 50 milliliter en schud 10 seconden krachtig met de hand.Filter deze suspensie door een 100 micrometer celzeef en verzamel de stroom door. Hou deze buis in het ijs. Voeg wat weefsel toe aan nog eens 10 milliliter koude DMEM in een aparte conische buis van 50 milliliter en schud 10 seconden krachtig met de hand.Filter deze suspensie door een 100 micrometer celzeef en verzamel de stroom door. Herhaal het proces twee keer extra totdat er vier conische buizen met stroom door gelabeld een tot en met vier. Vervolgens, filter de oplossing in buis nummer een door een 100 micrometer cel zeef en breng de stroom door in een 15 milliliter conische buis ook gelabeld nummer een.Herhaal dit proces voor buizen twee tot en met vier. Centrifugeer de 15 milliliter buizen op 200 keer G en bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. In de laminaire stroomkap, verwijder de supernatant uit elke buis en gooi het.Vermijd het verstoren van de wolk van weefsel direct boven de pellet, zelfs als dat betekent dat het verlaten van een aantal supernatant achter. In elke buis, pipet op en neer langzaam om de pellet te mengen met de overgebleven supernatant. Breng het mengsel van elke buis in een enkele twee milliliter conische buis en centrifuge op 200 keer G en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Verwijder hierna de supernatant en zet de pellet opnieuw op in 500 microliters van voor ontdooide keldermembraanmatrix. Gebruik een gekoelde pipettip om 50 microliter van deze suspensie aan te brengen op het midden van een put in een 24 putplaat. Dit monster moet koepelvormig lijken.Herhaal deze aanvraagprocedure negen keer om 10 totale putten te vullen. Breng de 24 put plaat in een 5%kooldioxide incubator op 37 graden Celsius gedurende 30 minuten om polymerisatie mogelijk te maken. Voeg vervolgens 500 microliters menselijke minigutmedia toe, compleet aan elke put.Blijf onder dezelfde voorwaarden uitbroeden, zorg ervoor dat deze media om de twee dagen worden vervangen. Voeg eerst 10 microliter LPS met een concentratie van vijf milligram per milliliter toe aan de 500 microliter van menselijke minigutmedia, compleet in elke put van de plaat op dag nul. Blijf uitbroeden bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en vervang de aangevulde media om de twee dagen tot de collectie.Om voor te bereiden op paraffine inbedding, eerst voorzichtig verwijderen van de media, voeg een milliliter PBS, en voorzichtig pipette op en neer om de kelder membraan matrix op te lossen, terwijl voorzichtig niet te lyse de enteroïden. Centrifuge met een snelheid van minder dan 300 keer G gedurende vijf minuten om te pelleten en verwijder vervolgens de PBS. Voeg 4% paraformaldehyde toe en zet de buis een uur opzij om op kamertemperatuur te fixeren.Centrifuge met een snelheid van minder dan 300 keer G gedurende vijf minuten om te pelleten en verwijder vervolgens de paraformaldehyde. Was voorzichtig met een milliliter PBS en centrifuge met een snelheid van minder dan 300 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens de PBS.Herhaal dit wasproces met PBS één keer. Plaats de gewenste hoeveelheid van de weefselverwerkingsgel in een conische buis en verwarm deze in een droge badbrocub op 65 graden Celsius gedurende drie tot 10 minuten totdat het vloeibaar is. Voeg hierna de gesmolten weefselverwerkingsgel toe aan de pellet en meng voorzichtig.Plaats een kleine kloonring in een coverslip. Pipette het weefsel verwerking gel en enteroïde mengsel in de kloonring die is gemonteerd op een coverslip. Laat de weefselverwerkingsgel en het enteroïde mengsel gedurende een uur stollen op vier graden Celsius.Dompelen vervolgens de kloonring onder met het gestolde mengsel in 70%-ethanol om zich voor te bereiden op paraffinebedding. Onmiddellijk na het beplating verschijnen de vers isolerende darmcrypten als langwerpige staven. Binnen enkele uren zullen de enteroïden een ronde uitstraling krijgen.In de komende dagen zullen de enteroïden beginnen met het vormen van bollen. Ontluikend moet optreden tussen de vijf tot 10 dagen, dat is wanneer enteroïde verzameling moet optreden. De groeiende enteroïden vertonen ook polariteit, met een gecentraliseerd lumen, een apicale rand en een basilateraldomein.Enteroïden vertonen ook structurele integriteit vertegenwoordigd door een robuuste actin cytoskeleton. Na enkele dagen in de cultuur ervaren de met LBS behandelde enteroïden meer apoptose en hebben ze een lagere opbrengst dan de controlegroep. Zoals te zien in menselijke NEC in murine modellen van NEC, een verhoogde expressie van tol als receptor vier is te vinden in LPS behandeld enteroïden in vergelijking met controles.De enteroïden kunnen ook worden verzameld voor RNA en eiwitextractie met behulp van gevestigde qRT-PCR en westerse blotting technieken genexpressie en eiwitisolatie kan worden uitgevoerd.

a-novel-human-epithelial-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the development of necrotizing enterocolitis disease in a human-derived neonatal enteroid model induced by lipopolysaccharides treatment. This model helps to study intestinal pathophysiology.

Induction of Necrotizing Enterocolitis in Human Epithelial Enteroid Model

Dit protocol beschrijft een apicale necrotiserende enterocolitis (NEC)-in-een-schotelmodel met behulp van enteroïden in de dunne darm met omgekeerde polariteit, waardoor toegang tot het apicale oppervlak mogelijk is. We bieden een immunofluorescentiekleuringsprotocol om NEC-gerelateerde epitheliale verstoring te detecteren en een methode om de levensvatbaarheid te bepalen van apicale enteroïden die zijn onderworpen aan het NEC-in-a-dish-protocol.

In vitro Apiical-Out Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Dit protocol beschrijft de oprichting van enteroïden, een driedimensionaal darmmodel, uit foetaal darmweefsel. Immunofluorescente beeldvorming van epitheliale biomarkers werd gebruikt voor modelkarakterisering. Apicale blootstelling van lipopolysacchariden, een bacterieel endotoxine, met behulp van micro-injectietechniek geïnduceerde epitheliale permeabiliteit op een dosisafhankelijke manier gemeten door de lekkage van fluorescerende dextran.

Testen van epitheliale permeabiliteit bij foetale weefsel-afgeleide enteroïden

Dit protocol beschrijft een in vitro model van necrotiserende enterocolitis (NEC), dat kan worden gebruikt voor mechanistisch onderzoek naar de pathogenese van ziekten. Het beschikt over een microfluïdische chip bezaaid met darmenteroïden die zijn afgeleid van de menselijke neonatale darm, endotheelcellen en het darmmicrobioom van een pasgeborene met ernstige NEC.

Microfluïdisch model van necrotiserende enterocolitis met menselijke neonatale darmenteroïden en een dysbiotisch microbioom

Dit protocol schetst een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis (NEC) en daaropvolgende isolatie van lamina propria-immuuncellen uit de neonatale muizendunne darm.

Een neonataal muismodel van necrotiserende enterocolitis en lamina propria-isolatie voor profilering van immuuncellen

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door...

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Monocyt-afgeleide macrofagen belangrijke cellen van het aangeboren immuunsysteem. Hier beschrijven we een eenvoudig te...

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Model te Heterogeniteit van Human Macrophage Differentiatie en Polarisatie Studie

Het humaan respiratoir syncytieel virus (HRSV) kan ernstige bronchiolitis veroorzaken bij jonge zuigelingen. Een deel van de pathogenese van ernstige HRSV-ziekte wordt veroorzaakt door de immuunrespons van de gastheer. Stimulatie van primaire menselijke immuuncellen met HRSV biedt een snel en reproduceerbaar modelsysteem om de activering van ontstekingsroutes en infectie te bestuderen.

Een in vitro model om immuunresponsen van humane perifere bloedmononucleaire cellen op humane respiratoire syncytiële virusinfectie te bestuderen

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Leer hoe je menselijke enteroiden kweekt uit neonataal darmweefsel om necrotiserende enterocolitis te bestuderen. Dit model maakt ethisch onderzoek naar inflammatoire respons en therapeutische interventies mogelijk.

Een nieuwe menselijke epitheliale Enteroid Model van Necrotiserende Enterocolitis

Meer video's verkennen