Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Deze methode toont de kalibratie van het kwantificeren van eiwithoeveelheid in vloeibaar monster met single-molecule proces voor het tellen. Specifiek, het kan illustreren hoe eiwit populaties fluorescerend kunnen worden gelabeld op elk molecuul niveau. Eerdere methoden uitgevoerd bulk metingen om molaire verhoudingen van fluorescerende en eiwitmoleculen te analyseren, maar ze kunnen niet onthullen hoe heterogeen eiwit populaties daadwerkelijk worden gelabeld.

Onze methoden kunnen het direct doen op het niveau van één molecuul. Onze methode kan worden uitgebreid naar ultragevoelige en geavanceerde moleculaire concentratietesten, wat zal leiden tot toekomstige diagnostische methoden, waardoor efficiënte bevindingen van pathogene moleculen in specimens mogelijk zijn. Onze methode kan worden toegepast op analyse van afzonderlijke eiwitsoorten met behulp van fluorescerende antilichamen, evenals meerdere soortenanalyse met behulp van niet-specifieke etiketten voor alle eiwitten gescheiden door elektroforese of chromatografie.

Het meest kritieke punt van de techniek is het verkrijgen van gegevens reproduceerbaarheid. Ik adviseer het houden van dezelfde experimentele conditie zoveel mogelijk bij het meten van meerdere monsters. Visuele demonstratie van deze techniek zal zorgen voor hoe elke experimentele stap stabiel en reproduceerbaar te maken.

Het zal ook een ongewone stap in biochemie protocollen, zoals de spin-coating en het wassen van microscoop coverslips. Om deze procedure te starten, stelt u de lysing buffer en 1%Tween-20 voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik natriumhydroxide om de pH aan te passen aan 12.

Meng 100 microliter lysing buffer met een microliter van een molaire DDT en vier microliters van 50%CHAPS. Voeg een microliter van de voorbereide celcultuur toe en homogeniseer de oplossing door langzaam pipetting om bubbels te voorkomen. Broed in het donker bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met zachte agitatie.

Vervolgens, rehomogenize de oplossing door pipetting het op en neer langzaam. Voeg een microgram Cy3 NHS ester kleurstof en homogeniseren van de oplossing door het vertragen van pipetting om bubbels te voorkomen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met zachte agitatie.

Herhaal dit proces, het toevoegen van dezelfde hoeveelheid kleurstof en het uitbroeden van het monster een keer. Voeg 100 microliter van 0,8 molaire HEPES-natriumhydroxide toe om de pH van de oplossing aan te passen aan 7.2 en om de reactie te blussen. Langzaam pipette op en neer om de oplossing te homogeniseren.

Voeg vervolgens 20 microliter biotine-2-amine en vijf microliter EDC toe. Homogeniseer de oplossing door langzaam op en neer te pipetten. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur met zachte agitatie.

Gebruik hierna een ultrafiltratiekolom met een afsnede van 10 kiloDalton om niet-gereageerde etiketten te verwijderen en het monster te concentreren. Na het uitvoeren van standaard SDS-PAGE voor het eiwitmonster en een moleculaire ladder, beeld de gel om de locatie van de eiwitbanden te identificeren. Gebruik een scherp mes om de gelporties uit te snijden die eiwitfracties van belang omvatten die op de plaatsen van de banden worden gebaseerd.

Ten eerste, uiteengezet coverslips die 22 millimeter bij 22 millimeter en zijn 0,15 millimeter dik. Gebruik een plasmareiniger om de coverslips één minuut bloot te stellen aan luchtplasma om hun oppervlakken schoon te maken en te activeren. Gebruik vervolgens een spincoater om de coverslips te laten draaien met 200 microliters avadine buffer gedurende vijf seconden bij 500RPM, gevolgd door 30 seconden bij 1000 RPM.

De afdekplaten 15 minuten op kamertemperatuur uitbroeden om ze te laten drogen. Gebruik een eiwitmonster dat is verdund om coverslips voor het eiwitmonster te bereiden. Plaats 100 microliter van het verdunde monster op het midden van de met avadin bedekte coverslips.

Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Om de positieve controle voor te bereiden, plaatst u 100 microliters gezuiverde fluorescerende biotine in vijf micromolar HEPES-natriumhydroxide bij pH 7.2 in het midden van een met avadine gecoate coverslip. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.

Om de negatieve controle voor te bereiden, spin jas plasma coverslips met 200 microliters van vijf HEPES-natriumhydroxide met twee milligram per milliliter BSA zonder avadine. Voeg 100 microliter toe aan gezuiverde fluorescerende biotine in vijf micromolar HEPES-natriumhydroxide bij pH 7.2. Incubeer in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Spoel hierna elke coverslip af met 200 microliters gedestilleerd water door aan de randen te pipetten, zodat u het midden van de coverlip niet aanraakt met de pipetpunt. Herhaal deze was drie keer. Stel vervolgens een even groot aantal nieuwe coverslips gedurende één minuut bloot aan luchtplasma.

Plaats een gereinigde coverslip op elke monstergebonden coverslip om te voorkomen dat drogen. Start een breedveld of evanescente veldfluorescentiemicroscoop. Stel een coverslip op de microscoop en vind de focus.

Voer vervolgens een tegelscan uit om ten minste 100 afbeeldingen te verkrijgen. In deze studie wordt de etikettering van homogeniteit van elke gelabelde eiwitsoort in cellen na scheiding gekwantificeerd met SDS-PAGE. De ruwe beeldgegevens voor verschillende moleculaire gewichtsfracties van eiwitten uit HeLa-cellysaat, evenals de positieve en negatieve controles, zijn hier te zien.

Terwijl zowel het eiwitmonster als de positieve controle tussen de 100 en 500 vlekken per beeld vertonen, vertoont de negatieve controle zeer weinig tot niets. Dit toont aan dat het proces voldoende remt niet-specifieke binding van kleurstoffen aan de coverslip oppervlak. Spot intensiteit histogrammen voor de eiwitmonsters en de positieve controle presenteren meerdere pieken, die de stochastische binding van kleurstoffen aan primaire amines in eiwitten en avadine tetramer structuren respectievelijk vertegenwoordigen.

Alle vlekken toonden knipperende en stapsgewijze fotobleaching met continue laser excitatie, met de nadruk op observatie op het niveau van een enkel molecuul. De labelbezetting, of LO, wordt vervolgens berekend op basis van de verhouding tussen het aantal vlekken in elk eiwitmonster tot die in de positieve controle. De LO gemeten uit de HeLa cel lysate monster varieert van 50%voor de kleinere moleculaire gewichtsfractie, tot 90%voor de hogere moleculaire gewichtsfractie.

De LO voor het hele proteome monster zonder scheiding wordt gezien als 72%Het is van cruciaal belang om vers gemaakte reagentia te gebruiken en stof te voorkomen, vooral tijdens de bereiding van de coverslips. Na deze procedure kan een enkele molecuul telling analyse in een bepaald volume worden uitgevoerd om de concentraties van elk eiwit te kwantificeren. Bijvoorbeeld, analyse op een rauw product, of gel en capillaire elektroforese producten, kan worden uitgevoerd.

Deze techniek maakt de weg vrij voor het gebruik van single molecule fluorescentie beeldvorming aan moleculaire geneeskunde, organische chemie, en omics analyse. Door het concept tussen concentratie en getallen te overbruggen. Geconcentreerd natriumhydroxide is corrosief en bij de behandeling ervan moet voldoende bescherming worden gedragen.

Ook kan hoog vermogen laserstraling oogschade veroorzaken, dus beschermende brillen kunnen worden gedragen.