Name: Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Leer een methode voor kwantificering van eiwitlabeling op enkelmolecuulniveau met fluorescentie. Deze techniek onthult heterogeniteit die bulkmetingen niet detecteren en opent mogelijkheden voor diagnostische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Masae Ohno en Kazuya Nishimura voor experimentele hulp en advies. Dit werk werd gesteund door PRESTO (JPMJPR15F7), Japan-Science and Technology Agency, Grants-in-aid voor jonge wetenschappers (A) (24687022), uitdagende verkennend onderzoek (26650055) en wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (23115005), Japan Society for de bevordering van wetenschap, en door subsidies van de Takeda Science Foundation en de Mochida Memorial Foundation voor medische en farmaceutische Research. S.L. erkent ondersteuning vanuit de RIKEN International-programma koppelen (IPA) programma.

1. cel voorbereiding
<ol><li>Cultiveren van HeLa cellen in een 10 cm schotel bij 37 ° C minder dan 5% CO,2 in Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium met 10% foetale runderserum.</li>
	<li>Verzamelen exponentieel groeiende cellen zodra zij 70% confluentie, na ATCC instructies17hebben bereikt.<ol>
<li>Spoel de cellen met 5 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7.4). Verwijderen van PBS.</li>
		<li>Voeg vervolgens 1 mL 0,1% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA). Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.</li>
		<li>De progressie van cel dissociatie door microscopie volgen.</li>
		<li>Zodra de cellen worden ronde en zijn losgemaakt van de schotel, Voeg 4 mL groeimedium, en cel agglomeratie breken door pipetteren.</li>
		<li>Het aantal cellen met behulp van een cel counter.</li>
		<li>Centrifugeer bij 150 x g gedurende 10 minuten in een centrifugebuis. Verwijder het medium en resuspendeer de pellet cel met 5 mL 1 x PBS (pH 7.4).</li>
		<li>Herhaal stap 1.2.6. Resuspendeer de cellen in 1 x PBS (pH 7.4) om een eindconcentratie van 106 cellen/mL met behulp van het nummer van de graaf in stap 1.2.5. Opmerking: De celsuspensie kunnen aliquoted en opgeslagen bij-80 ° C voor enkele maanden. Herhalen van een vorst/dooi cyclus moet worden vermeden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cel lysis en fluorescerende labeling
<ol><li>Breng 10 mL lysing van buffer (0,1 M boraat, 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) en 1% Tween-20). Aangepast aan de pH 12 met behulp van 2 M NaOH. Let op: Geconcentreerde NaOH is corrosief. Draag geschikte handschoenen en bril bij de voorbereiding van deze oplossing. Opmerking: Lysing buffer kan worden opgeslagen voor tot een week bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Mix 100 μl van het lysing van buffer met 1 μL van 1 M dithiothreitol (DTT) en 4 μL van 50% 3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).</li>
	<li>Meng 1 μL van de cultuur van de cel (ongeveer 1000 cellen) met de gemengde lysing buffer uit stap 2.2. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met zachte agitatie. Meng de oplossing opnieuw door pipetteren langzaam.</li>
	<li>Voeg 1 μl van 2 μg/mL Cy3 NHS-ester kleurstof. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 5 min. in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Opmerking: De hoge pH van deze buffer veroorzaakt neutralisatie van lysine residuen in eiwitten, wat leidt tot een hogere reactiviteit.</li>
	<li>Herhaal de toevoeging van 1 μL van 2 μg/mL Cy3 NHS-ester kleurstof. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 10 min in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Opmerking: Dit herhaald toevoeging van NHS-ester kleurstof kan labeling efficiënter omdat sommige van de kleurstof Cy3 NHS-ester is gehydrolyseerd en gedeactiveerd door het hoge pH van de buffer van de reactie.</li>
	<li>Aanpassen aan pH 7,2 door toevoeging van 100 μl van 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES)-NaOH pH 7,2 om quench de reactie. Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels.</li>
	<li>Toevoegen van 20 μL van 19 mg/mL Biotine-(polyethyleenglycol (PEG))2-amine en 5 μl van 20 mg/mL 1-ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC). Meng de oplossing door langzaam pipetteren Voorkom bubbels. Incubeer gedurende 1 uur in het donker bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Opmerking: Deze stap biotinylation is nodig om de eiwitmolecules op een Microscoop dekglaasje aan bij een vaste dichtheid en met geen bias voor eiwit soorten vast te stellen.</li>
	<li>Verwijder spoorverontreiniging labeling reagentia en concentreren van het monster met behulp van een kolom ultrafiltratie met 10 kDa cut-off, na instructies van de fabrikant. Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Het monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor enkele weken.</li>
</ol>3. Proteoom scheiding en terugwinning
<ol><li>Voeg 4 x SDS monster buffer (200 mM Tris-HCl pH 6.8, van 4% SDS, 4% glycerol en 0,4% bromophenol blauw). Opmerking: Om te voorkomen beschadiging van de kleurstof, de eiwitSteekproef zoals gedaan in standaard SDS-pagina niet verwarmd moet worden, en moet bij kamertemperatuur worden bewaard.</li>
	<li>Standaard SDS-pagina voor de eiwitSteekproef en een moleculaire ladder, met behulp van 20% acrylamide gel uitvoeren. Migreren van het monster in de gel met een constante spanning (160 V) tot de migratie voorkant verlaat net de gel.</li>
	<li>Het imago van de gel ter identificatie van de locatie van de eiwit-bands (Figuur 3).</li>
	<li>Knip uit de delen van de gel met inbegrip van eiwitfracties van belang met behulp van een scherp mes, gebaseerd op de locaties van de band. Fractioning op 16, 23, 55 en 120 kDa toppen, en op 19 – 25, 25-32, 32 – 42, 42-54, 54 – 69, 69 – 97, 97 – 136 en 136-226 kDa regio's zijn afgebeeld in Figuur 3.</li>
	<li>Uittreksel eiwitten met behulp van een dialyzer door electroelution met een poriegrootte van 6 tot en met 8 kDa, na instructies van de fabrikant. Opmerking: Het uitgepakte monster kan worden achtergelaten bij-80 ° C voor enkele weken.</li>
</ol>4. Microscoop dekglaasje aan voorbereiding
<ol><li>200 μL van avidin buffer (5 mM HEPES-NaOH pH 7,2, 10 ng/mL avidin en 2 mg/mL bovien serumalbumine (BSA)) voorbereiden op elk monster.</li>
	<li>Coverslips van 22 x 22 mm en 0,15 mm dikte voor te bereiden. Bloot de coverslips om lucht plasma met behulp van een plasma cleaner voor 1 min te reinigen en activeren hun oppervlakken.</li>
	<li>Jas de coverslips met avidin door 200 μL van de spin-coating van avidin buffer met behulp van een draai-coater gedurende 5 seconden bij 500 t/min, gevolgd door 30 seconden bij 1000 omwentelingen per minuut. Incubeer de coverslips gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur laten drogen.</li>
	<li>Coverslips voorbereiden op de eiwitSteekproef.<ol>
<li>Verdun de eiwitSteekproef (vanaf 3.5) 100 keer in de 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>Plaats 100 μl van het verdunde monster op het oppervlak in het midden van de avidin-gecoate dekglaasje aan (uit stap 4.3).</li>
		<li>In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiden van de positieve controle.<ol>
<li>Plaats 100 μl van 10 ng/mL gezuiverd fluorescerende Biotine in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2 in het midden van de avidin bekleed dekglaasje aan (uit stap 4.3).</li>
		<li>In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Opmerking: Deze positieve controle dekglaasje aan biedt de dichtheid van avidin bindende vlekken, die wordt gebruikt voor het berekenen van de LO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De negatieve controle voor te bereiden.<ol>
<li>Spin-jas het plasma gereinigd dekglaasje aan met 200 μL van 5 mM BSA HEPES-NaOH en 2 mg/mL (zonder avidin).</li>
		<li>Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur drogen.</li>
		<li>Voeg 100 μl van 10 ng/mL gezuiverd fluorescerende Biotine in 5 mM HEPES-NaOH pH 7,2.</li>
		<li>In het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen. Opmerking: Deze negatieve controle dekglaasje aan biedt de hoeveelheid niet-specifieke binding van fluorescerende Biotine aan het dekglaasje aan zonder avidin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spoel elke dekglaasje aan met 200 μL van gedestilleerd water door pipetteren aan de rand van het dekglaasje aan om niet te raken het midden van het dekglaasje aan met de tip. Herhaal dit wassen drie keer. Opmerking: Na het zuigen water op het dekglaasje aan, water moet worden onmiddellijk gelegd terug op het dekglaasje aan om te voorkomen dat het volledig uitdrogen.</li>
	<li>Bloot lucht plasma naar hetzelfde nummer van coverslips zoals in stap 4.2.</li>
	<li>Plaats de schoongemaakte dekglaasje aan op de monster-gebonden dekglaasje aan vanaf stap 4.7 om te voorkomen dat het drogen.</li>
</ol>5. observatie met enkel molecuul fluorescentie microscopie
<ol><li>Opstarten van een veld van het breed-gebied of vluchtig fluorescentie Microscoop. Let op: Direct of verspreide laserstraling kan leiden tot oog of beschadiging van de huid. Draag geschikte beschermende bril en schild van de laser licht weg. Opmerking: Voor de installatie van Microscoop, Raadpleeg onze vorige publicatie16. Kortom, een breed-gebied of vluchtig veld fluorescentie Microscoop voorzien van een high-power 488 nm laser excitatie, een objectief van hoge numerieke diafragma en een hoge gevoeligheid camera kan worden gebruikt voor deze meting. Verder, voor een geautomatiseerde meting, een computergestuurde XY translationeel monster stadium, mechanische luiken voor laser excitaties en een auto-focus systeem aanbevolen te worden geïnstalleerd.</li>
	<li>Stel het dekglaasje aan op de Microscoop en vinden de focus.</li>
	<li>Het uitvoeren van een scan van de tegel te verkrijgen van ten minste 100 afbeeldingen. Opmerking: De laser verlichting moet worden gecontroleerd met mechanische luiken worden blootgesteld aan het monster alleen bij het opnemen van beelden met de camera, om te minimaliseren photobleaching. Als er veel monsters, wordt geautomatiseerde meting met behulp van een computerprogramma om te controleren de Microscoop apparaten aanbevolen. Elke afbeelding bevat meestal 100-500 enkel molecuul plekken bij het gebruik van een objectief 60 x.</li>
</ol>6. analyse en extractie van informatie van het beeld
<ol><li>Als de afbeelding oneffenheden als gevolg van de laser verlichting patroon heeft, verrichten beeld processing om te corrigeren18.<ol>
<li>Verwerven een referentiebeeld door te meten met een dekglaasje aan steekproef uit uniform-spread kleurstoffen met behulp van een camera instellen gelijk aan stap 5.3.</li>
		<li>Offset afbeeldingen inlezen door te meten met de excitatie van geen laser met behulp van dezelfde camera instelling.</li>
		<li>Elke pixelwaarde in elk monster beeld en het referentiebeeld met de waarde van de verschoven afbeelding aftrekken.</li>
		<li>Verdeel elke pixelwaarde in de afgetrokken sample images door de waarde in het afgetrokken referentiebeeld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Goed verworven beelden verzamelen en verwijderen van de achtergrond van de afbeelding.<ol>
<li>Afbeeldingen met grote fluorescerende aggregaten handmatig verwijderen.</li>
		<li>Verwijder de achtergrond van de afbeelding door de rollen-bal algoritme19 met een bal straal van 50 pixels met behulp van ImageJ20toe te passen.</li>
		<li>Afbeeldingen verscherpen door af te trekken onscherpe beelden met behulp van ImageJ (scherper beeld functie).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vinden en analyseren van één molecuul plekken in beelden.<ol>
<li>Enkel molecuul vlekken inleven in de Yen drempel algoritme21 ImageJ gebruiken.</li>
		<li>Filteren van spots met minder dan twee pixels uit te sluiten van donkere geluid van de camera en de vlekken meer dan 20 pixels als u wilt uitsluiten van de verzamelingen van proteïnen met behulp van ImageJ (ROI manager).</li>
		<li>Het aantal plekken in elke afbeelding. Met behulp van de verlichting gecorrigeerde beelden (stap 6.1.4), analyseren total intensiteiten in pixels voor elke vlek met behulp van ImageJ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereken de labeling bezetting (LO), met de volgende formule: LO = (aantal graven in de steekproef / aantal graven in de positieve controle) x 100</li>
	<li>Bereken het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een enkele eiwit molecule (n̄kleurstof).<ol>
<li>Een histogram van de intensiteit van elke plek te analyseren. Opmerking: Het histogram heeft meestal diverse toppen, en elke piek vertegenwoordigt een verschillend aantal kleurstof moleculen gebonden aan een eiwit. De eerste, tweede en derde piek in het histogram komt overeen met 1, 2 en 3 moleculen, respectievelijk.</li>
		<li>Bereken de gemiddelde intensiteit van het histogram. Ook de piek intensiteit van de eerste piek te berekenen door het toepassen van een Gaussian montage.</li>
		<li>Berekenen n̄kleurstof door te delen met de piek intensiteit de gemiddelde intensiteit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wilhelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+draft+of+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.</a> Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+enrichment+and+mass+spectrometry+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity enrichment and mass spectrometry analysis of protein methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+staining+of+proteins+in+polyacrylamide+gels+including+isoelectric+focusing+gels+with+clear+background+at+nanogram+sensitivity+using+Coomassie+Brilliant+Blue+G-250+and+R-250%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250.</a> Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).</li>
<li>Berggren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Background-free%2C+high+sensitivity+staining+of+proteins+in+one-+and+two-dimensional+sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gels+using+a+luminescent+ruthenium+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Background-free, high sensitivity staining of proteins in one- and two-dimensional sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using a luminescent ruthenium complex.</a> Electrophoresis. 21 (12), 2509-2521 (2000).</li>
<li>Butt, R. H., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+as+a+near-infrared+fluorescent+stain%3A+a+systematic+comparison+with+Sypro+Ruby+for+in-gel+protein+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue as a near-infrared fluorescent stain: a systematic comparison with Sypro Ruby for in-gel protein detection.</a> Molecular & cellular proteomics. 12 (12), 3834-3850 (2013).</li>
<li>Nanda, J. S., Lorsch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+a+protein+with+fluorophores+using+NHS+ester+derivitization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Labeling a protein with fluorophores using NHS ester derivitization.</a> Methods in Enzymology. , 87-94 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+site-specific+labeling+of+proteins+via+cysteines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines.</a> Bioconjugate chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).</li>
<li>Dickson, R. M., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On%2Foff+blinking+and+switching+behaviour+of+single+molecules+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">On/off blinking and switching behaviour of single molecules of green fluorescent protein.</a> Nature. 388 (6640), 355-358 (1997).</li>
<li>Penna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. 456 (7218), 116-120 (2008).</li>
<li>Ji, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+stoichiometry+of+the+unitary+calcium-release-activated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Functional stoichiometry of the unitary calcium-release-activated calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (36), 13668-13673 (2008).</li>
<li>Ulbrich, M. H., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+counting+in+membrane-bound+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Subunit counting in membrane-bound proteins.</a> Nature Methods. 4 (4), 319-321 (2007).</li>
<li>Sugiyama, Y., Kawabata, I., Sobue, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+absolute+protein+numbers+in+single+synapses+by+a+GFP-based+calibration+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of absolute protein numbers in single synapses by a GFP-based calibration technique.</a> Nature Methods. 2 (9), 677-684 (2005).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+dynamin2+dynamics+and+interplay+during+clathrin-mediated+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and dynamin2 dynamics and interplay during clathrin-mediated endocytosis.</a> The Journal of Cell Biology. 205 (5), 721-735 (2014).</li>
<li>Leclerc, S., Arntz, Y., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+Single+Molecule+Imaging+to+Proteome+Analysis+by+Quantitation+of+Fluorescent+Labeling+Homogeneity+in+Complex+Protein+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Extending Single Molecule Imaging to Proteome Analysis by Quantitation of Fluorescent Labeling Homogeneity in Complex Protein Samples.</a> Bioconjugate chemistry. 29 (8), 2541-2549 (2018).</li>
<li>Ian Freshney, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIan+Freshney%2C+R+%22Culture+of+Animal+Cells%3A+A+Manual+of+Basic+Technique+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2015).</li>
<li>Taniguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+E.+coli+proteome+and+transcriptome+with+single-molecule+sensitivity+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells.</a> Science. 329 (5991), 533-538 (2010).</li>
<li>Sternberg, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Image+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Computer%22%5BJournal%5D)">Biomedical Image Processing.</a> Computer. 16 (1), 22-34 (1983).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Yen, J. C., Chang, F. J., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+criterion+for+automatic+multilevel+thresholding%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A new criterion for automatic multilevel thresholding.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 4 (3), 370-378 (1995).</li>
<li>Livnah, O., Bayer, E. A., Wilchek, M., Sussman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structures+of+avidin+and+the+avidin-biotin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structures of avidin and the avidin-biotin complex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (11), 5076-5080 (1993).</li>
<li>Mostovenko, E., Hassan, C., Rattke, J., Deelder, A. M., van Veelen, P. A., Palmblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptide+and+protein+fractionation+methods+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22EuPA+Open+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptide and protein fractionation methods in proteomics.</a> EuPA Open Proteomics. 1, 30-37 (2013).</li>
<li>Volpe, P., Eremenko-Volpe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+studies+on+cell+proteins+in+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative studies on cell proteins in suspension cultures.</a> European Journal of Biochemistry. 12 (1), 195-200 (1970).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+low-copy+number+proteins+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting low-copy number proteins in a single cell.</a> Science. 315 (5808), 81-84 (2007).</li>
<li>Johnson, A. C., Bowser, M. T. H. igh- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Speed%2C+Comprehensive%2C+Two+Dimensional+Separations+of+Peptides+and+Small+Molecule+Biological+Amines+Using+Capillary+Electrophoresis+Coupled+with+Micro+Free+Flow+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High-Speed, Comprehensive, Two Dimensional Separations of Peptides and Small Molecule Biological Amines Using Capillary Electrophoresis Coupled with Micro Free Flow Electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 89 (3), 1665-1673 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren de volgende concurrerende financiële interesseren: RIKEN heeft een octrooi-aanvraag ingediend over deze resultaten met S.L. en Y.T. genoemd als mede-uitvinders.

Dit witboek beschrijft een protocol om te kwantificeren van de labeling homogeniteit van elke soort gelabelde proteïnen in cellen na scheiding met SDS-pagina (stap 3). De methode van scheiding kan met andere methoden, zoals vloeibare chromatografie of capillaire elektroforese, waarmee scheiding en versplintering van cellulaire eiwitten met een hoge resolutie, terwijl het vereisen van speciale apparatuur23worden vervangen. De labeling methode met behulp van NHS-ester in het huidige protocol kan wor...

Proteoom analyse, die is gericht op het kwantificeren van de hele set van eiwitmolecules uitgedrukt in de cel, is een waardevolle benadering in huidige biologische en medische studies. Deze analyse is vaak afhankelijk van de Spectrometrie van de massa, waarmee eiwit soorten op basis van spectra gegenereerd door eiwit ionisatie1,2,3. Een alternatieve methode voor proteoom-analyse is elektroforese, met inbegrip van polyacrylamide gelelektroforese (pagina), capillaire elektroforese en tweedimensionale (2D) gelelektroforese. Deze methode is afhankelijk van de aspecifieke fluorescerende etikettering van alle de eiwitmolecules in de geanalyseerde cellen, gevolgd door elektroforetische scheiding en opsporing en kwantificering van elke soort eiwit. Om te bereiken dat de vereiste aspecifieke eiwit labeling, is een strategie het gebruik van fluorescente kleurstoffen die aan eiwitten via elektrostatische en hydrofobe interacties, zoals Coomassie Blue en Sypro-Ruby4,5,6 binden kunnen . Een alternatieve strategie is het gebruik van covalente labelen met kleurstoffen met N-hydroxysuccinimide (NHS) ester- of maleimide, die covalent aan eiwitten door middel van gemeenschappelijke residuen zoals primaire amines en thiolen binden kan, respectievelijk7, 8.
Ondertussen, de gevoeligheid van de fluorescentie detectie is ideaal voor het analyseren van lage-overvloed eiwitten en kleine aantallen cellen. Enkel molecuul fluorescentie imaging is één van de meest gevoelige methodes waarmee de detectie van individuele fluorescente kleurstoffen en gelabelde proteïnen in vitro en in vivo9,10,11,12, 13,14,15. Toepassing van deze beeldvorming methode elektroforese gebaseerde Proteoom analyse wordt verwacht om zeer gevoelige en kwantitatieve tests door het tellen van afzonderlijke fluorescently gelabelde proteïnen. Het blijft echter onduidelijk of labelen met fluorescente kleurstoffen is homogeen genoeg over alle de eiwitmolecules, en hoe deze homogeniteit wordt beïnvloed door verschillende eiwit soorten (Figuur 1). Eenvoudige bulk oplossing metingen kunnen worden gebruikt voor het verkrijgen van een molaire ratio van fluorescente kleurstoffen aan eiwitten 'koppeling efficiëntie'8 of 'labelen efficiëntie' genoemd, maar deze eigenschap biedt geen informatie op de homogeniteit van de etikettering onder eiwitmolecules.
Hier beschrijven we het protocol voor een bepaling te onderzoeken de labeling homogeniteit voor alle soorten van de eiwitten in de cel (Figuur 2)16. De twee belangrijkste stappen van deze bepaling zijn EiwitReiniging en beeldvorming. In de eerste stap, alle van de eiwitten in de cellen worden fluorescently aangeduid en biotinyleerd, vervolgens uitgepakt afzonderlijk met behulp van gelelektroforese gevolgd door electroelution. In de tweede stap, worden fluorescentie-eigenschappen van individuele eiwitmolecules in de uitgepakte monsters geëvalueerd op basis van één molecuul imaging. Van deze gegevens, parameters die belangrijk zijn voor het tellen analyse, zoals het percentage eiwitten aangeduid met ten minste een kleurstof, die wij noemen labeling bezetting (LO)16, en het gemiddelde aantal fluorescente kleurstoffen gebonden aan een molecule één eiwit (n̄ kleurstof), kan worden gekarakteriseerd. In het protocol, een geoptimaliseerde procedure voor het labelen van de HeLa cel Proteoom met NHS ester gebaseerde Cyanine 3 (Cy3) kleurstof wordt gepresenteerd als een voorbeeld, en kan worden aangepast met andere labeling procedures volgens onderzoek van de gewenste doelstellingen.

<table><tbody><tr><td>22x22x0.15 mm coverslip</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 nm Argon laser</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 nm dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488 nm emission filter</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>560 nm dichroic filter</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>560 nm emission filter</td><td>Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 nm fiber laser</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x oil immersion lens</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-amine</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borate</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Dojindo</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHS-ester dye</td><td>GE Healthcare</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>Dialyzer&nbsp; - D-tube, 6-8 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Nacalai-tesque</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>Epi fluorescence microscope</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Gel viewer</td><td>GE Healthcare</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener Electronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Wako</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>Size purification column 10K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

proteoom bestrijkende kwantificering van labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cel proteomes worden vaak gekenmerkt met behulp van elektroforese testen, waar alle soorten eiwitten in de cellen worden niet-specifiek aangeduid met een fluorescente kleurstof en zijn gespot door een foto-elektrische cel na hun scheiding. Enkel molecuul fluorescentie imaging kan voorzien haar vermogen voor het visualiseren van individuele fluorescerende moleculen ultrasensitive eiwit detectie. De toepassing van deze krachtige imaging methode voor elektroforese bepalingen wordt echter belemmerd door het gebrek aan manieren om de homogeniteit van het fluorescerende labeling van elke soort eiwit over de Proteoom karakteriseren. Hier, wij een methode ontwikkeld om de labeling homogeniteit het proteoom op basis van een enkel molecuul fluorescentie imaging assay evalueren. In onze meting met behulp van een steekproef van HeLa cel, het aandeel van eiwitten, aangeduid met ten minste één kleurstof, die we genoemd 'labelen bezetting' (LO), was vastbesloten om bereik van 50% tot 90%, ter ondersteuning van het grote potentieel van de toepassing van één molecuul imaging te gevoelige en nauwkeurige Proteoom-analyse.

Figuur 4 vertegenwoordigt onbewerkte afbeeldingsgegevens voor moleculair gewicht van de verschillende fracties van eiwitten uit HeLa cel lysate, evenals de positieve en negatieve controle. Terwijl zowel de eiwitSteekproef en de positieve controle tentoonstelling 100-500 plekken per beeld, geeft de negatieve controle geen of een paar plekken, waaruit blijkt dat het protocol remt voldoende niet-specifieke binding van kleurstoffen op het oppervlak van het dekgla...

Hier presenteren we een protocol om te beoordelen van de labeling homogeniteit voor elke soort eiwit in een complexe eiwitSteekproef op het niveau van één molecuul.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Deze methode toont de kalibratie van het kwantificeren van eiwithoeveelheid in vloeibaar monster met single-molecule proces voor het tellen. Specifiek, het kan illustreren hoe eiwit populaties fluorescerend kunnen worden gelabeld op elk molecuul niveau. Eerdere methoden uitgevoerd bulk metingen om molaire verhoudingen van fluorescerende en eiwitmoleculen te analyseren, maar ze kunnen niet onthullen hoe heterogeen eiwit populaties daadwerkelijk worden gelabeld.Onze methoden kunnen het direct doen op het niveau van één molecuul. Onze methode kan worden uitgebreid naar ultragevoelige en geavanceerde moleculaire concentratietesten, wat zal leiden tot toekomstige diagnostische methoden, waardoor efficiënte bevindingen van pathogene moleculen in specimens mogelijk zijn. Onze methode kan worden toegepast op analyse van afzonderlijke eiwitsoorten met behulp van fluorescerende antilichamen, evenals meerdere soortenanalyse met behulp van niet-specifieke etiketten voor alle eiwitten gescheiden door elektroforese of chromatografie.Het meest kritieke punt van de techniek is het verkrijgen van gegevens reproduceerbaarheid. Ik adviseer het houden van dezelfde experimentele conditie zoveel mogelijk bij het meten van meerdere monsters. Visuele demonstratie van deze techniek zal zorgen voor hoe elke experimentele stap stabiel en reproduceerbaar te maken.Het zal ook een ongewone stap in biochemie protocollen, zoals de spin-coating en het wassen van microscoop coverslips. Om deze procedure te starten, stelt u de lysing buffer en 1%Tween-20 voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik natriumhydroxide om de pH aan te passen aan 12.Meng 100 microliter lysing buffer met een microliter van een molaire DDT en vier microliters van 50%CHAPS. Voeg een microliter van de voorbereide celcultuur toe en homogeniseer de oplossing door langzaam pipetting om bubbels te voorkomen. Broed in het donker bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten met zachte agitatie.Vervolgens, rehomogenize de oplossing door pipetting het op en neer langzaam. Voeg een microgram Cy3 NHS ester kleurstof en homogeniseren van de oplossing door het vertragen van pipetting om bubbels te voorkomen. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met zachte agitatie.Herhaal dit proces, het toevoegen van dezelfde hoeveelheid kleurstof en het uitbroeden van het monster een keer. Voeg 100 microliter van 0,8 molaire HEPES-natriumhydroxide toe om de pH van de oplossing aan te passen aan 7.2 en om de reactie te blussen. Langzaam pipette op en neer om de oplossing te homogeniseren.Voeg vervolgens 20 microliter biotine-2-amine en vijf microliter EDC toe. Homogeniseer de oplossing door langzaam op en neer te pipetten. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur met zachte agitatie.Gebruik hierna een ultrafiltratiekolom met een afsnede van 10 kiloDalton om niet-gereageerde etiketten te verwijderen en het monster te concentreren. Na het uitvoeren van standaard SDS-PAGE voor het eiwitmonster en een moleculaire ladder, beeld de gel om de locatie van de eiwitbanden te identificeren. Gebruik een scherp mes om de gelporties uit te snijden die eiwitfracties van belang omvatten die op de plaatsen van de banden worden gebaseerd.Ten eerste, uiteengezet coverslips die 22 millimeter bij 22 millimeter en zijn 0,15 millimeter dik. Gebruik een plasmareiniger om de coverslips één minuut bloot te stellen aan luchtplasma om hun oppervlakken schoon te maken en te activeren. Gebruik vervolgens een spincoater om de coverslips te laten draaien met 200 microliters avadine buffer gedurende vijf seconden bij 500RPM, gevolgd door 30 seconden bij 1000 RPM.De afdekplaten 15 minuten op kamertemperatuur uitbroeden om ze te laten drogen. Gebruik een eiwitmonster dat is verdund om coverslips voor het eiwitmonster te bereiden. Plaats 100 microliter van het verdunde monster op het midden van de met avadin bedekte coverslips.Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Om de positieve controle voor te bereiden, plaatst u 100 microliters gezuiverde fluorescerende biotine in vijf micromolar HEPES-natriumhydroxide bij pH 7.2 in het midden van een met avadine gecoate coverslip. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.Om de negatieve controle voor te bereiden, spin jas plasma coverslips met 200 microliters van vijf HEPES-natriumhydroxide met twee milligram per milliliter BSA zonder avadine. Voeg 100 microliter toe aan gezuiverde fluorescerende biotine in vijf micromolar HEPES-natriumhydroxide bij pH 7.2. Incubeer in het donker gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Spoel hierna elke coverslip af met 200 microliters gedestilleerd water door aan de randen te pipetten, zodat u het midden van de coverlip niet aanraakt met de pipetpunt. Herhaal deze was drie keer. Stel vervolgens een even groot aantal nieuwe coverslips gedurende één minuut bloot aan luchtplasma.Plaats een gereinigde coverslip op elke monstergebonden coverslip om te voorkomen dat drogen. Start een breedveld of evanescente veldfluorescentiemicroscoop. Stel een coverslip op de microscoop en vind de focus.Voer vervolgens een tegelscan uit om ten minste 100 afbeeldingen te verkrijgen. In deze studie wordt de etikettering van homogeniteit van elke gelabelde eiwitsoort in cellen na scheiding gekwantificeerd met SDS-PAGE. De ruwe beeldgegevens voor verschillende moleculaire gewichtsfracties van eiwitten uit HeLa-cellysaat, evenals de positieve en negatieve controles, zijn hier te zien.Terwijl zowel het eiwitmonster als de positieve controle tussen de 100 en 500 vlekken per beeld vertonen, vertoont de negatieve controle zeer weinig tot niets. Dit toont aan dat het proces voldoende remt niet-specifieke binding van kleurstoffen aan de coverslip oppervlak. Spot intensiteit histogrammen voor de eiwitmonsters en de positieve controle presenteren meerdere pieken, die de stochastische binding van kleurstoffen aan primaire amines in eiwitten en avadine tetramer structuren respectievelijk vertegenwoordigen.Alle vlekken toonden knipperende en stapsgewijze fotobleaching met continue laser excitatie, met de nadruk op observatie op het niveau van een enkel molecuul. De labelbezetting, of LO, wordt vervolgens berekend op basis van de verhouding tussen het aantal vlekken in elk eiwitmonster tot die in de positieve controle. De LO gemeten uit de HeLa cel lysate monster varieert van 50%voor de kleinere moleculaire gewichtsfractie, tot 90%voor de hogere moleculaire gewichtsfractie.De LO voor het hele proteome monster zonder scheiding wordt gezien als 72%Het is van cruciaal belang om vers gemaakte reagentia te gebruiken en stof te voorkomen, vooral tijdens de bereiding van de coverslips. Na deze procedure kan een enkele molecuul telling analyse in een bepaald volume worden uitgevoerd om de concentraties van elk eiwit te kwantificeren. Bijvoorbeeld, analyse op een rauw product, of gel en capillaire elektroforese producten, kan worden uitgevoerd.Deze techniek maakt de weg vrij voor het gebruik van single molecule fluorescentie beeldvorming aan moleculaire geneeskunde, organische chemie, en omics analyse. Door het concept tussen concentratie en getallen te overbruggen. Geconcentreerd natriumhydroxide is corrosief en bij de behandeling ervan moet voldoende bescherming worden gedragen.Ook kan hoog vermogen laserstraling oogschade veroorzaken, dus beschermende brillen kunnen worden gedragen.

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op...

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Stabiele isotoop labeling van peptiden door reductieve dimethylering (Redi etikettering) is een snelle, goedkope strategie voor nauwkeurige massa-spectrometrie gebaseerde kwantitatieve proteomics. Hier laten we een robuuste werkwijze voor de bereiding en analyse van eiwitmengsels met de Redi aanpak die kan worden toegepast op vrijwel elk type monster.

Kwantitatieve Proteomics behulp Reductieve dimethylering voor stabiele isotopen Labeling

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Deze workflow beschrijft de prestaties van tijd- en kostenefficiënte verrijking van meerdere eiwitposttranslationele modificaties (PTM's) tegelijkertijd voor kwantitatieve wereldwijde proteomische analyse. Het protocol maakt gebruik van peptide-niveau PTM verrijking met meerdere geconjugeerde antilichamen, gevolgd door data-onafhankelijke acquisitie massaspectrometrie analyse om biologische inzichten te krijgen in PTM crosstalk.

Gelijktijdige affiniteitsverrijking van twee posttranslationele wijzigingen voor kwantificering en sitelokalisatie

We presenteren een geoptimaliseerd tmt-labelprotocol (tandem mass tag) dat gedetailleerde informatie bevat voor elk van de volgende stappen: eiwitextractie, kwantificering, neerslag, spijsvertering, etikettering, indiening bij een proteomics-faciliteit en gegevensanalyses.

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Het beschreven protocol biedt een geoptimaliseerde kwantitatieve proteomics-analyse van weefselmonsters met behulp van twee benaderingen: labelgebaseerde en labelvrije kwantificering. Labelgebaseerde benaderingen hebben het voordeel van een nauwkeurigere kwantificering van eiwitten, terwijl een labelvrije aanpak kosteneffectiever is en wordt gebruikt om honderden monsters van een cohort te analyseren.

Uitgebreide workflow van op massaspectrometrie gebaseerde Shotgun Proteomics van weefselmonsters

Hier presenteren we een protocol om het samenspel tussen gastheer en ziekteverwekker te profileren tijdens infectie door op massaspectrometrie gebaseerde proteomics. Dit protocol maakt gebruik van labelvrije kwantificering om veranderingen in eiwitrijkdom van zowel gastheer (bijv. macrofagen) als ziekteverwekker (bijv. Cryptococcus neoformans)in één experiment te meten.

Labelvrije kwantitatieve proteomics workflow voor discovery-driven host-pathogen interacties

Hier beschrijven we een proteomics workflow voor de karakterisering van het celoppervlakteproteoom van verschillende celtypen. Deze workflow omvat verrijking van celoppervlakte-eiwitten, daaropvolgende monstervoorbereiding, analyse met behulp van een LC-MS/MS-platform en gegevensverwerking met gespecialiseerde software.

"Celoppervlakvangst"-werkstroom voor labelvrije kwantificering van het celoppervlak-proteoom

Leer een methode voor kwantificering van eiwitlabeling op enkelmolecuulniveau met fluorescentie. Deze techniek onthult heterogeniteit die bulkmetingen niet detecteren en opent mogelijkheden voor diagnostische toepassingen.

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Meer video's verkennen