Een positionerings apparaat voor de plaatsing van muizen tijdens intranasale siRNA levering aan het centrale zenuwstelsel
15 augustus 2019
Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.
Dit protocol beschrijft het gebruik van een positioneringsapparaat voor de intranasale levering van biomoleculen aan het CZS van de muis. Het gebruik van dit apparaat vermindert de behandeling van muizen en de tijd van de behandeling aanzienlijk, wat resulteert in verbeterde efficiëntie en reproduceerbaarheid van de techniek. Om deze procedure te beginnen, beoordeel het anesthesieniveau van de muizen met pedaalreflex om het chirurgische vlak te behouden.
Plaats vervolgens het positioneringsapparaat op een gepaste afstand en hoogte om gemakkelijke toegang tot alle vereiste reagentia mogelijk te maken. Breng vervolgens zalf aan op de ogen van het dier. Bind een muis met stoelriemen, zorg ervoor dat de voorpoten van de muis natuurlijke ondersteuning bieden terwijl deze zich in een ontspannen positie bevindt zonder enig ongemak.
Herhaal de procedures voor de resterende muizen. Plaats elke muis voorzichtig op de aangewezen stoel door zijn rug parallel aan de rugsteun van de stoel en bij 90 graden aan de stoelzetel te leggen. Laat het dier op natuurlijke wijze in het hoofd naar beneden en naar voren liggen zonder te duwen of te drukken.
Zodra alle muizen zijn vastgebonden, onmiddellijk beginnen met de intranasale inenting. Om intranasale levering uit te voeren, laadt u de micropipet met twee microliters van RVG9R siRNA complexe oplossing. Houd de pipet in de dominante hand en steun deze met de andere hand om ongecontroleerde bewegingen te voorkomen tijdens het toedienen van siRNA.
Plaats ongeveer een twee microliter druppel heel dicht bij een neusgat, zodat de muis direct kan inademen. Als een kleine druppel niet gemakkelijk wordt gevormd, vervang de pipetpunt door een nieuwe en herhaal de bewerking. Duw de muiskop voorzichtig vijf seconden met wijsvinger naar beneden terwijl deze inademt en de positie behoudt.
Om drainage van het geneesmiddel in de longen te voorkomen is het belangrijk om de muiskop vijf seconden verdoofd naar beneden te duwen met de wijsvinger terwijl de muis inademt. Start een stopwatch om drie tot vier minuten na dit te klokken om inenting in de tweede nare van de eerste muis te timen. Dit tijdsinterval is noodzakelijk voor de muis om de inademing van de eerste dosis te voltooien en de normale ademhaling te herstellen.
In het interval van drie tot vier minuten tussen inenting van alternatieve nares op de eerste muis, volledige intranasale inenting van één nare in elk van de resterende drie muizen die op het apparaat worden geplaatst. Wanneer de stopwatch klinkt, inenticuleren het tweede neusgat op de eerste muis en herhaal de procedure voor de andere muizen zoals hierboven. Herhaal de procedure totdat de 20 tot 30 microliter wordt geleverd voor alle vier de muizen.
Het duurt ongeveer 30 tot 45 minuten om de volledige inentingsprocedure te voltooien. Breng de dieren terug naar hun aangewezen kooien. Laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze voldoende bewustzijn hebben herwonnen om de strenge recumbency te behouden.
Om gen-uitschakeling te beoordelen, extract RNA uit verschillende hersengebieden met een RNA-zuiveringskit, reverse transcriptie in cDNA met behulp van een cDNA synthese kit, en het uitvoeren van qPCR met primer paren. De meeste hersenlevering van het RVG9R peptide gelabeld met Alexa Fluor 488 werd voor het eerst getest met behulp van de muis positionering apparaat hier beschreven. Na 48 uur na de inenting werden verschillende organen verwijderd om A488 fluorescentie te meten.
Niets werd ontdekt in een van de organen in de negatieve controles. Aan de andere kant werd een sterk fluorescerend A488-signaal uitsluitend gedetecteerd in de hersenen van de RVG9R ingeënte groep. Bovendien werd de muisplaatsingspositie vergeleken met de supine-positiemethode en de wakkere methode voor werkzaamheid.
De resultaten gaven aan dat het positioneren van de muizen hoofd naar beneden en naar voren verbeterde de penetrantie en afzetting van RVG9R A488 in het hele hersenweefsel. Om de levering van siRNA aan de hersenen verder te bevestigen, werd het volledige hersenen aftasten uitgevoerd na één enkele intranasale toediening van RVG9R die aan Cy5 wordt gelabeld siRNA. In tegenstelling tot PBS of RVM9R resulteerde de complexiteit met RVG9R in een sterke accumulatie van siRNA in grote hersengebieden, waaronder de olfactorische bol, de cortex, de hippocampus, de thalamus, de hypothalamus, het midden van de hersenen en het cerebellum.
Het positioneringsapparaat kan worden gebruikt voor de levering van geneesmiddelen of moleculen aan het CZS van de muis. De toepassingen breiden zich uit tot het testen van therapeutica en het onderzoeken van cellulaire mechanismen in het CNS. Deze positionering apparaat is gebruikt door de onderzoekers voor het aantonen van de potentie van siRNAs bij de behandeling van West Nile Virus ziekte, evenals het verkennen van therapieën voor andere CNS-ziekten.
Overzicht
Dit protocol beschrijft het gebruik van een positioneringsapparaat voor muizen voor de intranasale toediening van een hersen-targetende peptide-siRNA-formulering, waardoor effectieve gene silencing in het centraal zenuwstelsel wordt gefaciliteerd. De methode verbetert de efficiëntie en reproduceerbaarheid, terwijl de handeling van de muizen tot een minimum wordt beperkt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Gentherapie
- Biomoleculaire Aflevering
Achtergrond
- Intranasale toediening is een veelbelovende route voor therapieën gericht op het CZS.
- Efficiënte toedieningstechnieken zijn cruciaal voor reproduceerbare resultaten.
- De positionering van de muis kan de effectiviteit van de geneesmiddeltoediening beïnvloeden.
- Gene silencing via siRNA is een waardevol instrument in neurowetenschappelijk onderzoek.
Doel van de studie
- Om een protocol vast te stellen voor effectieve intranasale toediening van siRNA aan het centrale zenuwstelsel (CZS) van de muis.
- Om de impact van de positionering van de muis op de efficiëntie van de geneesmiddeltoediening te evalueren.
- Om het nut van het positioneringsapparaat aan te tonen bij gentherapeutische toepassingen.
Gebruikte methoden
- Beoordeling van de anesthesieniveaus bij muizen voorafgaand aan het positioneren.
- Gebruik van een positioneerapparaat om muizen in een ontspannen positie te fixeren.
- Intranasale inoculatie van de siRNA-complexoplossing.
- RNA-extractie en qPCR om de effectiviteit van de gene silencing te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Significante gen-silencing waargenomen in hersengebieden na inoculatie.
- Verbeterde afgifte van siRNA met behulp van het positioneringsapparaat vergeleken met andere methoden.
- Sterke fluorescentie gedetecteerd in de hersenen van behandelde muizen, wat duidt op een succesvolle afgifte.
- Positionering met de kop naar beneden verbeterde de penetratie en depositie van de siRNA-formulering.
Conclusies
- Het apparaat voor het positioneren van muizen is effectief voor de toediening van geneesmiddelen aan het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Deze methode kan worden toegepast in diverse therapeutische en onderzoekskaders.
- Verdere studies kunnen het gebruik ervan bij de behandeling van CZS-aandoeningen onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Efficiënte intranasale toediening van therapeutica gericht op het centraal zenuwstelsel (CZS) blijft een kritieke flessenhals in de preklinische neurowetenschappen en de ontwikkeling van gentherapie. Dit positioneringsapparaat maakt gestandaardiseerde, high-throughput toediening van biomoleculen zoals siRNA, peptiden of nanodeeltjes aan de muizenhersenen mogelijk, waardoor de reproduceerbaarheid wordt verbeterd en de variabiliteit in studies naar target-engagement wordt verminderd. Door een consistente positie met het hoofd naar beneden en naar voren te ondersteunen, vergroot het de voorspellende betrouwbaarheid van de opname in het CZS en vermindert het de risico's bij de translationele ontwikkeling van intranasale therapeutische kandidaten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt nauwkeurige toetsing van therapeutische hypothesen mogelijk door een reproduceerbare toediening te garanderen van CNS-actieve verbindingen, zoals RVG9R-siRNA-complexen.
- Operationele waarde: Vermindert operator-afhankelijke variabiliteit bij de dosering, wat betrouwbare beoordelingen van target engagement en pathway-modulatie ondersteunt.
- Voorspellende betrouwbaarheid: Verbetert de consistentie in biomarker-readouts, zoals gene silencing of proteïne-knockdown, over verschillende behandelgroepen heen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gestandaardiseerde biologische systemen voor op downstream screening door een uniforme toediening van verbindingen aan het CZS te waarborgen.
- Operationele waarde: Vergemakkelijkt de reproduceerbaarheid van assays door gecontroleerde positionering van de dieren en vermindering van stress door hantering.
- Hergebruik van platform: Ondersteunt de evaluatie van diverse modaliteiten, waaronder siRNA, nanodeeltjes en antilichamen voor toediening aan het CZS.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Behoudt de relevantie voor ziektebeelden door een consistente toediening mogelijk te maken aan belangrijke hersenregio's die betrokken zijn bij neurodegeneratie of virale infectiemodellen.
- Operationele waarde: Maakt snelle screening van therapeutische kandidaten mogelijk door parallelle verwerking van maximaal acht muizen per sessie.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door de betrouwbaarheid van gegevens over CNS-blootstelling en doelwitmodulatie te vergroten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het apparaat wordt geïntegreerd in de discovery-workflow, van vroege targetvalidatie tot lead-optimalisatie, ter ondersteuning van betrouwbare beoordelingen van de CNS-aflevering voorafgaande aan IND-onderzoeken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door een consistente toediening van siRNA- of peptide-therapeutica mogelijk te maken om targetmodulatie in vivo te valideren.
- Screening: Verbetert de assay-gereidheid en reproduceerbaarheid door de positionering van dieren tijdens intranasale toediening van verbindingen te standaardiseren.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van CNS-opname mogelijk via fluorescentie, qPCR of biomarker-readouts tussen behandelingsgroepen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt discovery met preklinische continuïteit door de betrouwbaarheid van CNS-toedieningsmetrieken te verbeteren die worden gebruikt in dosisbereik- en effectiviteitsstudies.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar platform voor het evalueren van meerdere CNS-gerichte modaliteiten over projecten en therapeutische gebieden heen.
Operationele impact & impact op de onderneming
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in CNS-aflevering en target-engagement door procedurele variabiliteit te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de doorvoersnelheid en standaardisatie, waardoor de handmatige tijd en de afhankelijkheid van technici worden verminderd.
- Strategische waarde: Ondersteunt betere go/no-go-beslissingen door de datakwaliteit te verbeteren en het aantal fout-negatieven in CNS-afleveringsassays te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van intranasale therapeutische kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare CNS-opnamedata.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist training in anesthesiebeoordeling en het correct vastzetten van het dier om comfort en een juiste positionering te garanderen.
- Is afhankelijk van toegang tot apparatuur voor intranasale toediening, zoals micropipetten en steriele tips, voor een consistente druppelvorming.
- Vereist standaardisatie tussen teams om een uniforme positionering (hoofd naar beneden en naar voren) en timing tussen de inoculaties in de neusgaten te waarborgen.
- Moet worden aangepast aan verschillende muizenstammen of -formaten door gebruik te maken van verstelbare stoelhoogte en kantelfuncties.
- Beperkt tot procedures waarbij een precieze intranasale toediening vereist is; niet geschikt voor intraveneuze of orale toedieningswegen.
