Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

In de natuur is Cas9 een immuuneiwit tegen binnenvallende virussen die de evolutie de voorkeur geeft aan Cas9 met promiscue specificiteit die viraal DNA kan klemmen met spontane mutaties. We bouwden een kunstmatig gericht evolutiesysteem dat de voorkeur geeft aan een geoptimaliseerde Cas9-variant met een hoge specificiteit. Zowel negatieve als positieve selecties werken gelijktijdig in het Sniper Screening System.

Cas9-varianten met verminderde off-target activiteit die ook on-target activiteit behouden, kunnen in één keer worden gescreend. Mutaties werden geïntroduceerd op de hele Cas9 sequentie willekeurig om de bibliotheek te produceren om te worden gescreend. Dit maakte het mogelijk om mutaties in onverwachte posities te vinden.

Momenteel gebruiken veel onderzoekers in de academische wereld en de industrie Y-type Cas9 voor therapeutische ontwikkelingen. De specificiteit van Y-type Cas9 is echter niet geoptimaliseerd, wat kan resulteren in een strak verpakte af. Bij mensen betekent dit onverwachte mutaties in willekeurige genen, wat kan leiden tot ernstige bijwerkingen.

Er zijn veel Cas9 zoals enzymen die worden ontwikkeld in de therapieën. Onze techniek kan worden gebruikt om de specificiteit van andere DNA- en nucleids zoals Jipinger, Thailand en Cas9 te verbeteren, zoals CPF1. Het groot genoeg maken van een bibliotheek is de sleutel om de mogelijkheden te vergroten om een variant met belangrijke functie te krijgen.

Zorg ervoor dat u een hoog rendement in de koeling stap te krijgen, en gebruik zeer efficiënte bevoegde cellen. Om deze procedure te beginnen, voeg een nanogram van zowel de CCDB plasmid en de SGRNA plasmid met dubbele mismatches in vijftig microliters van ontdooide BW25141 GOI cellen. Meng de cellen voorzichtig door pipetting, en breng ze in een voorgekoelde, 0,1 centimeter elektroporatie cuvette.

Transformeer de E-coli met de twee plasmiden via elektroporatie. Voeg onmiddellijk na de elektroporatie 250 microliter van SOC-medium toe. Voorzichtig pipetten de oplossing om de cellen en het medium te mengen, en breng het mengsel naar een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.

Herstel de getransformeerde cellen en broed ze uit op 32 graden Celsius, met een uur zachtjes schudden. Doorgaan met het voorbereiden van de Snyper screening cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Wanneer u klaar bent om Snyper screening uit te voeren, transformeren de Snyper screening cellen met 100 nanogram van de voorbereide Cas9 variant plasmiden uit elke bibliotheek met behulp van de elctroporation proces dat eerder werd beschreven.

Breng vervolgens 250 microliter van de cellen over naar een verse microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg 250 picogrammen ATC toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 nanogram per milliliter. Herstel zowel de ATC-bevattende als de ATC-vrije cellen door ze een uur lang met zacht schudden uit te broeden op 32 graden Celsius.

Plaat 25 microliter van de teruggewonnen ATC-vrije cellen op een LB agarplaat, met chlooramfenicol en kanamycine. Voeg ATC toe aan de teruggewonnen ATC met cellen tot een uiteindelijke concentratie van 100 nanogram per milliliter op een 245 millimeter LB agarplaat. Onmiddellijk plaat de ATC-bevattende cellen op een LB agar met plaat met chloramphenicol, kanamycine, en arabinose.

Incubeer alle platen 's nachts bij 32 graden Celsius. De volgende dag, fotografeer de platen. Met behulp van de open CFU-software, tel het aantal levensvatbare kolonies, ervoor te zorgen dat het aantal kolonies op de niet-selectieve plaat is ten minste tien keer groter dan de diversiteit van de bibliotheek, om alle varianten te dekken.

Trek de kolonies die overleefden op de selectieve platen van alle drie de bibliotheken. Breng deze gepoolde kolonies over op 250 milliliter LB-medium, aangevuld met chlooramphenicol, en broeder 's nachts bij 42 graden Celsius. Laad eerst de Cas OF finder-software om doelsites te kiezen.

Selecteer het PAM-type dat geschikt is voor het specifieke type Cas9 en het doelgenoom. Vul het tabblad queryreeksen in. Kies het mismatchnummer en klik op verzenden.

Na een paar seconden verschijnen de on-target en off-target sites. In het algemeen, kies de off-target sites met een tot drie mismatches. Bestel vervolgens de CRRNA en de RRNA-oligo's Track met sjabloonreeksen en versterk de sjabloon zoals beschreven in het tekstprotocol.

Analyseer twee microliters van de versterkte sjabloon DNA, op een 2%agarose gel en zuiver vervolgens de sjabloon. Incubeer het reactiemengsel 's nachts bij 37 graden Celsius. De volgende dag, voeg 0,5 microliter DNAse en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten, en vervolgens zuiveren van de SGRNA.

Behandel vervolgens 10 microgram van het in-vitro getranscribeerde RNA met 250 eenheden kalverintestinale alkalische fosforfosfatase gedurende drie uur bij 3 graden Celsius, in aanwezigheid van 100 eenheden RNAse-remmer, en zuiver vervolgens de behandelde SGRNA. Ten eerste, handhaven HEK293 T-cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Meng vervolgens twee microgram van wild type of Snyper Cas9-eiwit met twee microgram SGRNA en broed tien minuten bij kamertemperatuur om RNP-complexen te maken.

Trypsinize en tel de cellen, dan wassen en bereiden ze in elektroporatie buffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Elektroporate de RNP complexen in de cellen met behulp van een puls van 1300 volt voor 30 milliseconden. Onmiddellijk na de elektroporatie, plaat de cellen op een 48-put plaat gevuld met 500 microliters van DMEM, aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica.

Incubeer bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. Houd HEK293 T-cellen in DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%antibiotica bij 37 graden Celsius met 5%kooldioxide. De dag voor transfectie, trypsinize en tellen van de cellen.

Als u werkt op een schaal van 48 goed, plaat 10.000 cellen per put en 250 microliter van volledig groeimedium. Bereid met behulp van een transfectionreageagens op basis van lipide 250 nanogram P3S Cas9 plasmid en 250 nanogram SGRNA voor transfectie. Meng vervolgens de plasmiden in 25 microliter van serumvrije MEM.

Verdun één microliter transfectiereagensage met 25 microliter serumvrije MEM. Broed dit mengsel vijf minuten op kamertemperatuur uit. Combineer het plasmide mengsel met het transfectiereagensmengsel en broed 20 minuten lang in de kamer om plasmide lipofectaminecomplexen te vormen.

Voeg hierna 50 microliter van dit mengsel direct toe aan elke put met cellen. Wieg de plaat voorzichtig heen en weer om te mengen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator gedurende 48 tot 72 uur na de transfectie, alvorens te testen op trans-gen expressie.

Na het isoleren van de eerder voorbereide genomic DNA, genereren diepe sequencing bibliotheken door PCR versterking van de GDNA met primers gericht op on-target en off-target. Gebruik vervolgens indexprimeren om elk monster te labelen. Gebruik een sequencingmachine van de volgende generatie om de poolbibliotheken aan gekoppelde eindsequencing te onderwerpen.

Nadat het Snyper-scherm is uitgevoerd, kan het percentage overlevingskolonies worden berekend door het aantal kolonies op de selectieve LB-plaat te delen door het aantal kolonies op de niet-selectieve LB-plaat. Hoewel dit percentage meestal erg laag is wanneer het wordt uitgevoerd met bibliotheken van SP Cas9, kunnen echte positieve hits worden verrijkt door het scherm te herhalen met de overlevende pool. Een representatief Snyper-scherm laat zien dat een overlevingskans van 100% wordt verkregen na het derde scherm.

Transfecties met behulp van RNPs of plasmid gecodeerde Snyper Cas9 kan worden gedaan voor verschillende doelen, en de resulterende on-target en off-target activiteiten gemeten door doelen amplicon sequencing. Bij de meeste doelen, Snyper Cas9 toont hetzelfde niveau van op doelactiviteiten en hogere specificiteit ratio's in vergelijking met het wilde type. Afgekapte SGRNAs's kunnen ook worden gebruikt om de specificiteit verder te verbeteren.

Hogere transformatie-efficiëntie in de eerste reinigingsstap is erg belangrijk om de klonen niet met een hoge specificiteit te verliezen. Latere screeningsstappen keren minder transformatie-efficiëntie terug omdat de klonen al zijn verrijkt in de eerste screeningstap, en er is minder kans om ze te verliezen. Er zullen meer dan één kloon zijn die we in het Snyper scherm vonden.

On-target en off-target activiteiten van deze klonen moeten worden gekarakteriseerd in zoveel mogelijk verschillende doelen om klonen te selecteren met de beste prestaties. Met deze methode kunnen wetenschappers de specificiteit van de Cas9-achtige enzymen verbeteren zonder verlies van on-target activiteit. Bovendien hebben wetenschappers geen voorkennis nodig over de structuur van het eiwit om verbeteringen aan te brengen.