Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek
1 april 2019
Wij presenteren een eenvoudige cytogenetische techniek met behulp van 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) om te bepalen van het tarief van de bevruchting en primaire sex-ratio van de haplodiploid invasieve plaag Bemisia tabaci.
Het protocol dat Liz ontwikkelde stelt ons in staat om de bevruchtingsgraad van wittevliegen te bepalen. Het toepassen van deze techniek zal ons begrip van het gedrag en de ecologie van wittevliegen verbeteren. Witte vliegen zijn haplodiploïde, dus de bevruchting is gelijk aan de geslachtsverhouding bij ovipositie.
Dit protocol is de eerste beschreven voor wittevliegen, voor zover wij weten, en kan worden voltooid binnen drie uur. Om te beginnen, maak een afdekbaar gat in de petrischaal deksel in te voegen en om de volwassen wittevliegen te verwijderen. Stel een vochtigheidskamer in en mode een sonde door het invoegen van een dunne pin onder een comfortabele werkhoek in een gesmolten pipet tip om een dunne sonde te maken.
Optioneel, langwerpige glazen pipet tips met warmte voor een gemakkelijkere behandeling van wittevlieg eieren. Laat vrouwelijke wittevliegen vervolgens oviposit op een schoon blad, gesneden om te passen op agar in een petrischaaltje. Tijdens de wittevlieg ovipositie, reinig een microscoop schuif met zeep en water.
Droog het goed en strek een stuk paraffine film over een uiteinde om vloeistoffen te vormen druppels en eieren gemakkelijker te zien. Om eieren te dechorioneren, gebruik een glas Pasteur pipet om druppels van 83% natrium hypochloriet bleekmiddel oplossing toe te voegen aan de paraffine film vlak voor volwassen verwijdering en ei-collectie. Bleekmiddel en glaciale azijnzuur zijn beide corrosief.
Ze moeten worden behandeld met handschoenen in een capuchon of goed geventileerde ruimte. DAPI is ook een irriterend en moet worden behandeld met handschoenen. Verwijder vervolgens de volwassen wittevliegen van het blad en leg het blad onder een microscoop.
Til elk ei voorzichtig van de basis tot de pedicel uit het blad wordt verwijderd. Oefen op veel eieren voordat u dit protocol uitvoert. Til de eieren langzaam van de basis en volledig til het uit het blad als je eenmaal zien dat het ei pedicel wordt verwijderd uit het blad.
Breng twee tot drie eieren aan elke druppel bleekmiddel en laat ze gedurende 10 minuten. Om de eieren te repareren, gebruik een glazen pipet om het bleekmiddel te verwijderen. Voeg vervolgens druppels glaciale azijnzuur toe en wacht drie minuten.
Verwijder vervolgens het glaciale azijnzuur en voeg druppels clarke's oplossing toe. Wacht vervolgens 10 minuten tot het grootste deel van de oplossing is verdampt. Voeg druppels van 70% ethanol toe en wacht 10 minuten opnieuw.
Om de eieren te bevlekken, verwijder eerst eventuele resterende ethanol. Voeg vervolgens druppels van 1xPBS toe aan de eieren om de pH bijna zeven te krijgen. Zet de microscoop dia in een vochtigheidskamer om uitdroging te voorkomen.
Verwijder na 30 minuten de 1xPBS en voeg druppels van 1 microgram per milliliter DAPI toe. Plaats de microscoop dia in een donkere vochtigheid kamer en wacht ten minste 15 minuten. Verwijder eerst de DAPI-oplossing om eieren te wassen.
Voeg vervolgens druppels van 1xTBST toe aan de eieren. Verwijder na vijf minuten de 1xTBST. Herhaal deze wasbeurt nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
Na de laatste wasbeurt, voorzichtig pipette alle eieren van de parafilm op een schoon deel van de microscoop schuif. Verwijder overtollige TBST en voeg 20 microliter van montagemedia toe. Tot slot, plaats een schone cover dia op de top van de eieren, verzegelen de cover dia met duidelijke nagellak voor langdurige opslag, en ga naar beeldvorming met behulp van een fluorescerende microscoop.
Eidechorionatie gevolgd door DAPI nucleaire kleuring toegestaan de toewijzing van bevruchting en embryo seks wanneer waargenomen met een fluorescerende microscoop. De vrouwelijke pronucleus is in de buurt van het centrum van zowel de bevruchte vrouwelijke eicel en onbevruchte mannelijke ei, en het sperma is zichtbaar als een heldere streep in de buurt van de top van het vrouwelijk ei alleen. Een toepassing van deze techniek is om te bepalen of bacteriële endosymbionts invloed hebben op de primaire geslachtsverhoudingen van wittevliegen.
Bijvoorbeeld, de primaire geslachtsverhoudingen van eieren gelegd door Rickettsia-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde B.tabici wittevliegen toonde geen significant verschil tussen de geslachtsverhouding in de twee behandelingen. Zoals voor eieren gefokt tot volwassenheid, soortgelijke resultaten werden gezien voor Rickettsia-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde volwassenen, het verstrekken van geen bewijs, althans in deze studie, voor een grotere bevruchting tarieven door Rickettsia geïnfecteerde vrouwtjes. Door dit protocol te gebruiken, kan men bepalen of interspecifiek sperma eieren kan bevruchten.
Als er geen bevruchting wordt waargenomen, kan men een back-up en kijk om te zien of sperma wordt overgedragen tijdens de paring door te kijken in de spermatheca van het vrouwtje. Als de bevruchting optreedt, zou men de geslachtsverhouding van volwassenen kunnen vergelijken met de bevruchtingsgraad om de levensvatbaarheid van hybride nakomelingenontwikkeling te bepalen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe cytogenetische techniek met behulp van DAPI om de fertilisatiesnelheid en de primaire geslachtsverhouding van de haplodiploïde invasieve plaag Bemisia tabaci te beoordelen. Het protocol is ontworpen om het begrip van het gedrag en de ecologie van de witte vlieg te verbeteren.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschapsgebied
- Cytogenetica
- Ecologie
- Entomologie
Achtergrond
- Wittevliegen zijn haplodiploïde insecten.
- De fertilisatiesnelheid correleert met de geslachtsverhouding bij de ei stadium (ovipositie).
- Deze techniek is de eerste van zijn soort die voor wittevliegen is beschreven.
- Inzicht in fertilisatiesnelheden kan bijdragen aan strategieën voor plaagbestrijding.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het bepalen van de fertilisatiegraad van witte vlieg.
- Om de kennis over de ecologie en het gedrag van de witte vlieg te verbeteren.
- Om een snel en efficiënt protocol voor onderzoekers te bieden.
Gebruikte methoden
- Creëren van een afdekkabel gat in een Petrischaal voor de hantering van witte vliegen.
- Inrichten van een bevochtigingskamer voor optimale omstandigheden.
- Fabricage van een dunne probe voor precieze manipulatie.
- Toepassing van DAPI-kleuring om bevruchtingspercentages te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol kan binnen drie uur worden voltooid.
- Het maakt een nauwkeurige bepaling van de fertilisatiesnelheden mogelijk.
- Resultaten kunnen het begrip van de populatiedynamiek van de wittevlieg verbeteren.
- Biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar ongediertebestrijding.
Conclusies
- Deze techniek is een significante vooruitgang in het onderzoek naar witte vlieg.
- Het biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van reproductieve parameters.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om ecologische effecten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Kwantitatieve bepaling van de bevruchtingspercentages van eieren bij Bemisia tabaci met behulp van cytogenetische DAPI-kleuring maakt directe meting van primaire geslachtsverhoudingen mogelijk, een kritische parameter voor het modelleren van de populatiedynamiek van plagen. Deze mogelijkheid ondersteunt het voorspellend vertrouwen bij vroege ontdekking en targetvalidatie voor interventies die de reproductieve biologie beïnvloeden. De methode biedt een gestandaardiseerde workflow voor het beoordelen van de impact van genetische of omgevingsfactoren op de geslachtsallocatie, wat risicogebaseerde beslissingen in biotechnologische pijplijnen voor de landbouw informeert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe analyse van reproductiemechanismen en routes voor geslachtsallocatie bij haplodiploïde plagen mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de invloed van endosymbionten of genetische factoren op fertilisatie-uitkomsten te verduidelijken.
- Faciliteert voorspellende modellering van de populatiestructuur voor doelvalidatie in strategieën voor plaagbestrijding.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare cytogenetische assay voor het kwantificeren van fertilisatiepercentages en primaire geslachtsverhoudingen.
- Standaardiseert de monstervoorbereiding en beeldvorming voor daaropvolgende vergelijkende studies.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van experimentele variabelen die het reproductieve succes beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt laboratoriumbevindingen met veldrelevante populatiedynamiek door bevruchtingspercentages te koppelen aan de geslachtsverhoudingen van volwassenen.
- Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekkingen naar translationele studies over interventies voor plaagbestrijding.
- Vermindert de risico's bij de verdere ontwikkeling van biocontrol- of genetische modificatiestrategieën door kwantitatieve reproductieve eindpunten te verschaffen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze cytogenetische techniek is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek voor agrarische biotechnologie en ondersteunt het toetsen van hypothesen en het mechanistisch verminderen van risico's voor reproductieve targets.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert bevruchting en geslachtsallocatie om reproductieve routes te verduidelijken en om milieu- of genetische hypothesen te testen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten voor comparatieve analyse van experimentele behandelingen.
- Analytica: Biedt metingen op basis van kernkleuring ter ondersteuning van de statistische vergelijking van bevruchtingspercentages en geslachtsverhoudingen.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen laboratoriumassays en uitkomsten op populatieniveau die relevant zijn voor ongediertebestrijding.
- Bedrijfmatige hergebruikbaarheid: Biedt een herbruikbaar protocol dat aanpasbaar is voor studies naar andere haplodiploïde soorten of plaagssoorten.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de reproductieve biologie en doelvalidatie voor plaagbestrijding.
- Operationele waarde: Levert een snelle, gestandaardiseerde en reproduceerbare workflow voor cytogenetische analyse.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen voor interventies die gericht zijn op reproductieve mechanismen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van biologische bestrijdings- en genetische strategieën mogelijk op basis van kwantitatieve reproductieve eindpunten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de cytogenetica, fluorescentiemicroscopie en monsterverwerking.
- Toegang tot DAPI-kleuringsreagentia, fluorescentie-beeldvormingsinfrastructuur en faciliteiten voor de veilige omgang met chemicaliën is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Aanpasbaar aan andere haplodiploïde soorten of plaagssoorten door optimalisatie van het protocol.
- Beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige monsterpreparatie en mogelijke variabiliteit bij de verwerking van eitjes.
