Name: Cortisol meting in Koala (Phascolarctos cinereus) bont (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Leer cortisolmeting in koalabont voor chronische stressbeoordeling met Phascolarctos cinereus. Deze methode biedt een gevoelige, reproduceerbare techniek voor klinisch beheer en behoud.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de start-up onderzoeksfinanciering voor Edward Narayan via de Western Sydney University, school of Science and Health. De auteurs bedanken Jack Nakhoul voor hulp bij het verwerken van monsters.

Dit project werd uitgevoerd onder strikte richtlijnen voor dier-en menselijke zorg. De ethiek van dieren werd verleend door de Western Sydney University (A12373). Daarnaast werden een laboratorium risicobeoordeling en bioveiligheid en stralings vorm ingediend en aanvaard door de Western Sydney University om dit onderzoek veilig uit te voeren (B12366).
Opmerking: Koala fur monsters voor dit project zijn verkregen uit het Adelaide Koala and Wildlife Hospital, gelegen aan de 282 Anzac Highway, Plympton South Australia. Bont werd genomen van een Koala die in het ziekenhuis was toegelaten en werd geëuriseerd als gevolg van hun ernstige verwondingen. De overleden Koala was kort na de dood opgeslagen in een diepvrieskast in een body Bag. Na het verwijderen van de overleden Koala uit de Body tas, werd 1,2 g bont geschoren uit de nek van de hals met behulp van standaard dieren tondeuses. De vacht was zo dicht mogelijk bij de huid geschoren, om ervoor te zorgen dat de huid niet werd gesneden. Eenmaal geschoren, werd de overleden Koala terug in de Body Tas gezet en in de vriezer geplaatst. De vacht werd vervolgens geplaatst in een zakje gemaakt van aluminiumfolie en bewaard onder-20 °C. Tijdens het transport werd de vacht op omgevingstemperatuur gehouden en bij aankomst in het laboratorium werd de vacht bewaard bij-80 °C.
1. koala bont cortisol extractie
<ol><li>Verwijder de vacht van de opslag bij-80 °C en laat de tijd ontdooien.</li>
	<li>Weeg de vacht af op een laboratoriumanalyse precisie balans.</li>
	<li>Plaats 60 mg van de vacht in een voorgewogen en gelabelde centrifugebuis van 1,5 mL en herhaal dit tot 18 tubes zijn gevuld. Opmerking: voor dit valideringsonderzoek zijn 18 bont submonsters gebruikt.</li>
	<li>Voeg met behulp van een pipet 1 mL 100% High-Performance vloeistofchromatografie (HPLC)-kwaliteit isopropanol toe aan elke buis.</li>
	<li>Vortex samples voor 30 s.</li>
	<li>Rek elk monster met een micro precisie zeef van 0,5 mm om de scheiding van vloeistof en bont te bereiken.</li>
	<li>Gooi de vloeistof weg in een afvalbak.</li>
	<li>Plaats elk bont monster in een gelabelde plastic weeg boot en plaats het in een vacuümexsiccator, laat de vacht 3 dagen drogen.</li>
	<li>Eenmaal volledig droog, plaats elk monster in een gelabelde 1,5 mL micro centrifugebuis.</li>
	<li>Plaats elk monster in een kraal molen met 3 chroomstalen kralen (3,2 mm) en pulverize voor 2 min bij 30 shakes per seconde.</li>
	<li>Pipetteer 1,5 mL van de eerste extractietechniek (100% analytische kwaliteit ethanol) in 6 1,5 mL microcentrifugebuisjes die het bont monster bevatten.</li>
	<li>Voer hetzelfde uit voor 100% analytische kwaliteit methanol en 100% analytische kwaliteit isopropanol tot achttien 1,5 mL micro centrifugebuizen zijn gevuld.</li>
	<li>Dop elke micro centrifugebuis van 1,5 mL en incuberen bij kamertemperatuur (RT) met constante pulserende met een shaker voor 3 uur.</li>
	<li>Verwijder en stam monsters met een 0,5 mm micro-precisie zeef.</li>
	<li>Breng de vloeistof over in een nieuwe, gelabelde micro centrifugebuis van 1,5 mL met een pipet en zorg ervoor dat de vacht op de juiste manier wordt weggegooid.</li>
	<li>Volledig droog oplosmiddel extract onder een stroom van N2 damp onder een rookkast.</li>
	<li>Reconstitueer het gedroogde monsterextract met 400 μL test buffer (samenstelling in de commerciële cortisol Kit; Zie tabel met materialen) en 100 μL van 100% analytische kwaliteit ethanol. Opmerking: monsterextracten kunnen worden opgeslagen bij-80.</li>
</ol>2. interne controles
<ol><li>Om controles te maken, maken een pool van geëxtraheerde monsters met hoge hormoonspiegels. Selecteer monsters van dieren met bekende blootstelling aan stressor om deze groep te maken. Bijvoorbeeld, selecteer monsters van koala's die zijn gered van milieu trauma omdat ze over het algemeen hoge cortisol hormoonniveaus6zullen vertonen.<ol>
<li>Om de extract pool te maken, neemt u 20 μL extract van elk monster (n = 10) tot een totaal volume van 200 μL wordt verkregen. De extractie pool kan worden opgeslagen bij-80 C tot en met assays. Voer de pool in elke assay uit als lage of hoge interne controles (zie stap 2,2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gebruik voor de test de pool om voorraden te maken voor lage en hoge controles die binden op respectievelijk 70% (C1) en 30% (C2). Verkrijgen van de verdunningsfactor voor de 30% en 70% bindende punten van de parallellisme grafiek voor het extract tegen de cortisol norm (Figuur 1). Gebruik de test buffer voor verdunning van de monster pool. Gebruik bijvoorbeeld 60 μL van het pool extract en 60 μL test buffer voor 1:2 verdunning. Opmerking: voor het methanol-extract was het bindende punt van 30% netjes, terwijl 70% bindend punt ongeveer 1:2 was, zoals per Figuur 1. Deze waren dus voorzien van de verdunningsfactor voor de interne controles (respectievelijk C1 en C2) voor de uitvoering binnen de test.</li>
</ol>3. cortisol-analyse in Koala bont extracten
<ol><li>Gebruik een commerciële cortisol Kit (tabel van de materialen) en zet de 96 goed STRIPPLAAT met inbegrip van de monsters, controles, cortisol normen, niet-specifieke bindende putten, en maximale binding putten volgens de instructies van de leverancier. Gebruik het Plate layout sheet in het Kit boekje om de posities van samples, Controls en Standards op de plaat kaart te vermelden. Opmerking: het wordt aanbevolen dat alle voorbeelden, besturingselementen en standaarden in tweevoud worden uitgevoerd om nauwkeurigheid van resultaten mogelijk te maken.</li>
	<li>Monsters voorbereiden. Volg de pels hormoon-extractie (sectie 1) om 100% methanol geëxtraheerd Koala vacht te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid de reagentia voor. Volg de procedure beschreven in de commerciële cortisol Kit om de reagentia voor te bereiden, inclusief (1) test buffer, (2) wasbuffer, en (3) normen (composities in de cortisol Kit, tabel met materialen).</li>
	<li>Volgens de instructies in de cortisol Kit, pipet 50 μL monsters of normen in putjes in de plaat. Pipet 75 μL en 50 μL van de test buffer in de niet-specifieke binding (NSB) putten en de maximale binding (B0 of Zero Standard) Wells, respectievelijk.</li>
	<li>Voeg 25 μL van het cortisol conjugaat toe aan elk goed met behulp van een repeater pipet. Pipet dan 25 μL van het cortisol-antilichaam in elk putje, behalve de NSB-putten. Tik zachtjes op de zijkanten van de plaat om er zeker van te zijn dat de reagentia goed gemengd zijn.</li>
	<li>Bedek de plaat met de plaat sealer en schud bij kamertemperatuur gedurende 1 uur (bij trage snelheid) met behulp van een rondschudapparaat.</li>
	<li>Verwijder de plaat sealer en zuig de goed plaat door elke put met 300 μL wasbuffer 4 keer te wassen.</li>
	<li>Droog de plaat door op de plaat te tikken op schone, absorberende handdoeken.</li>
	<li>Pipetteer 100 μL tetramethylbenzadine (TMB) substraat (samenstelling in de cortisol Kit, tabel van de materialen) aan elke put.</li>
	<li>Plaats de plaat sealer op de put en inincuberen bij RT gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Pipetteer 50 μL stop oplossing voor elke put.</li>
	<li>Plaats de goed plaat in een plaat lezer die in staat is om 450 nm te lezen.</li>
	<li>Voor het berekenen van de uiteindelijke hormoon concentratie, afleiden van de uiteindelijke vacht cortisol concentratie in ng/mg van het monster door vermenigvuldiging van de PG/mL hormoon concentratie met het uiteindelijke extract volume (0,5 mL) en delen door de massa van de vacht monster (60 mg).</li>
</ol>

<ol><li>Sandhu, H. S., Crossman, N. D., Smith, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecosystem+services+and+Australian+agricultural+enterprises%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Economics%22%5BJournal%5D)">Ecosystem services and Australian agricultural enterprises.</a> Ecological Economics. 74, 19-26 (2012).</li>
<li>Martinez-Ramos, M., Ortiz-Rodriguez, I. A., Pinero, D., Dirzo, R., Sarukhan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthropogenic+disturbances+jeopardize+biodiversity+conservation+within+tropical+rainforest+reserves%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Anthropogenic disturbances jeopardize biodiversity conservation within tropical rainforest reserves.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5323-5328 (2016).</li>
<li>Aukema, J. E., Pricope, N. G., Husak, G. J., Lopez-Carr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiversity+Areas+under+Threat%3A+Overlap+of+Climate+Change+and+Population+Pressures+on+the+World%27s+Biodiversity+Priorities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Biodiversity Areas under Threat: Overlap of Climate Change and Population Pressures on the World's Biodiversity Priorities.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170615(2017).</li>
<li>MacDougall, A. S., McCann, K. S., Gellner, G., Turkington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+loss+with+persistent+human+disturbance+increases+vulnerability+to+ecosystem+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Diversity loss with persistent human disturbance increases vulnerability to ecosystem collapse.</a> Nature. 494 (7435), 86-89 (2013).</li>
<li>Hrdina, F., Gordon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Koala+and+Possum+Trade+in+Queensland%2C+1906-1936%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Zoologist%22%5BJournal%5D)">The Koala and Possum Trade in Queensland, 1906-1936.</a> Australian Zoologist. 32 (4), 543-585 (2004).</li>
<li>Narayan, E. J., Williams, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+dynamics+of+physiological+impacts+of+environmental+stressors+on+Australian+marsupials%2C+focus+on+the+koala+%28Phascolarctos+cinereus%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Zoology%22%5BJournal%5D)">Understanding the dynamics of physiological impacts of environmental stressors on Australian marsupials, focus on the koala (Phascolarctos cinereus).</a> BMC Zoology. 1 (1), (2016).</li>
<li>Woinarski, J., Burbidge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phascolarctos+cinereus%5BTitle%5D)+AND+%22The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species+2016%22%5BJournal%5D)">Phascolarctos cinereus.</a> The IUCN Red List of Threatened Species 2016. , (2016).</li>
<li>Gonzalez-Astudillo, V., Allavena, R., McKinnon, A., Larkin, R., Henning, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+causes+of+Koalas+in+South+East+Queensland%2C+Australia%3A+a+17-year+retrospective+study+of+mortality+and+morbidity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Decline causes of Koalas in South East Queensland, Australia: a 17-year retrospective study of mortality and morbidity.</a> Scientific Reports. 7, 42587(2017).</li>
<li>Hing, S., Narayan, E. J., Thompson, R. C. A., Godfrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+physiological+stress+and+wildlife+disease%3A+consequences+for+health+and+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Wildlife+Research%22%5BJournal%5D)">The relationship between physiological stress and wildlife disease: consequences for health and conservation.</a> Wildlife Research. 43 (1), 51-60 (2016).</li>
<li>Whirledge, S., Cidlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids%2C+stree%2C+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Endocrinologica%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids, stree, and fertility.</a> Minerva Endocrinologica. 35 (2), 109(2010).</li>
<li>Romero, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+stress+in+ecology%3A+lessons+from+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Physiological stress in ecology: lessons from biomedical research.</a> Trends in Ecology & Evolution. 19 (5), 249-255 (2004).</li>
<li>McEwen, B. S., Wingfield, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+in+a+name%3F+Integrating+homeostasis%2C+allostasis+and+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">What is in a name? Integrating homeostasis, allostasis and stress.</a> Hormones and Behavior. 57 (2), 105-111 (2010).</li>
<li>Wingfield, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparative+biology+of+environmental+stress%3A+behavioural+endocrinology+and+in+ability+to+cope+with+novel%2C+changing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">The comparative biology of environmental stress: behavioural endocrinology and in ability to cope with novel, changing environments.</a> Animal Behaviour. 85 (5), 1127-1133 (2013).</li>
<li>Chrousos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+disorders+of+the+stress+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Stress and disorders of the stress system.</a> Nature Reviews Endocrinology. 5 (1), 374-381 (2009).</li>
<li>Narayan, E. J., Webster, K., Nicolson, V., Mucci, A., Hero, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+evaluation+of+physiological+stress+in+an+iconic+Australian+marsupial%3A+the+Koala+%28Phascolarctos+cinereus%29%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive evaluation of physiological stress in an iconic Australian marsupial: the Koala (Phascolarctos cinereus).</a> General and Comparative Endocrinology. 187, 39-47 (2013).</li>
<li>Mastromonaco, G. F., Gunn, K., McCurdy-Adams, H., Edwards, D. B., Schulte-Hostedde, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+use+of+hair+cortisol+as+a+measure+of+chronic+stress+in+eastern+chipmunks+%28Tamias+striatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Validation and use of hair cortisol as a measure of chronic stress in eastern chipmunks (Tamias striatus).</a> Conservation Physiology. 2 (1), 055(2014).</li>
<li>Ashley, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticosteroid+concentrations+in+feces+and+hair+of+captive+caribou+and+reindeer+following+adrenocorticotropic+hormone+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucocorticosteroid concentrations in feces and hair of captive caribou and reindeer following adrenocorticotropic hormone challenge.</a> General and Comparative Endocrinology. 172 (3), 382-391 (2011).</li>
<li>Macbeth, B. J., Cattet, M. R. L., Stenhouse, G. B., Gibeau, M. L., Janz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cortisol+concentration+as+a+noninvasive+measure+of+long-term+stress+in+free-ranging+grizzly+bears+%28Ursus+arctos%29%3A+considerations+with+implications+for+other+wildlife%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">Hair cortisol concentration as a noninvasive measure of long-term stress in free-ranging grizzly bears (Ursus arctos): considerations with implications for other wildlife.</a> Canadian Journal of Zoology. 88 (10), 935-949 (2010).</li>
<li>Dettmer, A. M., Novak, M. A., Suomi, S. J., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+behavioral+adaptation+to+relocation+stress+in+differentially+reared+rhesus+monkeys%3A+hair+cortisol+as+a+biomarker+for+anxiety-related+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Physiological and behavioral adaptation to relocation stress in differentially reared rhesus monkeys: hair cortisol as a biomarker for anxiety-related responses.</a> Psychoneuroendocrinology. 37 (2), 191-199 (2012).</li>
<li>Di Francesco, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qiviut+cortisol+in+muskoxen+as+a+potential+tool+for+informing+conservation+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Qiviut cortisol in muskoxen as a potential tool for informing conservation strategies.</a> Conservation Physiology. 5 (1), 052(2017).</li>
<li>Cattet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+long-term+stress+in+brown+bears+with+the+hair+cortisol+concentration%3A+a+biomarker+that+may+be+confounded+by+rapid+changes+in+response+to+capture+and+handling%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Physiology%22%5BJournal%5D)">Quantifying long-term stress in brown bears with the hair cortisol concentration: a biomarker that may be confounded by rapid changes in response to capture and handling.</a> Conservation Physiology. 2 (1), 026(2014).</li>
<li>Meyer, J., Novak, M., Hamel, A., Rosenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+analysis+of+cortisol+from+human+and+monkey+hair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Extraction and analysis of cortisol from human and monkey hair.</a> Journal of Visualized Experiments. (83), e50882(2014).</li>
<li>Carlitz, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Hair+Cortisol+Concentrations+to+Assess+the+Effect+of+Anthropogenic+Impacts+on+Wild+Chimpanzees+%28Pan+troglodytes%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Measuring Hair Cortisol Concentrations to Assess the Effect of Anthropogenic Impacts on Wild Chimpanzees (Pan troglodytes).</a> PLoS ONE. 11 (4), 0151870(2016).</li>
<li>Aderjan, R., Rauh, W., Vecsei, P., Lorenz, U., Ruttgers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cortisol%2C+tetrahydrocortisol%2C+tetrahydrocortisone%2C+corticosterone%2C+and+aldosterone+in+human+amniotic+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of cortisol, tetrahydrocortisol, tetrahydrocortisone, corticosterone, and aldosterone in human amniotic fluid.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 8 (1), 525-528 (1977).</li>
<li>Nejad, J. G., Ghaseminezhad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cortisol+Study%3B+Facial+Hair+and+Nails%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroids+%26+Hormonal+Science%22%5BJournal%5D)">A Cortisol Study; Facial Hair and Nails.</a> Journal of Steroids & Hormonal Science. 7 (2), 177(2016).</li>
<li>Palme, R., Touma, C., Arias, N., Dominchin, M., Lepschy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+extraction%3A+get+the+best+out+of+faecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Medicine+Australia%22%5BJournal%5D)">Steroid extraction: get the best out of faecal samples.</a> Veterinary Medicine Australia. 7 (2), 1-5 (2013).</li>
<li>Davenport, M. D., Tiefenbacher, S., Lutz, C. K., Novak, M. A., Meyer, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endogenous+cortisol+concentrations+in+the+hair+of+rhesus+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhesus macaques.</a> General and Comparative Endocrinology. 147 (3), 255-261 (2006).</li>
<li>Kanse, K. S., Joshi, Y. S., Kumbharkhane, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+study+of+ethanol+in+non-polar+solute+using+hydrogen-bonded+model%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+and+Chemistry+of+Liquids%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction study of ethanol in non-polar solute using hydrogen-bonded model.</a> Physics and Chemistry of Liquids. 52 (6), 710-716 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn een aantal studies die gebruik maken van een scala van technieken voor het opsporen van cortisol in zoogdier vacht. Deze studie presenteert resultaten voor de opsporing van cortisol in bont verzameld van een wilde Koala blootgesteld aan huidige antropogene stress. Deze baanbrekende studie gebruikt bont om te testen welke van de drie veelgebruikte oplosmiddelen het beste zijn bij het uitpakken van cortisol, een maat voor chronische stress, van Koala vacht. De resultaten toonden aan dat 100% methanol het aanbevolen...

Australische ecosystemen ondersteunen het menselijk leven door het leveren van diensten, waaronder voedsel en vezels onder vele andere dynamische interacties1. Ironisch genoeg is het menselijke activiteit die opereert als de dominante drijfkracht van ecosysteem verstoring door biodiversiteits verandering2. Habitat fragmentatie, bekend als het proces van het verdelen van grote continue habitats in kleine stukjes land, geïsoleerd van elkaar, is de belangrijkste antropogene biodiversiteits verandering die de Australische ecosystemen2bedreigt. Habitat fragmentatie wijzigt de structuur en diversiteit van de soortensamenstelling in een bepaald gebied, waardoor het gebied van habitat dat voor deze soorten nodig is, wordt verminderd om levensvatbare populaties2te behouden. Het resultaat hiervan is een toegenomen concurrentie tussen soorten voor hulpbronnen, waaronder voedsel, brandstof, vezels en water3. De vernietiging van de Australische ecosystemen door het veranderen van biodiversiteit heeft catastrofale gevolgen voor veel Australische inheemse soorten1.
De meest iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), is afhankelijk van de Australische ecosystemen die gezond blijven voor hun overleving4. De invoering van de Europese nederzetting veroorzaakte een snelle afname van de Australische populaties koala's, omdat ze werden geslacht voor hun pelten in de winstbejag in een grote export handel5. Deze praktijk werd verboden in de jaren 1980 en populaties van koala's waren dan in staat om te stabiliseren5. Echter, exponentiële groei van de menselijke bevolking heeft geresulteerd in deze soort concurreren voor een groot deel van hun habitat, en hun overleving is weer onder bedreiging6. Volgens de Internationale Unie voor het behoud van de natuur (IUCN) worden alle populaties van Australische koala's als kwetsbaar voor uitsterven vermeld met een dalende bevolkings trend7. Deze vermelding wordt toegeschreven aan de onzekerheid rond relevante bevolkings parameters en een duidelijke variatie in bevolkings trends voor deze soort7. Als de meest iconische en endemische dieren, koala's profiteren grotendeels de Australische economie door middel van toerisme (NSW kantoor van milieu en erfgoed 2018). Een schatting suggereert dat Koala gerelateerd toerisme ongeveer 9.000 banen heeft opgeleverd en bijdraagt tussen $1,1 en $2.500.000.000 aan de economie (NSW Office of Environment en Heritage 2018). Het verwijderen van één soort heeft het potentieel catastrofaal te zijn, en is te zien in de gestage achteruitgang van inheemse Australische fauna6. Bovendien, de Australië economie zal de consequenties voelen als de populaties van de Australische koala's blijven dalen tegen het tarief dat ze zijn6.
Er wordt gesuggereerd dat de prevalentie van dood en ziekte in reactie op habitatfragmentatie het resultaat is van chronische stress8. Al vierentwintig buideldier soorten zijn verklaard uitgestorven in Australië als gevolg van habitatfragmentatie, met koala's volgens een soortgelijke trend8. De complexiteit van habitatfragmentatie en biologische systemen is synergetisch, maar kan worden uitgepakt door analyse van de stressrespons6. Over het algemeen activeert elke verstoring in een natuurlijke omgeving van dieren een complexe cascade van neurohormonale gebeurtenissen, bekend als een ' gevecht of vlucht ' reactie9,10. Deze reactie op stress is een proces dat begint in de hersenen waar de hypothalamische-hypofyse-adrenale (HPA) as is geactiveerd11. Een onderdeel van de hersenen genaamd de hypothalamus releases corticotrophin-releasing hormoon (CRH), die vervolgens signalen van de anterieure hypofyse om adrenocorticotrofische hormoon (ACTH)11vrijgeven. Dit stimuleert op zijn beurt de Glucocorticoïde secretie van de bijnier Medulla. Het lichaam circuleert glucocorticoïden door het bloed, die de opslag van glucose uit glycogeen afleidt en glucose van opgeslagen glycogeen11mobiliseert. Deze cascade van neurohormonale gebeurtenissen is de reactie die door het dier wordt gebruikt om te gaan met onvoorspelbare stimuli11. Echter, wanneer glucocorticoïden vrijkomen en gedurende langere tijd verhoogd blijven, wordt het dier geacht chronische stress12,13te ervaren. Dit proces omvat het afleiden van energie uit de buurt van andere corporale lichaamsfuncties, omdat het nodig is voor lopende Glucocorticoïde productie13. Als gevolg daarvan, chronische stress kan het verbieden van groei, reproductie en immuniteit, alle belangrijke fitness eigenschappen die nodig zijn voor overleving14.
Het meten van de Glucocorticoïde productie van een dier is een veelgebruikte indicator die wordt gebruikt om te bepalen of het dier fysiologische stress ondervindt15. Om dit te doen, glucocorticoïden kunnen worden gemeten in bloed plasma, serum, speeksel, urine of feces16. Echter, bewijs suggereert dat haar een veel effectievere indicator van chronische stress, in tegenstelling tot de bovengenoemde16. Dit komt omdat haar wordt verondersteld te nemen bloed-overgedragen hormonen tijdens de groeifase; het is relatief stabiel; en elke cortisol gedetecteerd in haar weerspiegelt fysiologische stress ervaren over de periode van haargroei, die kan worden weken tot en met maanden16. Bovendien moet elke verzameling van cortisol niet-invasief zijn om de stress die gepaard gaat met het opvangen en hanteren van16te minimaliseren. Echter, elke stress ervaren tijdens dit evenement zou geen invloed hebben op Glucocorticoïde spiegels in haar16. Er zijn veel studies geweest die de vaardigheid van het gebruik van haren onderzoeken om lange termijn stress in een aantal dieren te meten, en omvatten studies over rendieren, grizzly beren, rhesus-apen, muskoxen en bruine beren17,18, 19 , 20 , 21. haar cortisol wordt meestal geëxtraheerd door het eerste wassen van het monster om ervoor te zorgen zweet en sebum-afgeleide cortisol afgezet op het oppervlak van het haar is niet co-geëxtraheerd met cortisol en vervolgens verpulveren het monster in een kraal-klopper22. Na het wassen moet het monster worden gedroogd om volledige verdamping te garanderen22. Tot slot, met behulp van een oplosmiddel, kan het monster worden geëxtraheerd en gereconstitueerd om de assay van cortisol22te vergemakkelijken. Het meest voorkomende oplosmiddel dat wordt gebruikt om cortisol uit de vacht te halen, is methanol21,23; echter, er zijn enkele studies die gebruik maken van ethanol en isopropanol in hun cortisol extractietechnieken. Bijvoorbeeld, een studie die ethanol gebruikte was succesvol voor het extraheren van cortisol uit humaan vrucht vocht24. Bovendien was een studie waarin isopropanol werd gebruikt succesvol voor het extraheren van cortisol uit menselijk haar en nagels25,26. Om deze reden testte deze studie alle drie de oplosmiddelen (methanol, ethanol en isopropanol) om te bepalen welke het meest succesvol was voor extractie van cortisol uit monsters van Koala vacht.
Het primaire doel van deze studie was het gebruik van de huidige technieken om te valideren van een optimale hormoon extractietechniek te worden gebruikt als een niet-invasieve maatregel van cortisol van Koala vacht. Dit werd bereikt door het testen van drie extractiemiddelen (methanol, ethanol en isopropanol). We veronderstelde dat methanol zal het optimale oplosmiddel gebruikt voor het uitpakken van cortisol van Koala vacht omdat het de aanbevolen oplosmiddel van extractie door Arbor assay cortisol kits27.

<table><tbody><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Chroomstalen kralen</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>3,2 mm x 3</td></tr><tr><td>Cortisol Kit</td><td>Arbor Assays</td><td>K003-H1W</td><td>Gemaakt in Michigan USA</td></tr><tr><td>DetectX Cortisol Enzyme Immunoassay Kit</td><td>Arbor Assays</td><td>K003-H5</td><td>Voor het eerst gebruikt voor cortisoltesten in koalabont</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>HPLC-kwaliteit</td></tr><tr><td>Micropipet</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Microprecisiezeven</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>0,5 mm</td></tr><tr><td>Microplaatlezer</td><td>Bio Radi</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Microplaatwasser</td><td>Bio Radi</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Orbitaal shaker</td><td>Bio Line</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Plastiek weegbootje</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Plaatverzegelder</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Precisiebalans</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr><tr><td>Vortexmixer</td><td>Eppendorf</td><td>n/a</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

cortisol meting in koala (phascolarctos cinereus) bont

Cortisol Measurement in Koala (Phascolarctos cinereus) Fur

Optimale methoden van hormoon extractie gebruikt voor het meten van stress bij dieren over de monster soorten zijn niet altijd hetzelfde. De iconische marsupiale soort van Australië, de Koala (Phascolarctos cinereus), wordt geconfronteerd met langdurige blootstelling aan antropogene-geïnduceerde stressoren en de beoordeling van chronische stress in wilde populaties is dringend gerechtvaardigd. Een van de meest effectieve manieren om chronische stress te meten is door het analyseren van het Glucocorticoïde hormoon cortisol in haar of vacht, omdat het fysiologische en gedragsmatige reacties ondersteunt. Dit laboratorium validatie studie is bedoeld om te testen van de huidige technieken voor het valideren van een optimale hormoon extractiemethode te gebruiken als een niet-invasieve maatregel van cortisol in Koala vacht. Het is bekend dat het gebruik van niet-invasieve technieken voor het meten van stresshormonen de voorkeur heeft boven traditionele, invasieve technieken vanwege hun ideale praktische en ethische standpunten. Bovendien is het relatief gemakkelijker om bont van koala's te verwerven dan om monsters van hun bloed te verwerven. Deze studie gebruikte monsters van Koala bont verworven van de Adelaide Koala en Wildlife Hospital om een aantal hormoon extractietechnieken uit te voeren in een poging om een optimale cortisol extractiemethode te valideren. De resultaten toonden aan dat 100% methanol de meest optimale oplosmiddelextractie leverde ten opzichte van 100% ethanol of 100% isopropanol op basis van parallellisme resultaten. Concluderend, deze methode van cortisol extractie van Koala bont verstrekt een betrouwbare niet-invasieve assay die kan worden gebruikt voor het bestuderen van chronische stress in koala's.

Assay detectie van hormoon metabolieten van belang wordt bepaald met behulp van parallellisme. Met behulp van een parallellisme curve bepaalt het binding punt 50% ook de monster verdunningsfactor op de standaard curve (Figuur 1). Zoals weergegeven in de parallellisme grafiek (Figuur 1), hebben de 100% ethanol en 100% Isopropanolextracten geen parallelle verplaatsing tegen de cortisol norm opgeleverd. Echter, de 100% methanol extract voorzag parallel verplaatsing tegen de cortisol-standaa...

We presenteren een protocol om te bepalen van de optimale extractie oplosmiddel voor het meten van cortisol van Koala vacht. De in dit Protocol gebruikte oplosmiddelen zijn methanol, ethanol en isopropanol. Het bepalen van een optimaal extractieoplosmiddel zal helpen bij het betrouwbaar meten van de vacht om de impact van chronische stress op koala's te bepalen.

Cortisol meting in Koala (Phascolarctos cinereus) bont

Optimal methods of hormone extraction used to measure stress in animals across sample types are not always the same. Australia&#39;s iconic marsupial ...

Dit is een nieuwe methode voor de beoordeling van het glucocorticoïde hormoon, cortisol, van koalabont. Het biedt een nieuwe biomarker voor de beoordeling van chronische stress in koala's. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een zeer gevoelige en reproduceerbare methode met een vrij snelle doorlooptijd tussen monster voorbereiding en hormoontest.Deze techniek maakt het mogelijk om chronische stress in koala's kwantitatief te beoordelen, wat een zeer nuttig klinisch managementinstrument is. Ik help me met deze procedure is Dylan Fox, een student uit mijn laboratorium. Om te beginnen met deze procedure halen de vacht uit de opslag op min 80 graden Celsius en laat het ontdooien bij kamertemperatuur.Weeg vervolgens de vacht op een laboratorium analytische precisie balans. Plaats 60 milligram van de vacht in een voorgewogen en gelabeld 1,5 milliliter centrifuge buis en herhaal dit tot 18 buizen zijn gevuld. Voeg met behulp van een pipet een milliliter van 100% HPLC-kwaliteit isopropanol toe aan elke buis.Vortex de monsters voor 30 seconden. Zeef elk monster met een microprecisiezeef van 0,5 milliliter om vloeistof en bont te scheiden en gooi de vloeistof in een afval

cortisol-measurement-in-koala-phascolarctos-cinereus-fur

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Cortisol (CORT) hoopt zich op in de groeiende haarschacht van mensen en niet-humane primaten. We beschrijven methoden voor de extractie en analyse van haar CORT met hoge precisie en gevoeligheid. Meting van haar CORT is bijzonder geschikt voor het beoordelen van chronische spanning gedurende een periode van weken tot maanden.

Extractie en analyse van Cortisol van de mens en de Monkey Hair

Er is behoefte aan een niet-invasieve bepaling van stress. Dit document beschrijft een eenvoudig protocol met behulp van thermische beeldvorming om een ​​significante respons in het oog-regio temperatuur in wilde pimpelmezen een milde acute stressor detecteren.

Thermal Imaging Stress Non-invasief in Ongeremde Vogels Studie

Niermergactiviteit kan bij paardachtigen worden beoordeeld door analyse van corticosteron-metabolieten in de ontlasting. De methode biedt een niet-invasieve optie om langetermijnpatronen bij zowel gedomesticeerde als vrijlevende paarden te beoordelen. Dit protocol beschrijft de betrokken enzymgekoppelde immunossay en de bijbehorende biochemische validatie.

Fecale Glucocorticoïd Analyse: Niet-invasieve bijnier Toezicht op Equids

Cortisol concentratie haaranalyse biedt een alternatief voor traditionele maatregelen van cortisol; echter, om te verzamelen haar monsters van Afro-Amerikanen, wetenschappers moeten cultureel geïnformeerd en bevoegde. Het doel van dit protocol is om aan te tonen van een cultureel geïnformeerd techniek om te verzamelen haar monsters voor cortisol analyse van Afro-Amerikanen.

Verzamelen van haar monsters voor Cortisol haaranalyse in Afro-Amerikanen

Het doel van dit artikel is om veranderingen in stress niveaus te identificeren na visitatie naar drie verschillende instellingen en om de methoden te beschrijven die worden gebruikt bij het identificeren van stress niveaus op basis van maatregelen van speeksel cortisol, α-amylase en een psychologisch zelf rapport Instrument.

Het meten van biofysische en psychologische stress niveaus na visitatie naar drie locaties met verschillende niveaus van de natuur

In deze studie presenteren we een protocol voor cortisol extractie uit de Fin en kaakbeen van steursoorten. De cortisol spiegels van Fin en Jawbone werden verder onderzocht door twee wasoplosmiddelen te vergelijken, gevolgd door ELISA-assays. Deze studie bestuurde de haalbaarheid van Jawbone cortisol als een nieuwe stress-indicator.

Cortisol extractie van Sturgeon Fin en Jawbone matrices

Dit protocol laat zien hoe praktische zinvolle milieu verrijking voor varkens die in de verschillende stadia van hun leven op een lattenbodem zijn ondergebracht, en het verzamelen van speeksel monsters op een niet-invasieve manier voor de meting van cortisol concentraties, als biomarker voor acute stress.

Het verstrekken van zinvolle milieu verrijking en het meten van speeksel cortisol bij varkens ondergebracht op een roostervloer

Dit protocol beschrijft de methode voor het bepalen van basale en forskolin gestimuleerde lipolyse in inguineuze vetkussens die worden verkregen uit normale Chow Diet (NCD) of met hoge vet dieet (HFD) ± capsaicine gevoed wild type muizen. Als een index voor lipolyse werd de glycerol-afgifte gemeten van ingewanden van adipose vetpads.

Meting van basale en forskolin-gestimuleerde lipolyse in buikvlies vetpads

Het doel van het protocol is te bereiden keratine hydrolysaat van kippenveren door alkalische-enzymatische hydrolyse en om te testen of het toevoegen van keratine hydrolysaat in een cosmetica zalf basis verbetert de barrièrefunctie van de huid (verhooging hydratatie en afnemen van transepidermal waterverlies). Tests zijn uitgevoerd op mannen en vrouw vrijwilligers.

Voorbereiding van keratine hydrolysaat van kippenveren en haar toepassing in cosmetica

Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.

Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases

Leer cortisolmeting in koalabont voor chronische stressbeoordeling met Phascolarctos cinereus. Deze methode biedt een gevoelige, reproduceerbare techniek voor klinisch beheer en behoud.

Cortisol meting in Koala (Phascolarctos cinereus) bont

Meer video's verkennen