Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Het gebruik van recombinant virussen is een krachtige technologie om zowel de virale replicatiemechanismen te ontcijferen als ontwikkelingsplatforms voor vaccins te bieden. Evenzo is het genereren van virale voorraad van goede kwaliteit cruciaal voor elke virale studie, van het meest fundamentele onderzoek tot de toegepaste studies. Redding van recombinant virussen, optimale oogst, bevriezing, en titratie van RSV voorraden zijn kritische methoden voor alle virologische studies.

Ze kunnen als traditioneel worden beschouwd, maar blijven delicaat en vereisen specifieke expertise. De dag voor de transfectie, schorsen BSR-T7/5 cellen in volledig medium op 0,5 miljoen cellen per milliliter concentratie. Verdeel twee milliliter van de celopening per put in een zes-put plaat.

Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5% kooldioxide totdat ze 80-90% samenvloeiing de volgende dag. Om elk virus te redden, eerst mengen ontdooide omgekeerde genetica vectoren in een buis, ga dan over tot transfectie, volgens de transfectie reagens fabrikant protocol. Voeg vervolgens 250 microliter van het gereduceerde serummedium toe aan de gemengde vectoren.

Verdun in een andere buis 10 microliter van dit transfectiereagens in 250 microliter van het verlaagde serummedium. Voorzichtig vortex beide buizen en wacht vijf minuten. Meng de inhoud van beide buizen en wacht 20 minuten op kamertemperatuur.

Spoel ondertussen de BSR-T7/5 cellen met één milliliter van het verlaagde serummedium en verdeel 1,5 milliliter minimaal essentiële mediaantibiotica vrij aangevuld met 10% foetaal kalfsserum per put. Indien nodig, uitbroeden bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide milieu. Voeg na de incubatie van 20 minuten 500 microliters van de transfectiemix in elke put toe.

Incubeer de cellen op 37 graden Celsius in 5%koolstofdioxide milieu gedurende drie dagen. Om de reddingsefficiëntie te controleren, observeer u bij GFP-fluorescentie onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij 20X-vergroting eenmaal per dag. Op de derde dag van transfectie, krascellen in elke put van de transfected BSR-T7/5 zes-put plaat.

Breng cellen en supernatant van elke put in een steriele twee milliliter microcentrifuge buis. Om het geredde virus uit de celmembranen vrij te geven, moet elke buis minstens 30 seconden krachtig worden verwijderd. Voor de eerste versterking van de geredde virussen, eerst verwijderen van de cultuur medium van de HEp-2 plaat gezaaid de dag ervoor, dan snel toe te voegen 500 microliter per put van de verse passage-nul virale suspensie.

Plaats de HEp-2 plaat op 37 graden Celsius op een wip rocker voor zachte agitatie voor twee uur. Om de eerste passage van de geredde virussen te produceren, gooi 500 microliter van het entmateriaal weg en voeg twee milliliter MEM toe met 2% FCS. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende drie dagen.

Om de infectie te controleren onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij 20X vergroting, observeren GFP fluorescentie van de HEp-2 cellen besmet met de passage-nul suspensie eenmaal per dag. Let onder een helderveldmicroscoop op het uiterlijk van kleine syncytia en celloslating, die het RSV-cytopathische effect weerspiegelt. Om de geredde virussen te versterken, verdun eerst de virale schorsing van FCS-vrije MEM om een schorsing van drie milliliter te verkrijgen bij 50.000 PFU per milliliter, verwijder vervolgens het medium uit de HEp-2-kolf.

Voeg snel de drie-milliliter virale suspensie toe en broed de kolf bij 37 graden Celsius uit op een wiprocker voor zachte agitatie gedurende twee uur. Verwijder en gooi het eneculum weg en voeg 15 milliliter MEM toe met 2%FCS. Incubeer bij 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende twee tot vier dagen.

Om het juiste moment te schatten om de virussen te oogsten, controleer de celmorfologie en GFP-fluorescentie onder een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij vergroting van 20x. Merk op dat dit meestal is wanneer 50% tot 80% van de HEp-2 cellaag wordt losgemaakt als gevolg van de RSV cytopathische effect dat optreedt tussen 48 en 72 uur na infectie. Schrapen vervolgens alle cellen met behulp van een cel schraper.

Verzamel zowel de cellen als de supernatant samen en breng ze over naar een 50-milliliter centrifugebuis. Voeg 1/10 van het volume van de 10X RSV conserveringsoplossing toe. Vortex de buizen krachtig gedurende vijf seconden en centrifugeren gedurende vijf minuten op 200 keer g om de suspensie te verduidelijken.

Breng de supernatant over op een buis van 50 milliliter. Vortex kort en aliquot de suspensie in cryogene buizen gelabeld met alcohol-resistente tags. Dompel de buis onder in voorgekoelde, min 80 graden Celsius alcohol gedurende ten minste een uur en bewaar ze op min 80 graden Celsius.

Om een plaque titratie test uit te voeren, maak eerst 2X minimale essentiële medium door het verdunnen van commerciële 10X MEM met steriel water en het toevoegen van L-glutamine, 1, 000 eenheden per milliliter penicilline, en een milligram per milliliter streptomycine. Schud de verdunning krachtig en bewaar het op vier graden Celsius en voeg vervolgens 900 microliter van de FCS-vrije MEM toe aan zes buizen. Ontdooi het virus aliquots en vortex ze krachtig gedurende vijf seconden.

Om seriële verdunningen te maken, voeg eerst 100 microliter van het virus toe aan 900 microliter van het medium in de eerste buis. Leg de dop op de buis en meng de inhoud door vortexing voor een paar seconden, voeg dan 100 microliter van de eerste verdunning tot 900 microliter van het medium in de tweede buis. Leg de dop op de buis en vortex.

Herhaal deze procedure tot de zesde buis. Schrijf de naam van het virus en de volledige verdunningen op de HEp-2 12-well platen. Voeg een merk aan de plaat en de dekking, omdat ze kunnen worden gescheiden tijdens het bevlekken.

Haal het medium uit de platen en verdeel 400 microliter van één verdunning per put. Incubeer de platen op 37 graden Celsius gedurende twee uur voor virus adsorptie. Bereid tijdens de virusadsorptie de microkristallijne celluloseoverlay voor door eerst de pH van het 2X MEM aan te passen aan ongeveer 7,2 met een steriele natriumbicarbonaatoplossing met 7,5% na de kleurindicator.

Om 100 milliliter van de overlay te verkrijgen, voeg 10 milliliter 2x MEM, 10 milliliter van 2,4% monokristallijne cellulose suspensie, en 80 milliliter van de MEM aangevuld met 2%FCS en meng krachtig. Voeg aan het einde van de twee uur durende incubatie twee tot drie milliliter van de overlay toe aan elke put van de 12-putplaten zonder het entmateriaal te verwijderen. Broed de plaat zes dagen lang in 5%kooldioxide.

Om de cellen te bevlekken met kristalviolet oplossing, schud eerst voorzichtig de platen om de microkristallijne cellulose overlay af te nemen. Verwijder de supernatants en was de cellen twee keer met 1X PBS, voeg vervolgens een tot twee milliliter van de kristalviooloplossing toe en wacht 10 tot 15 minuten. Verwijder de oplossing, die kan worden hergebruikt voor latere plaat-vlekken.

Bereken ten slotte de virustiters als een fractie van het aantal zichtbare plaques in de putten van de droge platen en het entmateriaalvolume en de verdunning. Het uitvoeren van een plaque test op de negatieve controle, doorgetast met alleen de uitdrukking plasmiden van N, P, L, en M2-1 bleek geen plaque bij de laagste verdunning. De titers verkregen uit de transfected cellen werden verwacht dat meer dan 100 PFU per milliliter als de redding efficiënt was.

De titers verhoogd over de passages te bereiken een miljoen tot 10 miljoen PFU per milliliter bij passage een of twee. Dankzij deze fluorescerende virussen kan remming van RSV-expressie door siRNA gericht op het eiwit N en het cellulaire eiwit IMPDH gemakkelijk worden waargenomen en gemeten. Daarentegen werd een sterk GFP-signaal op controlecellen getransfecteerd met niet-targeting siRNA of cellen die met siRNA werden getransfecteerd tegen het cellulaire eiwit GAPDH.

Ook deze virussen maakten een gemakkelijke observatie van de remming van RSV vermenigvuldiging door een antivirale drug verbinding. Het volgen van het fluorescerende eiwit M2-1 in HEp-2 geïnfecteerde cellen toonde IBs en IB-geassocieerde korrels als zeer dynamische structuren. IBs werden waargenomen als mobiele en bolvormige structuren in staat om te smelten en grotere bolvormige insluitsels te vormen.

IB-geassocieerde korrels ondergingen continue assemblage-demontage cycli met de vorming van kleine IB-geassocieerde korrels die groeiden, versmolten tot grote IB-geassocieerde korrels, en vervolgens verdwenen. Het protocol van plaque titratie van RSV met behulp van microkristallijne cellulose overlay kan gemakkelijk worden aangepast aan andere cellen en/ of andere virussen. Het vereist aanpassing van de concentratie van de microkristallijncellulose.