Name: Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Ontdek MR-geleide convectieverbeterde levering van optogenetische virale vectoren in de macaque-cortex. Deze methode maakt grootschalige manipulatie van neurale activiteit mogelijk voor onderzoek naar complexe hersencircuits.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door American Heart Association postdoctorale Fellowship (AY), Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) reorganisatie en plasticiteit om schade herstel te versnellen (reparatie; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, en door het UCSF Neuroscience Imaging Center. Dit werk werd ook gesteund door het Eunice Kennedy Shiver National Institute of Child Health & menselijke ontwikkeling van de National Institutes of Health onder Award Number K12HD073945, het Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), en het Center for Neuro Technology (CNT, een National Science Foundation Engineering Research Center onder subsidie EEC-1028725). We danken Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani en Blakely Andrews voor hun hulp bij de experimenten en Nan Tian, Jiwei he, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz en Toni Haun voor technische hulp.

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, San Francisco institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) en zijn in overeenstemming met de gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. De volgende procedure werd uitgevoerd met twee volwassen mannelijke rhesus-makaken van 8 en 7 jaar, die respectievelijk 17,5 kg en 16,5 kg (Monkey G en Monkey J) wogen.
Opmerking: gebruik standaard aseptische technieken voor alle chirurgische ingrepen.
1. Baseline Imaging
<ol><li>Sedate en intuberen het dier en handhaven narcose onder Isofluraan (concentratie veranderd tussen 0 tot 5% indien nodig, afhankelijk van vitale functies zoals ademhalingsfrequentie en hartslag). Controleer de temperatuur van het dier, de hartslag, de zuurstofverzadiging, de elektrocardiografische responsen en de partiële getij druk van CO2 gedurende de hele procedure.</li>
	<li>Plaats het dier in een door de heer compatibel stereotaxsch frame (Zie de tabel met materialen) waarin het tijdens de gehele procedure zal blijven. Verbind het dier met een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine en Transporteer het naar de MRI-scanner (3 T).</li>
	<li>Verkrijg standaard T1 (Flip hoek = 9 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 668,6, matrixgrootte = 192 x 192 x 80, segment dikte = 1 mm) en T2 (Flip hoek = 130 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 52,5, matrixgrootte = 256 x 256 x 45, segment dikte = 1 mm) anatomische MR beelden als Baseline Referentie en voor chirurgische planning.</li>
	<li>Herstel het dier van de anesthesie en vervoer het naar de dieren huis gebied.</li>
	<li>Gebruik de verworven T1 en T2 beelden om te bepalen van de plaatsing van de craniotomie. De locatie van de craniotomie kan nauwkeurig worden bepaald door de corticale interesse van de heer te vergelijken met de makaak Brain Atlas (paxinos, Huang, petride, Toga 2ND Edition). Bovendien kunnen deze basislijn afbeeldingen een raming bieden voor de locaties van virale infusie. De corticale interessegebieden die hier worden gedemonstreerd zijn M1 en S1.</li>
</ol>2. MR-compatibele kamer implantatie
<ol><li>Sedate en intuberen het dier en handhaven narcose met standaard anestheticum monitoring zoals in 1,1.</li>
	<li>Plaats het dier in het door de heer compatibele stereotaxic-frame waarin het in de gehele kamer implantatie en de virale vector levering zal blijven. Verbind het dier met een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine.</li>
	<li>Maak een sagittale incisie ongeveer 2 cm van de middenlijn met een lengte van ongeveer 5 cm met een scalpel.</li>
	<li>Verwijder het onderliggende zachte weefsel van de schedel met liften (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Maak een circulaire craniotomie (2,5 cm diameter) om de vooraf geplande trajecten voor injecties te bedekken met behulp van een trefine (Zie tabel met materialen).<ol>
<li>Verlaag het Centreer punt van de trefine langs de rand van de trefine. Maak een inkeping in het midden van de geplande craniotomie voldoende diep in de schedel om de trefine te verankeren met behulp van het instelbare Centreer punt van de trefine. Wees voorzichtig om te voorkomen dat volledig doordringen door de diepte van de schedel, omdat dit schade aan het onderliggende zenuwweefsel kan veroorzaken.</li>
		<li>Spoel het gebied periodiek af met een zoutoplossing die nodig is om het weefselvocht gedurende de craniotomie te behouden.</li>
		<li>Zodra het centrum is gemaakt, verlaagt u de trefine op de schedel en draait u de trefine rechtsom en linksom terwijl u neerwaartse druk toepast totdat de botdop met een tang kan worden verwijderd. Wees voorzichtig om beschadiging van het onderliggende weefsel met de trefine te voorkomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rijg een fijne hechting (maat 6-0) door de Dura in het midden van de craniotomie en til de Dura op door zachtjes de hechting van het oppervlak van de hersenen te trekken en een tent te maken in het midden van de craniotomie.</li>
	<li>Vervolgens, prik de Dura dicht bij het midden van de tent met behulp van fijne oogheelkundige schaar om beschadiging van de hersenen te voorkomen. Snijd vervolgens de Dura van het middelpunt naar de rand van de craniotomie en ga verder langs de rand met een fijne opthalmische schaar.</li>
	<li>Monteer de cilindrische Custom-Made CED-kamer (Figuur 1; zie rubriek 4 voor productie-instructies) naar de schedel bovenop de craniotomie om canule ondersteuning te bieden tijdens de infusie van CED, zodat de kromming van de kamer flens wordt uitgelijnd goed met de kromming van de schedel.</li>
	<li>Bevestig de implantaten aan de schedel met behulp van plastic schroeven en tandheelkundige acryl of een paar Titanium schroeven.</li>
</ol>3. virale vector levering
<ol><li>Kort na het implanteren van de MR-compatibele kamer en het inbrengen van het canule injectie rooster (afbeelding 1a-B, aanvullend figuur 1) in de kamer, vult u het rooster met zoutoplossing (0,9% NaCl) voor het visualiseren van de injectie locaties via de heer anatomische beelden en Vul de kamer holten met natte steriele absorberende gelatine om het vocht van de hersenen te handhaven (Figuur 1f).</li>
	<li>Bedek de huid en de cilinder met een steriele antimicrobiële Engrave draperen om de steriliteit van de cilinders tijdens het transport en de heer infusies te behouden. Plaats een vitamine E-capsule om de bovenkant van het injectie raster te markeren voor positieve identificatie.</li>
	<li>Terwijl het dier geintubleerd blijft, maak de endotracheale buis los van het anesthesie circuit en bevestig het opnieuw aan een draagbare Mr-compatibele Isofluraan machine en transporleer het dier naar de MRI-scanner.</li>
	<li>Verkrijg T1-beelden (Flip hoek = 9 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 668,6, matrixgrootte = 192 x 192, segment dikte = 1 mm, 80 segmenten) om de afstand vanaf de bovenkant van het injectie rooster en het corticale oppervlak te berekenen. De vitamine E-capsule is duidelijk zichtbaar in T1-beelden en moet worden gebruikt als een marker voor de bovenkant van het injectie rooster (Figuur 2a). Gebruik het liniaal gereedschap van de MR imaging-software om de afstand tussen de bovenkant van het injectie raster en het corticale oppervlak te meten.</li>
	<li>Verkrijg T2-afbeeldingen (Flip hoek = 130 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 52,5, matrixgrootte = 256 x 256, segment dikte = 1 mm, 45 segmenten) om de optimale canule geleiders voor elke locatie te bepalen op basis van de beoogde infusieplaats (Figuur 2b-C). Zoals eerder vermeld, is de canule grid gevuld met zoutoplossing die het beste zichtbaar is in T2-beelden. Scroll met behulp van de MR imaging software door de coronale en sagittale vlakken om de doellocatie van de infusie te vinden.</li>
	<li>Na het ontdooien van de virale vector voor een paar uur bij kamertemperatuur, meng de virale vector met de MR contrast agent gadoteridol (ratio van 250:1; 2mM gd-DTPA, Zie tabel van materialen) door pipet of Vortex mengen. Opmerking: De gepresenteerde techniek werd getest voor AAV-vectoren met een CamKIIa Promoter Driving expressie van C1V1 Fused to EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2,5 x 1012 virus moleculen/ml; Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Laad het gemengde virus in een Hogedruk buis van 0,2 mL (Zie tabel met materialen).</li>
	<li>Stel een steriel veld in buiten de heer scanner voor de bereiding van de virale infusielijn.</li>
	<li>Sluit met behulp van hogedruk-IV-buizen een lange Verleng lijn (ongeveer 3-5 meter, afhankelijk van de locatie van de infusiepomp met betrekking tot de MR-boring) aan op een MR-compatibele 3 mL spuit en Prime met zoutoplossing.</li>
	<li>Sluit het distale uiteinde van de lange Verleng lijn aan op het proximale uiteinde van de 0,2 mL IV-slang geladen met het virus en bevestig de reflux bestendige canule met een 1 mm getrapte punt (figuur 2D; zie rubriek 5 voor de productie-instructies van de canule) op het distale uiteinde van Deze montage met een klem stijl katheter connector (Zie tabel van de materialen) (figuur 2e).</li>
	<li>Tot slot, zet de spuit in een MR-compatibele pomp (Zie tabel van de materialen). Plaats de pompcontroller in de controlekamer van de scanner, omdat deze niet compatibel is met de heer.</li>
	<li>Met behulp van de baseline anatomische MR-beelden eerder verkregen, selecteer de canule injectie rooster locatie en de plaatsings diepte die nodig is om de doel infusieplaats te bereiken. Markeer de insertie diepte op de canule met behulp van steriele tape.</li>
	<li>Begin de infusie met een snelheid van 1 μL/min en valideer de vloeistof in de infuuslijn visueel door de ejectie van de vloeistof uit de canule tip te observeren.</li>
	<li>Plaats de canule handmatig via het injectie rooster op de doeldiepte terwijl u de stroom in de infuuslijn handhaaft, omdat dit het gepenetreerde weefsel verhindert om de canule tijdens het inbrengen te verstopt.</li>
	<li>Verkrijg snel (2 minuten) Flash T1 gewogen beelden (Flip hoek = 30 °, herhalings tijd/ECHO tijd = 3,05, matrixgrootte = 128 x 128, segment dikte = 1 mm, 64 segmenten) voor online monitoring van de virale vector infusie.</li>
	<li>Na infusie ~ 10 μL van de vector zodanig dat voldoende virus is geïnfundeerd om te detecteren in de heer scanner, verkrijgen van de heer afbeeldingen om te controleren of de juiste canule plaatsing zoals blijkt uit de waargenomen verspreiding van het virus. Als de diepte van de ingevoegde canule onjuist is, past u de diepte dienovereenkomstig aan of verwijdert u de canule langzaam en probeert u de invoeging opnieuw als in 3,12.</li>
	<li>Bewaak de infusie via begeleiding van online MR-beelden (Flash T1 gewogen) en verhoog de infusiesnelheid tot 5 μL/min met 1 μL/min stappen om de paar minuten (Figuur 3a).</li>
	<li>Na infusie ongeveer 40 μL van de virale vector, beginnen met het verminderen van de infusiesnelheid met 1 μL/min stappen en stop de infusie na ~ 50 μL wordt geïnjecteerd en laat de canule op zijn plaats voor 10 minuten.</li>
	<li>Verwijder langzaam de canule uit de hersenen en ga naar de volgende locatie. Herhaal de stappen 3,9 tot en met 3,19 voor elke locatie.</li>
	<li>Bedek de cilinder met een steriel draperen aan het einde van de injecties, vóór het vervoer van dieren. Vervoer het dier vervolgens terug naar de operatiekamer.</li>
	<li>Ofwel explant de MR-compatibele kamer en sluit de chirurgische incisie door de botflap en de bovenliggende spier te vervangen en de huid te voeden met behulp van standaard aseptische technieken of de kamer te vervangen door een titanium cilinder en kunstmatige Dura (Zie Yazdan-Shahmorad et al. 20169) voor neurale opname en stimulatie.</li>
</ol>4. MR-compatibele kamer productie
<ol><li>Fabriceren van het nylon canule injectie rooster (Figuur 1a-B) door bewerking volgens de gespecificeerde afmetingen (aanvullend figuur 1).</li>
	<li>3D print de MR-compatibele cilinder uit acrylonitril butadieen styreen (ABS0 plastic (figuur 1c-E) (Zie aanvullend bestand 1 – 3; zie tabel met materialen voor 3D-printers en-materialen). Opmerking: Eén ontwerp onderhoudt een vast canule-injectie rooster in de MR-compatibele cilinder (figuur 1c), terwijl een ander het raster kan roteren, waardoor het injectiegebied wordt verlengd (figuur 1d-E).</li>
	<li>Rijg het injectie rooster van de canule in en tik op de corresponderende holte van de MR-compatibele kamer, zodat beide stukken hetzelfde draadsnijden vertonen. Opmerking: Elk type draadsnijden kan worden gebruikt op voorwaarde dat beide componenten hetzelfde draadsnijden hebben.</li>
	<li>Steek het nylon canule injectie rooster in het getapt gat van de MR-compatibele cilinder.</li>
</ol>5. reflux bestendige productie van canule13
<ol><li>Knip een 30 cm lange silica slang met 0,32 mm ID en 0,43 mm OD voor de binnenste silica slang (Zie tabel met materialen) met behulp van een scheermesje.</li>
	<li>Snijd een 7,5 cm lange en een 5 cm lange silica buis met 0,45 mm ID en 0,76 mm OD voor de buitenste silica slang (Zie tabel van de materialen).</li>
	<li>Hecht de buitenste slang van 7,5 cm aan de binnenslang van 30 cm met cyanoacrylaat, zodat de binnenbuis 1 mm buiten de buitenste buis schuift, waardoor de reflux bestendige stap (figuur 2D) wordt. Om ervoor te zorgen dat het cyanoacrylaat niet in de binnenkant van de binnenslang komt, plaatst u het cyanoacrylaat op de buitenkant van de binnenslang ver van de tip van de canule.</li>
	<li>Plak de 5 cm lange silica buis aan het andere uiteinde van de binnenslang voor bevestiging aan de klem stijl katheter connector (zie stap 3,10).</li>
</ol>

<ol><li>Ruiz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+through+windows+on+the+brain+in+the+nonhuman+primate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (6), 1455-1467 (2013).</li>
<li>Diester, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optogenetic+toolbox+designed+for+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An optogenetic toolbox designed for primates.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 387-397 (2011).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> Journal of Neuroscience. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+induced+behavioral+and+functional+network+changes+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetically induced behavioral and functional network changes in primates.</a> Current Biology. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nature Neuroscience. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+electrical+microstimulation+systematically+bias+visuospatial+choice+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and electrical microstimulation systematically bias visuospatial choice in primates.</a> Current Biology. 24 (1), 63-69 (2014).</li>
<li>Afraz, A., Boyden, E. S., DiCarlo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+and+pharmacological+suppression+of+spatial+clusters+of+face+neurons+reveal+their+causal+role+in+face+gender+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optogenetic and pharmacological suppression of spatial clusters of face neurons reveal their causal role in face gender discrimination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 6730-6735 (2015).</li>
<li>Ledochowitsch, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+optical+control+and+simultaneous+electrical+readout+of+extended+cortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for optical control and simultaneous electrical readout of extended cortical circuits.</a> Journal of Neuroscience Methods. 256, 220-231 (2015).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Large-Scale+Interface+for+Optogenetic+Stimulation+and+Recording+in+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Large-Scale Interface for Optogenetic Stimulation and Recording in Nonhuman Primates.</a> Neuron. 89 (5), 927-939 (2016).</li>
<li>Ju, N., Jiang, R., Macknik, S. L., Martinez-Conde, S., Tang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+all-optical+interrogation+of+cortical+neurons+in+awake-behaving+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term all-optical interrogation of cortical neurons in awake-behaving nonhuman primates.</a> PLoS Biology. 16 (8), e2005839(2018).</li>
<li>Bankiewicz, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+AAV+vector+in+parkinsonian+monkeys%3B+in+vivo+detection+of+gene+expression+and+restoration+of+dopaminergic+function+using+pro-drug+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of AAV vector in parkinsonian monkeys; in vivo detection of gene expression and restoration of dopaminergic function using pro-drug approach.</a> Experimental Neurology. 164 (1), 2-14 (2000).</li>
<li>Kells, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+therapy-based+method+for+the+delivery+of+therapeutics+to+primate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient gene therapy-based method for the delivery of therapeutics to primate cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2407-2411 (2009).</li>
<li>Krauze, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflux-free+cannula+for+convection-enhanced+high-speed+delivery+of+therapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Reflux-free cannula for convection-enhanced high-speed delivery of therapeutic agents.</a> Journal of Neurosurgery. 103 (5), 923-929 (2005).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+optogenetic+expression+in+macaque+cortex+obtained+with+MR-guided%2C+convection+enhanced+delivery+%28CED%29+of+AAV+vector+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread optogenetic expression in macaque cortex obtained with MR-guided, convection enhanced delivery (CED) of AAV vector to the thalamus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 347-358 (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., Silversmith, D. B., Kharazia, V., Sabes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+cortical+reorganization+using+optogenetics+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeted cortical reorganization using optogenetics in non-human primates.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Yazdan-Shahmorad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+setup+for+chronic+optogenetic+stimulation+and+recording+across+cortical+areas+in+non-human+primates%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+BiOS%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a setup for chronic optogenetic stimulation and recording across cortical areas in non-human primates.</a> SPIE BiOS. , (2015).</li>
<li>Lerchner, W., Corgiat, B., Der Minassian, V., Saunders, R. C., Richmond, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+parameters+and+virus+dependent+choice+of+promoters+to+improve+neuron+targeting+in+the+nonhuman+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Injection parameters and virus dependent choice of promoters to improve neuron targeting in the nonhuman primate brain.</a> Gene Therapy. 21 (3), 233-241 (2014).</li>
<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (46), E7297-E7306 (2016).</li>
<li>Bobo, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+delivery+of+macromolecules+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2076-2080 (1994).</li>
<li>Lieberman, D. M., Laske, D. W., Morrison, P. F., Bankiewicz, K. S., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convection-enhanced+distribution+of+large+molecules+in+gray+matter+during+interstitial+drug+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Convection-enhanced distribution of large molecules in gray matter during interstitial drug infusion.</a> Journal of Neurosurgery. 82 (6), 1021-1029 (1995).</li>
<li>Lonser, R. R., Gogate, N., Morrison, P. F., Wood, J. D., Oldfield, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+convective+delivery+of+macromolecules+to+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Direct convective delivery of macromolecules to the spinal cord.</a> Journal of Neurosurgery. 89 (4), 616-622 (1998).</li>
<li>Szerlip, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+convection-enhanced+delivery+of+viruses+and+virus-sized+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of convection-enhanced delivery of viruses and virus-sized particles.</a> Journal of Neurosurgery. 107 (3), 560-567 (2007).</li>
</ol>

PNS heeft een financieel belang in Neuralink Corp., een bedrijf dat klinische therapieën ontwikkelt met behulp van hersenstimulatie.

Hier schetsen we een haalbare en efficiënte techniek voor het bereiken van grootschalige optogenetische expressie in NHP primaire somatosensorische en motorische cortex door de heer-Guided CED. Het gebruik van de heer-geleide CED biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele methoden van virale infusie in het NHP brein. Een van die voordelen is het vermogen om expressie te bereiken over grote gebieden met minder vereiste infusies. Bijvoorbeeld, met conventionele methoden, meerdere injecties van 1-2 μL van de...

Optogenetics is een krachtige tool die het mogelijk maakt voor de manipulatie van neurale activiteit en de studie van netwerkverbindingen in de hersenen. Het implementeren van deze techniek in niet-menselijke primaten (Nhp's) heeft het potentieel om ons begrip van grootschalige neurale berekeningen, cognitie en gedrag in het primaat brein te verbeteren. Hoewel optogenetics met succes is geïmplementeerd in nhp's in de afgelopen jaren1,2,3,4,5,6,7, een uitdaging die onderzoekers worden geconfronteerd met het bereiken van hoge niveaus van expressie in grote hersengebieden in deze dieren. Hier bieden we een efficiënte en vereenvoudigde aanpak om hoge niveaus van optogenetische expressie te bereiken in grote gebieden van de cortex in macaques. Deze techniek heeft een groot potentieel om de huidige optogenetische studies bij deze dieren te verbeteren in combinatie met state-of-the-art opname van8,9 en optische stimulatie10 technologieën.
Convectie verbeterde levering (CED) is een vaste methode voor de levering van farmacologische agentia en andere grote moleculen, waaronder virale vectoren, aan het centrale zenuwstelsel11,12,13. Terwijl conventionele toedienings methoden betrekking hebben op meervoudige infusies met een laag volume verdeeld over kleine hersengebieden, kan CED een bredere en meer gelijkmatige verdeling van de middelen met minder infusies bereiken. Druk-gedreven bulk vloeistofstroom (convectie) tijdens de infusie zorgt voor een breder en uniform verdeelde transductie van het doelweefsel bij het leveren van virale vectoren met CED. In recente studies toonden we de transductie en daaropvolgende optogenetische expressie van grote delen van de primaire motor (M1) en somatosensorische (S1) cortices9 en thalamus14 met behulp van magnetische resonantie (Mr)-geleide CED.
Hier schetsen we het gebruik van CED om optogenetische expressie in grote corticale gebieden te bereiken met slechts een paar corticale injecties.

<table><tbody><tr><td>0.2 mL High Pressure IV Tubing</td><td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABS plastic</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>Antimicrobial incise drape</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban Drape</td></tr><tr><td>Dental Acrylic</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>Acrylic Bonding Agent</td></tr><tr><td>Elevators</td><td>VWR International, LLC.</td><td>10196-564</td><td>Langenbeck Elevator, Wide Tip</td></tr><tr><td>Fine suture</td><td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td>1034505</td><td></td></tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Laser for light stimulation</td><td>Omicron-Laserage, Germany</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR compatible 3 cc syringe</td><td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>MR Imaging Software</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR-Compatible Pump</td><td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>Harvard PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>MR-compatible stereotaxic frame</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>Perifix Clamp Style Catheter Connector</td><td>B-Braun, Bethlehem, PA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Screws</td><td>Plastics 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>Nylon screws</td></tr><tr><td>Titanium screws</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>Self-tapping bone screws</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA Inc,</td><td>SKU:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE 3D printer</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E Capsule</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>Wet sterile absorbable gelatin</td><td>Pfizer Inc.</td><td>AZL0009034201</td><td>Gelfoam</td></tr></tbody></table>

convectie verbeterde levering van optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online mri-beelden

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

In niet-menselijke primaat (NHP) optogenetica, het infecteren van grote corticale gebieden met virale vectoren is vaak een moeilijke en tijdrovende taak. Hier tonen we het gebruik van magnetische resonantie (Mr) geleide convectie verbeterde levering (CED) van optogenetische virale vectoren in primaire somatosensorische (S1) en motor (M1) cortices van Makaken om een efficiënte, wijdverspreide corticale expressie van lichtgevoelige ionenkanalen. Adeno-geassocieerde virale (Aav) vectoren coderen van de rood-verplaatste opsin C1V1 gesmolten tot geel fluorescerende eiwit (eyfp) werden geïnjecteerd in de cortex van rhesus makaken onder leiding van de heer-geleide CED. Drie maanden na de infusie bevestigde epifluorescerende beeldvorming grote gebieden van optogenetische expressie (> 130 mm2) in M1 en S1 in twee macaques. Bovendien waren we in staat om betrouwbare licht-opgeroepen elektrofysiologie reacties op te nemen vanuit de uitschrijf gebieden met behulp van micro-elektrocorticografische arrays. Latere histologische analyse en immunokleuring tegen de reporter onthulde wijdverspreide en dichte optogenetische expressie in M1 en S1 overeenkomend met de verdeling aangegeven door epifluorescerende beeldvorming. Deze techniek stelt ons in staat om binnen een kortere periode uitdrukking te krijgen in grote delen van de cortex met minimale schade in vergelijking met de traditionele technieken en kan een optimale aanpak zijn voor optogenetische virale bezorging bij grote dieren zoals Nhp's. Deze aanpak toont een groot potentieel voor manipulatie op netwerkniveau van neurale circuits met cel-type specificiteit in diermodellen evolutionair dicht bij de mens.

Convectie verbeterde levering (CED) onder MRI-geleiding
De verspreiding van de virale vector werd gecontroleerd tijdens de infusie van CED onder leiding van online MR images (Figuur 3a). In deze studie werden S1 en M1 van twee apen getarget (Figuur 3b). De driedimensionale verdelings volumes werden geschat in een post-hoc analyse van de heer images (<st...

Hier demonstreren we magnetische resonantie (MR)-geleide convectie verbeterde levering (CED) van virale vectoren in de cortex als een efficiënte en vereenvoudigde aanpak voor het bereiken van optogenetische expressie in grote corticale gebieden in de makaak hersenen.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

Convectie verbeterde levering, of CED, van optogenetische virale vectoren in niet-menselijke primaten zal onderzoekers in staat stellen om neurale activiteit te manipuleren op grote schaal om complexe neurale berekeningen en gedrag te begrijpen. Met CED kunnen we een hoge optogenetische expressie bereiken in grote gebieden van het primaatbrein met slechts een paar injecties in een korte tijd in vergelijking met traditionele methoden. Magnetische resonantie of MR compatibele kamer implantatie wordt uitgevoerd met behulp van standaard praktijk in niet-menselijke primaten operaties, de procedure wordt in detail beschreven in het tekstprotocol en kort beschreven in deze video.Na dierlijke sedatie, positionering, en de eerste incisie zoals beschreven in het tekstprotocol, maak een cirkelvormige craniotomie om de vooraf geplande trajecten voor injecties met behulp van een trephine te dekken. Maak een inkeping in het midden van de geplande craniotomie voldoende diep in de schedel om de trephine te verankeren met behulp van het verstelbare middelpunt van de trephine. Zodra het centrum is gemaakt, laat de trephine op de schedel en draai de trephine met de klok mee en tegen de klok in, terwijl het toepassen van neerwaartse druk totdat het bot dop kan worden verwijderd met tangen.Na het opheffen van de dura zoals beschreven in het tekstprotocol, snijd de dura van het centrum naar de rand van de craniotomie en ga verder langs de rand met fijne oogheelkundige schaar. Monteer de cilindrische op maat gemaakte convectie verbeterde levering MR compatibele kamer aan de schedel op de top van de craniotomie om canule ondersteuning te bieden tijdens de infusie zodanig dat de kromming van de kamer flens goed aansluit bij de kromming van de schedel. Zet de implantaten aan de schedel met behulp van plastic schroeven en tandheelkundige acryl of een paar titanium schroeven.Kort na het implanteren van de MR compatibele kamer en het inbrengen van de canule injectie raster in de kamer, vul het rooster met 0,9% zout voor het visualiseren van de injectie locaties via MR anatomische beelden. Vul ook de kamerholtes met nat steriel absorbeerbaar gelschuim om het vocht van de hersenen te behouden. Bedek de huid en de cilinder met een steriel antimicrobiële snijgordijnen om de steriliteit van de cilinders tijdens het transport en MR-infusies te behouden.Plaats een vitamine E-capsule om de bovenkant van het injectierooster te markeren voor positieve identificatie. Terwijl het dier blijft geïntubeerd, los de endotracheale buis van de anesthesie circuit en opnieuw aan een draagbare MR compatibele isoflurane machine. Breng het dier naar de MRI-scanner.Verkrijg T1-beelden om de afstand tot de bovenkant van het injectieraster en het corticale oppervlak te berekenen. De vitamine E-capsule is duidelijk zichtbaar in T1-beelden en moet worden gebruikt als markering voor de bovenkant van het injectieraster. Verwerf T2-afbeeldingen om de optimale canulegeleiders voor elke site te bepalen op basis van de beoogde plaats van infusie.Het canulerooster is gevuld met zoutoplossing die het best zichtbaar is in T2-beelden. Scroll met de MR-beeldvormingssoftware door de coronale en sagittale vlakken om de doellocatie van infusie te vinden. Na het ontdooien van de virale vector gedurende een paar uur bij kamertemperatuur, meng de virale vector met de MR contrast agent gadoteridol door pipet of vortex mengen.Laad het gemengde virus in 0,2 milliliter hoge druk IV buizen. Sluit met behulp van de 4-buizen onder hoge druk een lange verlenglijn aan op een MR-compatibele drie milliliterspuit en prime met zoutoplossing. Sluit het andere uiteinde van de lange verlengbuis aan op de 0,2 milliliter IV-slang geladen met het virus.Bevestig vervolgens de refluxbestendige canule met een één milliliter getrapte punt aan het distale uiteinde van deze montage met een klemstijlkatheterconnector. Tot slot zet de spuit in een MR compatibele pomp. Selecteer met behulp van de verkregen anatomische MR-afbeeldingen de locatie van het canule-injectieraster en de invoegdiepte die nodig is om de doelinfusieplaats te bereiken.Markeer de invoegdiepte op de canule met steriele tape. Begin met de infusie met een snelheid van één microliter per minuut en valideer de stroom van de vloeistof in de infuuslijn visueel door de uitwerping van vloeistof uit de canulepunt te observeren. Steek de canule handmatig door het injectieraster in de doeldiepte terwijl de stroom in de infusielijn behouden blijft, omdat dit voorkomt dat het doorgedrongen weefsel de canule verstopt tijdens het inbrengen.Nu verwerven snelle flitser T1-gewogen beelden voor online monitoring van de virale vector infusie. Na het inbrengen van ongeveer 10 microliter van de vector zodanig dat er voldoende virus is toegediend om te detecteren in de MR-scanner, verkrijgen MR beelden om de juiste canule plaatsing te verifiëren, zoals blijkt uit de waargenomen verspreiding van het virus. Als de diepte van de ingebrachte canule onjuist is, past u de diepte dienovereenkomstig aan of verwijdert u de canule langzaam en voert u de invoegpositie opnieuw in.Monitor de infusie via begeleiding van online MR-afbeeldingen. Verhoog de infusiesnelheid tot vijf microliter per minuut met één microliter per minuut om de paar minuten. Het is belangrijk om de infusiesnelheid langzaam te verhogen en niet meer dan vijf microliter per minuut te overschrijden, omdat hoge infusiesnelheden weefselschade kunnen veroorzaken.Na het inbrengen van ongeveer 40 microliters van de virale vector, beginnen met het verminderen van de infusiesnelheid met een microliter per minuut stappen. Stop de infusie nadat ongeveer 50 microliter wordt geïnjecteerd. Laat de canule tien minuten op zijn plaats.Verwijder langzaam de canule uit de hersenen en ga naar de volgende locatie. Bedek de cilinder met een steriele gordijn aan het einde van injecties voor het vervoer van dieren en breng het dier vervolgens terug naar de operatiekamer. Histologische analyses op seriële coronale secties onthullen grootschalige optogenetische expressie rond de infusieplaatsen.Hier wordt de baseline coronale MR-afbeelding en de verspreiding van het contrastmiddel na de infusie voor dezelfde MR coronale slice weergegeven. Een coronale weefselsectie wordt getoond van ongeveer het zelfde. Peroxidase kleuring weerspiegelt expressie van het gele fluorescerende eiwit of EYFP-verslaggever.Goede uitlijning wordt waargenomen tussen het gebied van de EYFP-expressie, gemeten met oppervlakte-epifluorescense en met histologische kleuring. Deze omvatten het gebied van vector verspreid geschat op MR-beelden. Witte stippen geven injectieplaatsen aan en het hele zwarte gebied vertegenwoordigt het gebied dat door de craniotomie wordt blootgesteld.Hier is een lage vergroting beeld van de coronale secties bevlekt met anti GFP anti-antilichaam toont het mediale laterale aspect van YFP expressie in de somatosensorische cortex. De zwarte pijlpunt geeft de locatie van de canuletrack aan. Het aangrenzende weefsel wordt bij een grotere vergroting getoond om laminaire verdeling van de YFP-positieve cellen te tonen.Dichtbevolkte gebieden van YFP-positieve cellen bevinden zich voornamelijk in de lagen twee tot en met drie en vijf tot en met zes. Verdere uitbreiding onthult typische piramidale cellen in lagen twee tot en met drie, laag vijf en laag zes. Het is belangrijk om de canule 10 minuten na het stoppen van de stroom op zijn plaats te laten.Dit zal ervoor zorgen dat het virus is doorgeperceerd in de omliggende gerichte neurale weefsel. CED is een efficiënte aanpak om uniform hoge expressieniveaus te bereiken in grote hersengebieden bij zoogdieren. Het heeft het potentieel om ons begrip van neurale circuits en connectiviteit uit te breiden.Na virale transductie door CED, kunnen latere optogenetische stimulatie-experimenten worden gecombineerd met elektrische opname- en gedragsessays om de complexe circuitdynamiek in de hersenen te onthullen. Deze techniek werd eerder gebruikt door Yazdan-Shahmorad en collega's in 2018, waarbij optogenetische neurale modulatie werd gebruikt om netwerkbrede connectiviteitsveranderingen in de sensorische motorische cortex te induceren.

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier presenteren we de intracraniële injectie van AAV-vectoren voor TL-etikettering van neuronen en glia in de visuele cortex.

Intracraniële Injectie van adeno-geassocieerde virale vectoren

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Optogenetische Functionele MRI

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

Zoals momenteel geïmplementeerd, vereist optogenetica bij niet-menselijke primaten injectie van virale vectoren in de hersenen. Een optimale injectiemethode moet betrouwbaar zijn en, voor veel toepassingen, in staat zijn om individuele locaties van willekeurige diepte te targeten die gemakkelijk en ondubbelzinnig worden geïdentificeerd in de postmortale histologie. Een injectiemethode met deze eigenschappen wordt gepresenteerd.

Injecties van AAV-vectoren voor optogenetica in verdoofde en wakkere zich gedragende niet-menselijke primatenhersenen

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Hier beschrijven we een protocol dat adeno-geassocieerde virusinjectie combineert met craniale raamimplantatie voor gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamiek en neuronale activiteit bij wakkere muizen.

Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Er wordt een nieuwe techniek beschreven voor wijdverbreide toediening van adeno-geassocieerd virus waarbij gebruik wordt gemaakt van infusie van subarachnoïdaal virus. Deze methode zorgt niet alleen voor wijdverspreide transductie van neocorticale neuronen van muizen in oppervlakkige lagen, maar resulteert ook in selectieve expressie van het transgen in laag vijf piramidale neuronen, zelfs bij gebruik van een niet-selectieve promotor.

Wijdverbreide transductie van neocorticale neuronen van muizen door subarachnoïdale injectie van AAV2

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Een procedure beschreven voor het manipuleren van de activiteit van cerebrale corticale piramidale neuronen optogenetically terwijl de elektro, elektromyogram en cerebrale lactaatconcentratie bewaakt. Experimentele opnamen worden uitgevoerd op kabel-tethered muizen, terwijl ze ondergaan spontane slaap / waak cyclus. Optogenetic apparatuur geassembleerd in ons laboratorium controleapparaat handel verkrijgbaar.

Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Ontdek MR-geleide convectieverbeterde levering van optogenetische virale vectoren in de macaque-cortex. Deze methode maakt grootschalige manipulatie van neurale activiteit mogelijk voor onderzoek naar complexe hersencircuits.

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden (Video) | JoVE Journal

Convectie verbeterde levering van Optogenetische adeno-geassocieerde virale vector aan de cortex van rhesus macaque onder begeleiding van online MRI-beelden

Meer video's verkennen