Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis

Dit model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis kan worden gebruikt om belangrijke eindpunten en vermenigvuldigde markers van kleine darmletsel en compenserende hyperproliferatie bij muizen te bepalen. Deze methode is tijd- en kostenefficiënt en eenvoudig uit te voeren. Met een gestandaardiseerde methode als deze is het gemakkelijker om analytische eindpunten te vergelijken met weinig variaties.

Voor 5-Florauracil of 5FU mucositis inductie, laad een 1-milliliter spuit uitgerust met een 27 meter bij 19 millimeter naald met het juiste volume van 5FU en handmatig beperken een ontvanger muis. Met behoud van de muis in een stevige maar zachte greep, bloot de ventrale kant van het dier en steek de naald in de intraparitoneale holte in een van de onderste kwadranten van de buik. Dan, aanzuigen om de juiste naald plaatsing te garanderen en injecteren van de 5FU.

Op het juiste experimentele eindpunt, 4-Bromo-Deoxyuridine of BrdU kwantificering, weeg een 5FU gewonde dierlijke muis en leveren 5 milligram per kilogram BrdU door intraperitoneale injectie in een rookkap. 150 minuten na de BrdU-injetie, bevestig een gebrek aan respons op teensnuifje, registreert u het gewicht van de verdoofde muis en plaatst u het dier in de liggende positie. Voer een laparotomie uit om de buikholte bloot te leggen en maak een incisie van de borstholte om pneumothorax te introduceren.

Snijd superieur aan de pylorus, en zorgvuldig extract trekken het darmweefsel uit de buurt van het dier totdat het cecum is bereikt. Klem met tangen het proximale lumen voorzichtig dicht en gebruik een spuit van 10 milliliter uitgerust met een naald van 25 meter om de dunne darm met zout te spoelen. Plaats vervolgens de geleegde darm op schoon blotting papier om zorgvuldig te verwijderen van de overtollige zout oplossing.

Voor weefselverzameling, oogst de dunne darm van het geïnjecteerde dier zoals net aangetoond en registreert het gewicht van het gespoelde weefsel. Na histologische verwerking kan het weefsel worden afgebeeld onder de 10x doelstelling van een lichtmicroscoop die is aangesloten op een camera om histologische foto's van het geoogste weefsel te verkrijgen. Als u het gebied van de BrdU-immunoactieve cellen wilt meten, opent u het beeld van interesse in afbeelding J en opent u het beeld van de fasemicrometer.

Gebruik het gereedschap Rechte lijnselectie om een rechte lijn op de afbeelding van de micrometer te tekenen om een bekende afstand te definiëren en de ingestelde schaal in het analysemenu te selecteren. Voer een waarde in het bekende afstandsvak in en definieer de lengte-eenheid in het vak Lengte. Open een afbeelding van belang om het gebied van de BrdU-immunoactieve cellen per crypte te meten en stel de kleurenafbeeldingen in op 8-bits onder het menu van het afbeeldingstype.

Verhoog het contrast van de afbeelding onder procesverrwaarder contrast en stel de verzadigde pixels in op 0,4%Een drempelwaarde toepassen op de afbeelding om de immunoposiviteit te segmenteren en afbeeldingsweergave te selecteren. Selecteer drempel en rood en verplaats de drempelbalk om een drempelwaarde van ongeveer 10 tot 20 procent te selecteren. Selecteer vervolgens een goed georiënteerde crypte en gebruik het gereedschap uit de vrije hand om het gebied eromheen te markeren.

Als u het drempelgebied wilt meten, opent u het tabblad Analyseren en selecteert u deeltjes analyseren. Stel de grootte in het venster Deeltjes analyseren in op 20 op oneindig en klik op de pixeleenheden van het vak. Stel de circulariteit in op nul op één en stel de show in op contouren.

Klik vervolgens op de weergaveresultaten, vat samen en voeg gaten op. De meetresultaten worden weergegeven in het overzichtsvenster. Als u de cryptediepte wilt meten, opent u een afbeelding in Zen Light en maakt u verbinding met de camera.

Maak momentopnamen in de cameramodus met een doelstelling van 20x en schakel over naar de verwerkingsmodus om de momentopname te openen. Ga naar de metingsweergave. Gebruik de lijn tool om een lijn te starten aan de onderkant van een goed georiënteerde crypte, afwerking van de lijn aan de bovenkant van de crypte.

Exporteer vervolgens de metingen en bereken het gemiddelde van de cryptediepte en vul als hoogte. Het gewicht van de dunne darm neemt af van dag 2 tot dag 4, wat wijst op een verlies in de enterocyte massa. Van belang, door dag 5, het gewicht is niet significant anders dan het gewicht van dag 0 op behandelde dieren.

De gemeten proliferatie door BrdU-integratie wordt bijna afgeschaft op dag 1 en 2, maar op dag 4 en 5 zijn er respectievelijk ongeveer vier- en vijfvoudige toename van hun proliferatie. Deze hyperproliferatie wordt ook waargenomen bij het meten van de crypte diepte. In de regeneratieve fase van mucositis is er een sterke correlatie tussen BrdU-integratie en cryptediepte die niet wordt waargenomen tijdens de acute fase, wat suggereert dat het gebruik van cryptediepte als eindpunt geschikt zou kunnen zijn in de acute fase van mucositis.

Transgene muizen, met een onvoldoende L-celafscheiding, vertonen een aanzienlijk verlies van lichaamsgewicht en een afname van het gewicht van de dunne darm in de herstelfase, vergeleken met die waargenomen bij wilde type 5-FU muizen. Verder, de transgene muizen niet te tonen compenserende hyperproliferatie als de crypten zijn aanzienlijk korter dan in zowel wild-type muizen en gezonde controles. Tijdens een poging deze procedure, zorg ervoor dat de dunne darm volledig leeg, en om de overtollige zoutoplossing te verwijderen voor het wegen van het weefsel om het kleine darmgewicht gewicht alleen te verkrijgen.

Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe te gedrag, verzamelen, en bepalen van belangrijke eindpunten van kleine darmletsel. En om reproduceerbare gegevens effectief te verkrijgen. Vergeet niet dat het werken met chemische verbindingen zoals 5FU en BrdU gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van een labjas, handschoenen en een rookkap altijd moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedures.