Intraveneuze triculaire transplantatie van engineered neuronale precursoren voor in vivo Neuroarchitecture studies

Het algemene doel van deze techniek is de beoordeling van het effect van genexpressie manipulaties op corticale neuronale architectuur in vivo. Ons eerste belangrijke voordeel van deze procedure ten opzichte van die gebaseerd op een neutrale elektroporatie, is de fijne controle van genexpressieniveaus. Specifiek, deze geïntegreerde pijpleiding maakt de in vivo evaluatie van defect, verheven door kleine veranderingen in genexpressie op de controle van neuronale cytoarchitectuur.

Bovendien zorgt de pairstructuur van de transplantatietest voor een enorme vermindering van het aantal dieren dat nodig is om statistisch significante resultaten te verkrijgen. De techniek maakt gebruik van een precursorpool afkomstig van Tau EGFP transgene embryo's. Deze pool is onderverdeeld in twee subpools die als alternatief zijn geïnfecteerd met twee lentivirale mixen.

Om een groene testpool en een gele controlepool te verkrijgen die mede-injecteerde zal worden. Na twee dagen van in vitro expansie, de resulterende neuro bollen worden losgekoppeld, gemengd een op een, en geïnjecteerd met een capillaire in de muis ventriculaire ruimte. Tien dagen later wordt immunofluorescentie op coronale secties uitgevoerd om de vergelijking tussen test- en controleneuronen mogelijk te maken.

Ten slotte worden de immunovlekken afgebeeld en geskeletteerd voor de eindevaluatie van morfometrische parameters. Voordat in vivo transplantatie, bereiden de voorloper groene zwembad. E12.5 embryo's, geoogst uit een zwangere moeder die voorheen aan een Tau EGFP-oprichter werd gekoppeld, worden in individuele putten van een multi-well plaat in PBS-oplossing geplaatst.

Genotype ze snel door visuele inspectie onder een blauw licht lamp. Loskoppelen van de ontleed groene cortices aan enkele cellen. Schorst cellen opnieuw in proliferative medium en verdeel ze onder in twee even grote subpools.

Infecteer elke subpool met een speciale lentivirale mix. Elke mix bevat rood label virus of zwart controlevirus. Evenals virussen voor Tet-Off gedreven transgene of controle expressie, respectievelijk.

Elk lentivirus moet worden toegediend bij een veelheid aan infectie van 8. Plaat de geïnfecteerde cellen in proliferative medium met 2 microgram per milliliter doxycycline. Breng cellen naar de couveuse en laat ze gedurende 2 dagen op 37 graden.

Na 2 dagen moeten de twee subpools verschijnen als suspensies van kleine neurosferen. Homogeen uitdrukken van de rode fluorescerende eiwit, of niet. Na de engineering van precursoren, stel een beoordeling array voor de transplantatie in P0 witte lab pups.

Gebruik de borosilicaat glazen haarvaten met een eeuwige en interne diameter van respectievelijk 1,5 millimeter en 1,12 millimeter. Trek de capillaire met een P1000 trekker. Voer eerst het trekprogramma in.

Ten tweede, plaats de capillaire in de houders en draai ze aan. Ten derde, start het programma en neem de twee getrokken microcapillaries. Snijd de capillaire punt, met de hand met een scalpel, onder de stereomicroscoop om een tip met een uitwendige diameter van 200-250 micrometer te verkrijgen.

Tot slot, plaats de haarvaten op de plasticine steun in een gesloten petrischaal, en breng het onder de motorkap. Ontsmet optische vezels en leg ze onder de motorkap. Meng de EGTA en Fast Green master mixen, om de cel tracer oplossing voor te bereiden, en plaats het opnieuw onder de motorkap.

Snijd kleine stukjes laboratorium afdichting film voor cel suspensie spotting. En tot slot, bereid een oplossing van 1 milligram per milliliter steriele doxycycline verwijderd in een 0,3 milliliter spuit. De injectiebuis wordt bereid uit twee latexbuizen.

Bevestig een harde plastic mond stuk aan het ene uiteinde van een latex buis. Bevestig vervolgens de capillaire houder aan het ene uiteinde van de andere latexbuis. Sluit de vrije uiteinden van de twee latexbuizen aan van een 0,45 micrometer steriel filter, als barrière tegen operatorkiemen.

Plaats de resulterende aspiratorbuisassemblage op een plasticinehouder die onder de motorkap moet worden gehouden. Verzamel, test en controleer neurosferen in afzonderlijke buizen. Centrifuge neurosfeer suspensies en vervang de supernatant door PBS.

Herhaal deze reeks nog twee keer. Centrifuge neurosfeer suspensies, vervang de supernatant door trypsine oplossing, en pipette de cel pellet op en neer, 4, 5 keer. Laat cellen in de couveuse voor vijf minuten om een enkele cel suspensie te krijgen.

Blokkeer trypsine met trypsine remmer oplossing. Centrifuge cellen, en opnieuw op te schorten in verse proliferative medium. Tel cellen van de twee zwembaden en pas hun concentratie aan op 100.000 cellen per microliter, in proliferative medium.

Meng vervolgens de test- en besturingscellen 1:1 en controleer de resulterende mix onder een fluorescentiemicroscoop. Tot slot, plaats de mix op ijs onder de motorkap. Bereid de kooi met de moeder en de pups op een tafel ver weg van de chirurgische operatory gebied.

Plaats een herstelkooi op een kar. Doe een mengsel van zaagsel uit de kooi van de moeder op de bodem, en plaats de herstelkooi onder een lamp. Zet terzijde, zet een ijsdoos bedekt met een aluminiumfolie voor de anesthesie van de P0 pups.

Vlak voor de transplantatie, voeg een 1 tot 10 volume van cel tracer oplossing aan een volume van de cel suspensie, en ter plaatse drie microliters van de resulterende mix op een stuk van laboratorium afdichting film. Plaats de pup op de koele, aluminiumfolie voor een minuut, en controleer of het volledig verdoofd. Ondertussen, aspirate de 3 microliters van injectie mix in het glas capillair.

Veeg voorzichtig het hoofd van de verdoofde pup af met 70% ethanol. Zoek het vervolgens op de optische vezel, om de corticale hemisferen duidelijk te identificeren. Voer de capillaire in de voorkant en toegang tot de ventriculaire holte.

Terwijl u dat doet, let dan niet op schade aan bloedvaten. Om schade van ganglionic eminentie te voorkomen, draai de naald lateraal door dertig graden. Injecteer de cellen voorzichtig in de holte en controleer de verspreiding ervan door middel van Fast Green.

Wacht vijf tot tien seconden. Verwijder de glazen naald, waarbij u ervoor zorgt dat de celsuspensie niet wordt aangezogen en in een geschikte afvalbak wordt weggegooid. Voor het herstel van de pup van anesthesie, injecteer 150 microliters doxy oplossing intraperitoneally, om transgene expressie nog steeds af te houden na de transplantatie.

Plaats de pups na de injectie onmiddellijk onder de lamp voor herstel. Laat de pups daar voor vijf tot tien minuten, en zodra ze volledig wakker zijn, plaats ze in de kooi met de moeder. Let op de geopereerde pups gedurende twee tot drie uur, om ervoor te zorgen dat de moeder ze accepteert.

Voorslever de kooi van drinkwater met 0,5 mg/mL doxycyclie en sacharose, om de transgene uitdrukking af te houden. Vervang de doxycycline die water bevat vier dagen na transplantatie door doxyvrij water. Zo activeert het trans-gen in postmitotische neuronen.

Houd muizen zes dagen lang in een doxy-vrij regime en euthanaseer ze op P10. Fix hersenen van geëuthanaseerde pups in 4%PFA, op vier graden, 's nachts. Verwijder de PFA-oplossing en vervang deze door een 30%sucrose-oplossing.

Laat de hersenen op vier graden totdat ze zinken naar de flacon bodem. Breng de hersenen in een wegwerp inbedding schimmel ongeveer de helft gevuld met cryo-inclusion medium. Bevries de opgenomen hersenen op 80 graden.

Snijd 60 micron dikke coronale secties met behulp van een cryostat. Processecties voor anti-GFP, anti-RFP immunofluorescentie en tegensperd met DAPI oplossing. Stel de werkparameters van de confocale microscoop op de juiste manier in, zoals afgebeeld.

Verzamel foto's van immunoassayed plakjes, het selecteren van GFP positieve neuron-rijke fotografische velden blind van RFP signaal distributie. Exporteer de afbeeldingen als ND2-bestanden en genereer maximale z-projecties van deze bestanden als TIFF-bestanden. Om latere neuron skeletonization blind van celgenotype mogelijk te maken, verbergt u het rode signaal.

Voeg hiervoor een aanpassingslaag toe. Selecteer niveaus, selecteer rood. Stel de uitvoer in op nul.

En sla het bestand als zodanig op. Skeletonization wordt vervolgens uitgevoerd door een nieuwe operator, die geen eerdere toegang had tot originele gewone rode bestanden. Open voor elk verborgen rood bestand het bestand, voeg een tekenlaag toe aan de primaire afbeelding en selecteer het potloodgereedschap.

Traceer de somer op basis van GFP signaal. Zoek dan de neurites. Sla ten slotte het mutlilayer-bestand op, inclusief neuronale silhouetten.

Latere analyse van neuronale skeletten kan worden uitgevoerd door beide operatoren. Open elk mulitlayer-bestand en maak nieuwe lege 16-bits grijswaardenbestanden met een zwarte achtergrond. Eén per neuron.

Kopieer en plak enkele neuronale silhouetten, van de primaire afbeelding tot de grijswaardenbestanden. Ga terug naar het meerlaagse bestand en schakel de aanpassingslaag uit om neuronale genotypen te onthullen. Sla de 16-bits grijswaardenbestanden op en notatie van de bijbehorende neurongenogen.

Importeer grijswaardenafbeeldingen één voor één in ImageJ en analyseer skeletten van NeurphologyJ-plug-in. Verzamel geselecteerde primaire neurophologyJ-gegevens, het totale gebied van de neuritelengte, de bevestigingspunten en de eindpunten, in een spreadsheet en gebruik ze om secundaire morfometrische parameters te berekenen. Het engineering protocol dat wij voorstellen maakt het mogelijk om de overgrote meerderheid van de neuronen onderwerp van onderzoek cotransduce, met de beoogde transgenes sets.

Bovendien maakt het mogelijk om een aanzienlijke homogeniteit van transgene expressieniveaus binnen de getransduceerde celpopulatie te bereiken. Een belangrijk kenmerk van onze procedure, is het gekoppelde configuratie. Een test en een controle voorloper pool zijn afzonderlijk ontworpen, gemengd 1:1, en uiteindelijk co-getransplanteerd.

Deze gekoppelde aanpak zal de detectie van resultatenverschillen die specifiek verband houden met verschillende genotypen vergemakkelijken. In dit voorbeeld analyseerden we coronale secties van getransplanteerde pups, tien dagen na de interventriculaire co-injectie van Foxg1 over-uitdrukken neuron precursoren en controle degenen. Beelden van groepen neuronen werden verworven met confocale microscopie.

Z-stack bestanden werden gebruikt om maximale projecties te berekenen. Neuronale silhouetten werden handmatig getraceerd. Hier, groene en gele silhouetten vertegenwoordigen Foxg1 over-uitdrukken en controle neuronen, respectievelijk.

Ten slotte werden primaire parameters verkregen door NeurphologyJ-analyse gebruikt voor de berekening van secundaire morfometrische indexcijfers, zoals geïllustreerd. Dit is een eenvoudig protocol dat de onderzoeker in staat stelt om de impact die de gemengde expressie van een bepaald gen te evalueren, kan uitoefenen op fijne controle van de neuriet ontwikkeling darth in vivo. De belangrijkste voordelen van dit protocol zijn twee.

Bestaand aantal genen die betrokken zijn bij neuronale morfogenese kan functioneel worden gekarakteriseerd in vivo, bij afwezigheid van de overeenkomstige teratogene lijnen. En er zijn minder dieren nodig voor de analyse om de significante statistische resultaten te krijgen.