Dissectie van lokale Ca^{2 +} signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca^{2 +} indicatoren

De dissectie van calcium signalen op een sub-cellulaire resolutie, is een van de belangrijkste stappen voor het decoderen van intra-cellulaire calcium signalen die de output biologisch fenomeen te bepalen. Dit protocol beschrijft een nieuwe calciumbeeldvormingsmethode die het mogelijk maakt het zelfde moment van de calciuminstroom en calciumafgifte te monitoren. Dit protocol is van toepassing op alle celtypen die de expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren mogelijk maken.

Wij geloven dat onze methode het potentieel heeft om uit te breiden tot de dissectie van calciumsignalen bij de subcellulaire resolutie bij levende dieren in de labcultuur. Helpen om de procedure aan te tonen zal Matsumi Hirose, een technicus uit ons laboratorium. Om te beginnen met deze procedure, plaats 18 millimeter diameter glazen deksel slip in elke put van een 12 put plaat.

Gebruik gesteriliseerd water, en bereid 12,5 milliliter van een 0,4%PEI oplossing voor elke 12 put plaat wordt gebruikt. Voeg een milliliter van de PEI-oplossing toe aan elke put en zorg ervoor dat er geen bubbels onder de afdekbons zitten. Broeden 's nachts in een koolstofdioxide incubator op 37 graden Celsius.

De volgende dag gebruikt u een aspirator om de PEI-oplossing te verwijderen. Voeg een milliliter gesteriliseerd water toe aan elke put en schud de plaat zodat de PEI-oplossing tussen de afdeksel en de plaat grondig wordt uitgewassen. Herhaal dit wasproces twee keer extra met vers gesteriliseerd water.

Na de laatste wasbeurt, aspirate het water van elke put volledig. In de kap, gebruik een ultraviolet licht te drogen en steriliseren de cover glijdt gedurende ten minste 15 minuten. De PEI gecoate schotel kan worden opgeslagen op vier graden Celsius voor maximaal twee maanden.

Wanneer u klaar bent om verder te gaan, verlicht u de gerechten met het ultraviolette licht gedurende 15 minuten, vlak voor gebruik. Voeg vijf milliliter steriel gedestilleerd water toe in de ruimte tussen de putten om verdamping van het kweekmedium te voorkomen. Eerst, was de cortices met incubatie zout.

Vervolgens, incubeer de cortices met Trypsin en DNAse in incubatie zout gedurende vijf minuten op 37 graden Celsius. Was vervolgens de cortices drie keer met ijskoude incubatie zout. Verwijder de supernatant en voeg twee milliliter beplating medium aangevuld met 150 microliter van DNAse I voorraad.

Dissociate de cellen door pipetter twintig keer of minder en filter de cellen door een cel zeef met een porie grootte van 70 micrometer. Was vervolgens de celzeef met 20 milliliter van het beplatingsmedium. Voor de bereiding van bevroren celvoorraad, was de cellen met 20 milliliter van het wasmiddel.

Verdun de corticale cellen met beplatingsmedium tot een dichtheid van 140 000 levensvatbare cellen per milliliter. Voeg vervolgens een milliliter van de verdunde celsuspensie toe aan de PEI gecoate afdekslips in de 12 goed kweekplaten. Houd de cellen op 37 graden Celsius in een koolstofdioxide incubator voor twee tot drie dagen.

Wanneer de cellen stabiel zijn, twee tot drie dagen na beplating, verander het kweekmedium naar het onderhoudsmedium. Voor de bereiding van bevroren celvoorraad, draai de cel af, met behulp van een schommelrotor om de cellen drie minuten op 187 keer G te centrifugeren. Aspirate de supernatant en voeg de cryopreservatie medium, gehouden op vier graden Celsius, om een celdichtheid van 10 miljoen cellen per milliliter te verkrijgen.

Aliquot één milliliter van de celsuspensie in cryogene buizen. Plaats de buizen in een cel vriescontainer met een vriessnelheid van min een graad Celsius per minuut, totdat een temperatuur van min 80 graden Celsius is bereikt. Breng de vriescontainer naar een vriezer bij min 80 graden Celsius.

Om de bevroren cellen te doen herleven, verwarm je het wasmedium en het onderhoudsmedium voor bevroren corticale cellen. Vervolgens ontdooien de bevroren cellen snel in een waterbad op 37 graden Celsius. Verdun de cellen voorzichtig met voorverwarmd wasmedium en centrifuge met een schommelrotor op 187 keer G gedurende drie minuten.

Stel de pellet opnieuw op in één milliliter wasmiddel en meet de levensvatbare celdichtheid. Verdun vervolgens de cellen met het onderhoudsmedium voor bevroren corticale cellen, om een celdichtheid van 300 000 cellen per milliliter op te leveren. Geef een milliliter van deze cel suspensie af in de putten van de PEI gecoate 12 putplaten.

Voor transfectie drie tot acht dagen na beplating, label twee buizen, een voor plasma-DNA en de andere voor de transfectie reagens. Voeg 50 microliter met verlaagd serummedium per put toe aan elke buis. Voeg 0,5 microgram plasma-DNA per cover slip en een microliter van supplement vergezeld van transfectie reagens voor neuronen, per goed aan het plasma DNA buis.

Voor de co-transfectie van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f, meng 0,5 microgram van elke plasmid en een microliter supplement in 50 microliter van verminderd serum medium per put. Voeg vervolgens een microliter transfectiereagensagemiddel per put toe aan de transfectiereagens. Vortex beide buizen voor een tot twee seconden.

Voeg vervolgens het transfectiereagensmengsel toe aan het DNA-mengsel. Voorzichtig pipette te mengen en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Laad dit mengsel op de cellen in een druppel-wise manier.

Broeden in een koolstofdioxide incubator gedurende twee tot drie dagen tot de marker eiwitten worden uitgedrukt. Meng L en O om de OC-infectie te maken. Voeg drie microliters oc per put toe aan de gemengde neuron-astrocytencultuur.

Wieg de schotel voorzichtig om te mengen. Behoud de cultuur voor een tot twee weken totdat de GECI's worden uitgedrukt. Monteer eerst de afdekslip met de cellen die met Lck-RCaMP2 en OER-CaMPG6f in de opnamekamer van de microscoop worden getransfecteerd.

Voeg 400 microliter van het beeldmedium toe en plaats een deksel op de kamer. Kies de filterset voor GCaMP6f en de lichtbron. Zoek de astrocyten die OER-GCaMP6f uitdrukken.

Kies vervolgens een filterset en lichtbron voor RCaMP2 en bevestig of Lck-RCaMP2 in dezelfde astrocyten wordt uitgedrukt. Neem time lapse-beelden van Lck-RCaMP2 twee minuten op op twee Hertz en sla de beeldgegevens op. Wijzig hierna de filterset die terugbrengt naar die voor GCaMP6f.

Neem time lapse-beelden van OER-GCaMP6f op twee Hertz gedurende twee minuten op en sla de beeldgegevens op. In deze studie worden Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f uitgedrukt in HeLa-cellen en beide signalen werden gelijktijdig geregistreerd met behulp van beeldsplitsende optica, 24 uur na transfectie. Na de toevoeging van Histamine nam de signaalintensiteit van Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f toe.

De tijdscursussen van calciumion hoogte gerapporteerd door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f worden vergeleken in dezelfde regio's van belang. Beide sensoren rapporteren een oscillatie-achtige calciumion hoogte. En beide tonen dezelfde tijdskoers in twee van de vijf onderzochte cellen.

De calciumionenverhogingen van Lck-RCaMP2 blijven echter op het hogere niveau dan OER-GCaMP6f in de andere cellen. Deze resultaten geven aan dat calciumionhoogte wordt verlengd in de nabijheid van het plasmamembraan, terwijl het eerder rond de SEH wordt beëindigd, de bron van dit calciumionsignaal dat wordt veroorzaakt door Histamine-stimulatie. Spontane calciumionsignalen van astrocyten in de neuron-astrocyten gemengde cultuur van rat hippocampi en cortices worden getoond door Lck-RCaMP2 en OER-GCaMP6f.

Spontane calciumionenverhogingen zijn alleen zichtbaar bij het astrocytische proces, niet bij het cellichaam dat overeenkomt met eerdere rapporten. Spontane calciumionverhogingen door Lck-GCaMP6f in onrijpe rat hippocampal neuronen worden gezien op twee Hertz. De tijdscursussen voor vijf verschillende interessegebieden suggereren dat deze verhogingen lokaal beperkt zijn tot de subcellulaire domeinen.

Volwassen muis hippocampal neuronen besmet met OER-GCaMP6f-expressie AAV vectoren tonen calcium ionen reacties in reactie op de toevoeging van DHPG. Voor calciumbeeldvorming is de excitatie luminatiekracht de meest kritische factor. Houd het excitatielampje zo laag mogelijk om fotobleeken en fototoxiciteit te voorkomen.

De bron van de calciumsignalen kan verder worden bevestigd door Pomakorzi met behulp van specifieke remmers aan calciumkanalen. Het decoderen van calciumsignalen om specifieke output op te roepen is een fundamentele biologische vraag. Deze calcium imaging techniek effent de weg naar de diversiteit van intra-cellulaire calcium signalen te beschrijven.