Visualiseren van de waardevermindering van het endotheel en gliale belemmeringen van de neurovasculaire eenheid tijdens de experimentele Autoimmune encefalomyelitis In Vivo

De hier gepresenteerde methoden stellen ons in staat om de moleculaire mechanismen van immuuncelmigratie over de hersenbarrières te bestuderen in experimentele auto-immuunencefalomyelitis, een dierlijk model voor multiple sclerose. Door bloed-hersenbarrière permeabiliteit en matrix-metalloprotease activiteit te onderzoeken op hetzelfde moment in ruimtelijke correlatie met immuuncel infiltratie in hersenweefsel secties, kunnen we precies associëren deze neuro-inflammatoire gebeurtenissen aan de klinische tekenen van EAE. Professionele behandeling van zieke muizen vergt een grondige training, evenals de juiste score van de klinische symptomen van EAE.

De visuele demonstratie is dus gunstig. Begin deze procedure met verdovendering van C57-Black/6 muizen die zijn ondergebracht in specifieke pathogene-vrije omstandigheden zoals beschreven in het tekstprotocol. Bevestig de verdoofde muis in één hand en injecteer 30 microliter MOG-peptide en voltooi freunds adjuvante emulsie onderhuids in elk van de achterbeenflanken, in de nabijheid van de inguinale lymfeklieren.

Nu, plaats de muis op zijn buik, en injecteer 20 microliter van de MOG-peptide emulsie in het zachte vetweefsel op zowel de linker als de rechter bij de staartwortel. Injecteer ook een druppeltje van de emulsie in de hals van de muis. Injecteer 100 microliters van kinkhoest toxine oplossing intraperitoneally in de muis.

Houd het hoofd van de muis onder het lichaamscentrum om injectie in de darm te voorkomen. Vervang het onderhoudsdieet aan het fokdieet om de muizen te voorzien van voedsel met een hoger energiegehalte voor en tijdens de verwachte klinische ziekte. Herhaal de kinkhoest toxine injectie 48 uur na de eerste behandeling.

Controleer elke ochtend de gezondheidstoestand van EAE-muizen door een kijkje te nemen in de kooien. Scoor elke middag EAE muizen. Neem elke individuele muis in het EAE-experiment uit de kooi en controleer of de staart tonus heeft.

Beweeg de staart omhoog met een vinger. Een gezonde muis houdt zijn staart omhoog. Als klinische EAE is begonnen, zal de staarttonus lager zijn, zichtbaar door een geleidelijke daling van de staart.

Uiteindelijk zal de muis helemaal niet in staat zijn om zijn staart op te tillen. Plaats elke afzonderlijke muis in het EAE-experiment op de schone bank om het loopgedrag te observeren en te documenteren. Zie de tekst voor het scoren van criteria voor de beoordeling van de ernst van de ziekte, dat is de EAE-score.

Beoordeel en documenteer het gewicht van elke muis die in het experiment is opgenomen. Los voor de voorbereiding van dextran stock-oplossingen 10 milligram drie kilodalton Dextran Texas Red op in 500 microliter van 0,9%natriumchlorideoplossing en vijf milligram 10-kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 in 250 microliter van 0,9% natriumchlorideoplossing. Voor de dextran werkoplossing, net voor injectie, pipette 55 microliters van 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 voorraadoplossing op een stuk afdichtingsfilm.

Voeg vervolgens 55 microliters van drie kilodalton Dextran Texas Red stock oplossing. Meng en verzamel 100 microliters tot een wegwerp fijne spuit. Plaats vervolgens een verdoofde muis in de zijdelingse positie op de tafel.

Injecteer intraveneus 100 microliter fluorescerende tracers in de muis voordat de muis wakker wordt. Laat de tracer 15 minuten circuleren voordat u perfusie van muizen uitvoert zoals beschreven in het tekstprotocol. Vul een platte dewar container met gemalen droogijs, en voeg 2-methylbutaan tot de vloeistof bereikt ongeveer een centimeter boven het droge ijs pack.

Dek af met een los deksel, zoals een ijsemmerdeksel. Na het afknippen van het hoofd van de geperfundeerde muis met een scherpe schaar, verwijder de huid en oren met behulp van een kleinere set schaar. Ontleed de schedelkap voorzichtig door van de foramen magnum naar de voorkant aan de linker- en rechterkant te snijden, zodat de schedelkap over de hersenen kan worden opgevijbfseld.

Dan, voorzichtig til de intacte hersenen uit de basis van de schedel, terwijl het verbreken van de optische zenuwen met behulp van een platte metalen spatel. Plaats de hersenen op aluminiumfolie. Snijd de hersenen in drie stukken door het plaatsen van twee coronale bezuinigingen.

De drie stukken vertegenwoordigen de frontale hersenen, middelste hersenen, en cerebellum met hersenstam. Vul een Cryomold tot het eerste kwartaal met een optimale temperatuur snijmatrix. Plaats vervolgens de hersenen plakjes in de Cryomold, met de voorste kant van elk brein stuk naar beneden gericht.

Bedek het weefsel volledig met matrix. Plaats de Cryomold met het weefsel in een horizontale oriëntatie in het 2-methylbutaanbad. Zorg ervoor dat het weefsel bevriest van de bodem naar de top binnen een minuut door te voorkomen dat dompelen het hele weefsel blok in het bad.

Breng het bevroren weefsel over op min 80 graden Celsius voor opslag. Zie het tekstprotocol voor de bereiding van de bevroren weefselsecties. Haal zes-micron, niet-vaste hersenweefsel secties die waren voorbereid van EAE muizen.

In een rookkap ontdooit u de delen in de plastic vriesdoos met silicagel in het deksel om het vasthouden van water in het weefsel te voorkomen. Scheid twee weefselsecties op één dia door lijnen te tekenen met een waterafstotende pen. Centrifuge reactie oplossingen gedurende vijf minuten op 13, 300 keer g bij kamertemperatuur, en pre-warm tot 37 graden Celsius met behulp van een waterbad.

Hydrateer vervolgens de weefselsecties gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius met behulp van 1X-reactiebuffer. Na vijf minuten giet u de 1X-reactiebuffer af. Voeg reactie oplossing op de weefselsecties, en incubeer gedurende vier uur op 37 graden Celsius.

Was vervolgens de glijbanen vijf keer in dubbel gedestilleerd water. Nu, bevestig de secties gedurende vijf minuten met ijskoude methanol bij min 20 graden Celsius voordat ze een keer wassen met PBS bij kamertemperatuur. Voeg 1%BSA in PBS toe aan de sectie en broed gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.

Gooi vervolgens de buffer uit de sectie door de dia op een weefsel te draaien. Voeg primaire antilichaam cocktail aan de sectie, en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na het wassen van de secties twee keer met PBS, voeg secundaire antilichaam cocktail, en incubeer gedurende een uur op kamertemperatuur.

Was vervolgens de secties twee keer met PBS en monteer de dia's met inbeddingsoplossing. Nadat u de gemonteerde secties 's nachts bij kamertemperatuur hebt laten drogen, analyseert u gekleurde weefselsecties met behulp van een fluorescerende microscoop. De ernst van de EAE-ziekte neemt toe tot de piek van de ziekte, die kan worden verwacht tussen dag 16 en 20 na de inductie van EAE.

Op het hoogtepunt van klinische EAE vertoonden muizen ook het laagste lichaamsgewicht, wat toeneemt in correlatie met de verbetering van EAE in de remissiefase van de ziekte. Hier is een representatieve foto van de choroid plexus en de aangrenzende hersenen parenchyma van een C57-Black/ 6 muis die lijden aan EAE. De muis werd intraveneus geïnjecteerd 15 minuten voor het offeren.

Tracers verspreiden gemakkelijk over de fenestrated microschepen in de stoma van de choroïde plexus, terwijl de bloed-hersenbarrière niet de verspreiding van circulerende tracers in de hersenen parenchyma toestaat, die dus verstoken is van een fluorescerend signaal. Deze afbeeldingen tonen representatieve lekkende bloedvaten in het cerebellum van een C57-Black/6 muis die lijden aan EAE. Pijlpunten geven tracers verspreid over de hersenen microschepen in de CNS parenchyma, wat suggereert dat de bloed-hersenbarrière functie is aangetast in deze bloedvaten.

In het CNS parenchyma is groen en rood fluorescerend signaal zichtbaar buiten de bloedvatwanden. Een correcte onderhuidse plaatsing van de MOG-CFA-emulsie is essentieel om de juiste immuunrespons te monteren die leidt tot EAE. Intraperitoneale en intramusculaire injectie moeten worden vermeden.

Bereid CFA onder een rookkap om inademing van het verzwakte Mycobacterium te voorkomen. Vermijd ook een zelfinjectie met de MOG-CFA-emulsie, omdat dit condyloma kan veroorzaken of zelfs kan leiden tot EAE bij personen die genetisch aanleg hebben. Herseninfiltreren immuuncellen kunnen worden geïsoleerd van de CNS van muizen die lijden aan EAE te kwantificeren infiltreren immuuncelsubsets tijdens neuro-inflammatatie door flow cytometrie.

Het beoordelen van de integriteit van de endotheel en de glia hersenbarrières kan worden vertaald naar de analyse van genetisch gemodificeerde muismodellen of naar modellen van andere neurologische aandoeningen.