Inductie en karakterisering van pulmonale hypertensie bij muizen met behulp van het Hypoxia/SU5416-model
3 juni 2020
Dit protocol beschrijft de inductie van pulmonale hypertensie (PH) bij muizen op basis van de blootstelling aan hypoxie en de injectie van een VEGF receptor antagonist. De dieren ontwikkelen PH en rechts ventriculaire (RV) hypertrofie 3 weken na de inleiding van het protocol. De functionele en morfometrische karakterisering van het model wordt ook gepresenteerd.
Dit protocol kan worden gebruikt om pulmonale hypertensie te induceren en functionele metingen van de rechter ventrikel uit te voeren. Het Sugen Hypoxia Model is eenvoudig te implementeren en kan enkele kenmerken van longhypertensie samenvatten binnen twee tot drie weken na inductie. Met behulp van dit model kunnen we nieuwe trajecten identificeren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de ziekte.
We kunnen nieuwe doelen identificeren en hun therapeutisch potentieel testen. Voordat u met de inductieprocedure begint, u stikstoftanks in de buurt van de hypoxische kamer beveiligen en de zuurstofregelaar op een punt van 10% zuurstof instellen. Laad vervolgens vers bereide SU5416-oplossing in één milliliter spuit uitgerust met een naald van 25 meter en bedwing het eerste dier dat handmatig wordt geïnjecteerd.
Pak de huid om een tent parallel aan de wervelkolom te vormen en zorg ervoor dat je de achterkant van het hoofd stevig vastgrijpt om een mogelijke beetblessure door de muis te voorkomen. Steek de naald onderhuids over de flank bij de losse huidplooi parallel aan de huid en lever 100 microliter van de spuitinhoud. Na 10 seconden, trek de naald en breng het dier terug naar zijn kooi.
Wanneer alle dieren zijn geïnjecteerd, plaats de muizen in een geventileerde hypoxiekamer. Voor hypoxie blootstelling, bevestigen dat de kamers zijn uitgerust met een zuurstofsensor om het zuurstofgehalte te meten en open de kamers voor niet meer dan 20 minuten om de drie dagen voor het reinigen en toevoegen van voedsel en water. Inspecteer dieren dagelijks op tekenen van stress en herhaal de SU5416-injectie wekelijks gedurende drie opeenvolgende weken.
Bereid de Y-buisconnector voor het starten van de drukmeetprocedure en gebruik de handmatige modus om de functie van de ventilator te controleren. Stel de inspiratoire druk in op minder dan een centimeter water om barotrauma te voorkomen en stel de ademhalingssnelheid in op 110 ademhalingen per minuut. Snijd een 20-meter intravasculaire katheter om een endotracheale buis te creëren en zet de drukvolumeregelingseenheid in.
Start de data-acquisitie software en plaats het drukvolume katheter in een 15 milliliter centrifuge buis van PBS in een 37 graden Celsius waterbad. Kalibreer de katheter vervolgens volgens het protocol van de fabrikant. Plaats de muis op een verwarmingskussen en plaats een rectale sonde voor de bewaking van de lichaamstemperatuur.
Bevestig vervolgens een gebrek aan respons op teen knijpen in een verdoofde muis en scheer de nek en borst gebieden. Zet de ledematen van de muis vast met chirurgische tape en maak een incisie van één centimeter in de mediale cervicale huid. Met behulp van een katoen getipt applicator, botweg scheiden van de parotid en submandibulaire speekselklieren om de spieren die ten grondslag liggen aan de luchtpijp bloot te stellen.
Snijd de spieren zorgvuldig door om de luchtpijp volledig bloot te leggen en gebruik een schaar om een kleine incisie te maken tussen het tracheale kraakbeen. Plaats de voorbereide endotracheale buis en verwijder de metalen geleider van de intravasculaire katheter. Sluit vervolgens de katheter aan op de ventilator en controleer de luchtpijppositie door de longen handmatig voorzichtig op te blazen.
Beveilig de positie met tape. Voor de rechter ventrikel druk meting, maak een een centimeter huid incisie over de xiphoid proces en de bovenbuik en beginnen bij de middelste lijn distaal aan de xiphoid en zorgvuldig bewegen lateraal aan beide zijden, scheiden de huid over de borst en buikwand. Het openen van de buikholte, snijd het middenrif zorgvuldig, zorg ervoor dat het kloppende hart of de longen niet verwonden.
En gebruik een katoenen kip applicator om het pericardium voorzichtig te verwijderen. Breng de drukkatheter in de buurt van de muis en gebruik een katoenen kip applicator uitgerust met een naald om een steekwond te maken in het atypische distale deel van de rechter ventrikel. Vervang de naald voorzichtig door drukkatheter en plaats de drukkatheter parallel aan de richting van de rechterventrikel met de punt naar de longslagader.
Let op de drukgolftracering om de juiste positionering van de katheter te garanderen. Zodra het druksignaal is gestabiliseerd, pauzeer je de ademhalingen en verkrijg ten minste drie metingen. Wanneer alle metingen zijn geregistreerd, breng de katheter voorzichtig terug naar de met PBS gevulde centrifugebuis in het waterbad.
Hier worden representatieve drukcurven en een kwantitatieve analyse van de rechter ventriculaire druk aan het einde van de observatieperiode getoond. Histologische analyse van gerenoveerde longslagaders na hypoxie plus SU5416 behandeling blijkt een toename van mediale wanddikte in vergelijking met normoxic dieren. Tarwekiem agglutinine kleuring ter beoordeling van cardiomyocyte hypertrofie geeft aan dat hypoxie plus SU5416 blootstelling resulteert in een duidelijke toename van cardiomyocyte grootte en rechter ventriculaire hypertrofie.
Verder bevestigt de morfometrische evaluatie van de rechter ventriculaire hypertrofie door meting van de Fulton-index een toename van de rechterventriaire hypertrofie bij de hypoxische dieren. Het uitvoeren van de functionele metingen is belangrijk om bloedingen te voorkomen, omdat dit een negatieve invloed kan hebben op de resultaten van de studie. Dit protocol kan ook worden gebruikt om pulmonale hypertensie bij ratten te induceren met slechts lichte wijzigingen.
Met name is slechts één Sugen-injectie bij ratten voldoende om pulmonale hypertensie te veroorzaken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de inductie van pulmonale hypertensie (PH) bij muizen door blootstelling aan hypoxie en injectie van een VEGF-receptorantagonist. Het model maakt functionele en morfometrische karakterisering van PH en rechterventrikelhypertrofie mogelijk binnen drie weken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiovasculaire biologie
- Pathofysiologie
Achtergrond
- Pulmonale hypertensie is een ernstige aandoening die het cardiovasculaire systeem aantast.
- Begrip van de mechanismen achter PH kan leiden tot nieuwe therapeutische doelen.
- Het Sugen Hypoxie Model is een veel gebruikte methode om PH bij muizen te bestuderen.
- VEGF-receptorantagonisten spelen een rol in de ontwikkeling van PH.
Doel van het onderzoek
- Het induceren van pulmonale hypertensie in een gecontroleerd muismodel.
- Het uitvoeren van functionele metingen van de rechterventrikel.
- Het identificeren van nieuwe routes en therapeutische doelen voor PH.
Gebruikte methoden
- Inductie van hypoxie door het instellen van zuurstofniveaus op 10%.
- Injectie van SU5416 om VEGF-receptoren te blokkeren.
- Bewaking van de functie en morfologie van de rechterventrikel.
- Karakterisering van het model gedurende een periode van drie weken.
Belangrijkste resultaten
- Ontwikkeling van pulmonale hypertensie en rechterventrikelhypertrofie.
- Functionele metingen wijzen op significante veranderingen in de prestaties van de rechterventrikel.
- Morfologische veranderingen consistent met pulmonale hypertensie waargenomen.
- Identificatie van potentiële nieuwe therapeutische doelen voor behandeling.
Conclusies
- Het Sugen Hypoxie Model bootst effectief pulmonale hypertensie na.
- Dit model kan worden gebruikt om nieuwe routes die betrokken zijn bij PH te onderzoeken.
- Toekomstige studies kunnen dit model gebruiken voor therapeutische testen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
The hypoxia/SU5416 mouse model provides a rapid, cost-effective system for interrogating vascular remodeling and right ventricular dysfunction in pulmonary hypertension, enabling early-stage target validation and mechanistic de-risking. Its compatibility with wild-type and genetically modified mice supports pathway interrogation and therapeutic hypothesis testing within a three-week timeframe. This model bridges discovery biology and preclinical evaluation by delivering quantifiable hemodynamic and histological readouts that inform portfolio triage and risk-adjusted decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of VEGF signaling pathways and identification of novel therapeutic targets involved in pulmonary vascular remodeling.
- Operational Value: Supports rapid phenotypic screening of genetic or pharmacological interventions using standardized induction and measurement procedures.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by modeling key histopathological hallmarks of human Group 1 pulmonary hypertension, including medial wall thickening and right ventricular hypertrophy.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable outputs such as right ventricular pressure via catheterization and Fulton index for hypertrophy assessment.
- Operational Value: Delivers reproducible, low-variance measurements when combined with standardized hypoxia exposure and weekly SU5416 dosing.
- Scalability: Enables platform reuse across wild-type and knockout models without requiring surgical expertise, supporting high-throughput target validation campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system that mimics human pulmonary hypertension pathophysiology, allowing evaluation of target engagement and pathway modulation.
- Operational Value: Supports prevention and therapy studies through reversible phenotype upon normoxia return, enabling washout and rechallenge designs.
- Translational Continuity: Connects early discovery to preclinical validation by delivering functional (RV pressure) and structural (vascular remodeling, cardiomyocyte hypertrophy) endpoints aligned with clinical biomarkers.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early target identification, assay validation, and mechanistic de-risking before lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of VEGF-dependent and independent pathways in pulmonary hypertension through inducible, reversible vascular injury.
- Screening: Delivers assay-ready biological systems with standardized induction (10% oxygen, weekly SU5416) and quantifiable outputs (RV pressure, Fulton index, histological thickening).
- Analytics: Provides functional hemodynamics and morphometric readouts that allow cross-group comparison and effect size estimation for target prioritization.
- Translational Research: Offers mechanistic insight into right ventricular adaptation and pulmonary artery remodeling, supporting biomarker-aligned go/no-go decisions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable phenotypic platform for iterative testing of targets across multiple chemogenetic or pharmacological modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by modeling human-relevant vascular and cardiac pathophysiology.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized hypoxia control, injection schedule, and pressure/volume catheterization techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage failure risk by enabling early de-risking of targets based on functional and structural disease modification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by delivering multiparametric data (pressure, hypertrophy, fibrosis) for objective target ranking.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic chamber management, SU5416 handling, and right ventricular catheterization techniques.
- Dependent on precise oxygen control (10%) and access to nitrogen tanks for chamber maintenance.
- Necessitates standardized animal handling and weekly dosing to ensure model consistency across cohorts.
- Limited to mild-to-moderate phenotype severity, which may restrict modeling of advanced disease stages.
- Reversibility upon normoxia return requires careful experimental design for chronic therapy studies.
