Name: Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer hoe je fucosylated human milk oligosaccharides detecteert met een whole-cell biosensor in E. coli. Deze high-throughput methode versnelt kwantificering en karakterisering voor biotechnologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de Iowa State University opstarten middelen. VB. werd gedeeltelijk gefinancierd door de NSF Trinect Fellowship en Manley Hoppe hoogleraarschap. T.J.M. werd gedeeltelijk ondersteund door de Karen en Denny Vaughn faculteit Fellowship. De auteurs danken de Iowa State University Stroom Cytometry faciliteit en het W.M. Keck metabolomica onderzoekslaboratorium voor hulp met fluorescentie en LC-MS studies.

1. cel cultuur en inductie voorwaarden
Opmerking: De volgende experimenten, drie stammen worden gebruikt: E. coli BL21 (DE3) met een lege vector, E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcA14 en pET28:green fluorescente proteïne (GFP) en E. coli BL21 (DE3) met plasmiden pAfcB14 en pET28:GFP. Alle stammen worden gekweekt in Luria Bertani broth (LB) of minimale media met de juiste antibiotica. Bereiden van stamoplossingen van 1.000 x kanamycine (50 mg/mL) en carbenicillin (100 mg/mL) in gedeïoniseerd (DI) water.
<ol><li>
Voorbereiding van de media
	<ol>
<li>Bereiden van LB-media door 25 g van LB poeder voorraad aan 1 L DI water toe te voegen. Autoclaaf de oplossing bij 121 ° C gedurende 20 min te steriliseren. Wacht totdat de gesteriliseerde LB media temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van 1 µL van antibiotica materieel voor elk 1 mL van LB-media is.</li>
		<li>Toevoegen om te bereiden LB platen, 15 g agar tot de LB-media voor sterilisatie. Wacht totdat de gesteriliseerde LB agar temperatuur lager dan 60 ° C vóór toevoeging van de antibiotica is.</li>
		<li>1.1.3 de biosensing cellen, opstellen media of platen met dubbele antibiotica, kanamycine en carbenicillin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Koolhydraten inductoren
	<ol>
<li>Bereiden van stamoplossingen van de koolhydraten inductoren op molaire equivalent van 20 g/L lactose: 29 g/L 2'-FL en 3-FL. Opmerking: Elke 200 µL van cellen vergt 20 µL van 2'-FL of 3-FL.</li>
		<li>Induceren van 200 µL van cellen met 2,0 g/L eindconcentratie van lactose of 2.9 g/L eindconcentratie van 2'-FL/3-FL. Incubate bij 37 ° C met continue schudden en culturen groeien 's nachts laat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Celcultuur
	<ol>
<li>De dag voordat het experiment zaad 5 mL van LB medium aangevuld met kanamycine en carbenicillin uit een vers bacteriële kolonie, met behulp van steriele techniek.</li>
		<li>Incubeer alle culturen bij 37 ° C met agitatie en groeien de culturen 's nachts.</li>
		<li>Breng 50 µL van overnachting cultuur in 5 mL verse LB/M9 media met kanamycine en carbenicillin. Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en groeien tot cultuur heeft bereikt optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van 0,5 – 0,7. In deze fase halverwege log, kunnen de cellen worden opgewekt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. meting van fluorescentie en detectiegrenzen
<ol><li>
Voorbereiding van cellen voor stroom cytometry
	<ol>
<li>De overnachting culturen overbrengen in 1,5 mL tubes en centrifuge op 12.500 x g voor 1 min.</li>
		<li>Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL 1 x-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 6 mM nb2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl in DI water, pH 7,2) voor te bereiden van een eencellige schorsing en overbrengen van een enkele cel schorsing 5 mL stroom cytometry buizen.</li>
		<li>Houd de cellen in het donker bij 4 ° C tot de voorbeelden op een stroom cytometer uitvoeren. Voor het beste resultaat door de cellen zo spoedig mogelijk te analyseren.</li>
		<li>Selecteer 488 nm laser te prikkelen GFP. Verzamelen fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) fluorescentie niveaus (20.000-40.000 evenementen, gated voor voorwaartse en zijdelingse scatter om te voorkomen dat de samengevoegde cellen en puin) met een 525/50 nm bandfilter filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kalibreren van de biosensor
	<ol>
<li>Om een ijklijn, 8 – 10 verdunningen van het standaard 2'-FL te maken in het bereik 0-2.500 mg/L.</li>
		<li>Cultuur van de 2'-FL biosensing cellen (met pAfcA en pET28:GFP) en veroorzaken ze met de standaard verdunningen, zoals eerder is beschreven in punt 1.3. Uitvoeren van drie biologische herhaling voor elke verdunning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. opsporing en kwantificering van 2'-FL bij een producent stam
<ol><li>
Teelt van producent stam
	<ol>
<li>Voor het maken van minimale media, bereiden aparte oplossingen van 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natriumcitraat en 1 M thiamine-HCl. Steriliseer de oplossingen met behulp van een 0,22 µm filter. M9 media Bouillon poeder mengen met 1 L DI water. Autoclaaf de M9 oplossing bij 121 ° C gedurende 15 min. koel de oplossing tot 50 ° C. Voeg MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, Natriumcitraat, en thiamine aan de eindconcentraties van 2 mM, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L en 7,5 µg/L, respectievelijk.</li>
		<li>Een cultuur van 2'-FL stam, bijvoorbeeld, JM109 gwBC-F2, 5 ml van LB-media produceren en laten groeien 's nachts bij 37 ° C, zoals beschreven in Baumgartner et al.12starten</li>
		<li>Subcultuur op 1% zoals eerder in stap 1.3.3 in 250 mL van de minimale media bereid in stap 3.1.1 beschreven. Glycerol toevoegen om een eindconcentratie van 10 g/L en Incubeer de cultuur bij 37 ° C.</li>
		<li>Wanneer de cultuur een OD600 van 0,5 – 0,7 bereikt, isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toevoegen om een eindconcentratie van 0.5 mM en lactose aan een definitieve concentratie van 2 g/L.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C met continue schudden en laat culturen groeien gedurende 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Extractie van 2'-FL
	<ol>
<li>De overnachting culturen overbrengen in steriele 50 mL tubes en centrifuge op 900 x g gedurende 15 minuten.</li>
		<li>3.2.2 Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet in DI water. Herhaal de stap van wassen drie keer te verwijderen van de resterende lactose en ten slotte resuspendeer in 5 mL DI water.</li>
		<li>Gebruik een ultrasoonapparaat op kracht van 30%, in 30 s pulsen om de celsuspensie lyse. Houd de cellen op het ijs te allen tijde.</li>
		<li>De lysed cellen voor 25 min op 2.000 x gcentrifugeren. Verwijder het supernatant, passeren het een steriele (b.v. 0,22 µm) filteren en op te slaan bij 4 ° C tot analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kwantificering met biosensor
	<ol>
<li>Enten van een cultuur van 2'-FL biosensing cellen en op mid log fase, induceren met cel lysate gelijkwaardig zijn aan de geschatte concentraties van 2'-FL gebruikt om de kalibratiecurve zoals beschreven in paragraaf 2.2. De kalibratie uit te voeren in de zelfde omgeving als het monster te worden geanalyseerd (bijvoorbeeld cel lysate) door toevoeging van verdunningen van 2'-FL aan controle (dat wil zeggen, niet-producerende) gefilterde cel lysate voordat inducerende biosensor cellen.</li>
		<li>De monsters worden uitgevoerd op een cytometer van de stroom. Een dosis-responscurve genereren door het uitzetten van de fluorescentie output tegen de oligosaccharide concentratie. Vergelijk de reactie van de normen op de cel lysate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. selectieve verwijdering van lactose
Opmerking: De biosensing cellen zijn gevoelig voor lactose en het is wenselijk dat de biosensor selectief detecteren zorgorganisaties over lactose. Een strategie zou wassen van cellen bevatten, zoals beschreven in paragraaf 3.2. Drie andere strategieën worden hieronder beschreven.
<ol><li>
Behandeling met commerciële gezuiverde β-galactosidase
	<ol>
<li>Ontbinden gelyofiliseerd β-galactosidase tot 1000 (FCC lactase) eenheden/mL, in 1 mM MgCl2 of gebruik commerciële β-galactosidase in oplossing.</li>
		<li>Om te bepalen van de optimale concentratie van enzym nodig, een entmateriaal van 2'-FL biosensing cellen groeien en veroorzaken met 2 g/L lactose en 2.9 g / L 2'-FL in mid log fase.</li>
		<li>100 µL culturen, voeg van variërende hoeveelheden β-galactosidase, maximaal 12 eenheden, en laat de culturen groeien 's nachts bij 37 ° C met continue schudden.</li>
		<li>Meten van de fluorescentie, zoals beschreven in paragraaf 2.1 en bereken de optimale eenheden van enzym die nodig zijn door de bepaling van de concentratie van de minimale enzym om gewenste demping van signaal.</li>
		<li>Naar 2'-FL producerende cellen gekweekt voor 24u, optimale units van β-galactosidase toevoegen en na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Ga verder met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbehandeling met LacZ + stam
	<ol>
<li>Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer de cultuur bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Enten van een BL21 E. coli (DE3) cultuur in LB, het groeien tot halverwege log fase bij 37 ° C en voeg 50 mL van de cultuur (2:1) aan de cultuur van de 24 h.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 3 h. doorgaan met het protocol voor het bepalen van de titer van de 2'-FL zoals beschreven in punt 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lactose precipitatie met ethanol Opmerking: Deze sectie is aangepast van Matsuki et al.12.<ol>
<li>Start een 25 mL cultuur van 2'-FL produceren stam en zodra geïnduceerde in Mid log fase, Incubeer bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Voeg twee volumes van 100% ethanol tot de cultuur, goed schudden en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 uur.</li>
		<li>Centrifugeer de schorsing bij 900 x g gedurende 15 min. verzamelen het supernatant en na een nacht bebroeden bij 4 ° C, die de lactose precipitaten.</li>
		<li>Verwijder de geprecipiteerde lactose door het passeren van de oplossing door een filtreerpapier (11 µm). Vang het filtraat op die de cel lysate met de 2'-FL, die kan worden gekwantificeerd door volgende punt 3.3.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li>
<li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry%3A+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li>
<li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li>
<li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li>
<li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis%3A+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li>
<li>Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+9-Aminopyrene-1%2C4%2C6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li>
<li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+%28Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li>
<li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).</li>
<li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+%28HMOs%29+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li>
<li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2%E2%80%99-fucosyllactose%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939(2016).</li>
<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We presenteren een high-throughput strategie voor de koppeling-specifieke detectie van fucosylated menselijke melk oligosacchariden. Dit werd bereikt door het bouwen van hele cel biosensoren door genetisch engineering E. coli die na inductie met specifieke glycanen reageren met een fluorescerende signaal. Het protocol is ook van details over hoe de biosensor kan worden gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een metabolisch gemanipuleerde bacteriële stam.
<p class="jove_content"...

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn lactose-afgeleide oligosacharide, meestal bestaande uit drie tot acht suiker monomeren. Ze hebben een lactose (Gal-β1, 4-Glc) verminderen beëindigen en verder door glycosidic links zijn langwerpig (β-1,3 - of β-1,6-) glucose (Glc), galactose (Gal) of N-acetylglucosamine (GlcNAc). Daarnaast fucose (Fuc, α-1,2 - of α-1,3-) of sialic zuur (Sia of NeuAc, α-2,3 - of α-2,6-) residuen worden vaak toegevoegd1.
Huidige analyse van de oligosacchariden en andere koolhydraten in doorvoer en reikwijdte begrensd door de behoefte aan spectrometrische chromatografische/massa (MS) technologie2,3,4,5, 6 , 7, dat ongeveer duren kan een uur per monster, niet te vergeten de noodzaak voor dure apparatuur, gespecialiseerde kolommen en Derivatiserings agenten en expertise over de werking van deze apparatuur8. Oligosaccharide verbanden zijn bijzonder moeilijk te bepalen, waarvoor geavanceerde MS9,10 of11technieken nucleaire magnetische resonantie (NMR). Snelle optimalisatie van synthese van deze oligosachariden is dus beperkt door de doorvoer van deze trage analytische stap.
In deze studie, tonen we koppeling-specifieke detectie van fucosylated trisaccharide lactose gebaseerde zorgorganisaties, gericht op 2'-fucosyllactose (2'-FL) thats de overvloedigste HMO in menselijke melk, met behulp van een genetisch gecodeerde Escherichia coli hele cel biosensor met een limiet van detectie op 4 mg/L. Een belangrijk kenmerk van deze biosensor is haar vermogen om te onderscheiden tussen isomere trisacharide. De ontwerpprincipe is gebaseerd op de expressie van specifieke fucosidases in E. coli die bevrijden lactose van zorgorganisaties, waarvan de aanwezigheid wordt gedetecteerd door het lac -operon, die op zijn beurt een fluorescent signaal genereert. Dit bereiken we door het bouwen van een twee-plasmide-systeem, een herbergen de koppelings-specifieke fucosidase en anderzijds een fluorescerende verslaggever eiwit. Dit platform biosensor is geschikt voor high-throughput screening door stroom cytometry of micro-afleesapparaat. We tonen ook het gebruik van de biosensor in 2'-FL geproduceerd door een gemanipuleerde stam12te kwantificeren. Binnen deze studie presenteren we ook drie strategieën op selectieve verwijdering van lactose die leiden valse positieve signaal van de biosensor tot kan, gezien het feit dat de gemanipuleerde producent stam wordt verbouwd op lactose.
Samen genomen, de genetisch gecodeerde biosensoren laten detecteren en kwantificeren van zorgorganisaties in een koppeling-specifieke wijze, die moeilijk zelfs met is chromatografische, MS of NMR technieken. Vanwege de hoge doorvoer en gebruiksgemak moet deze methode wijdverbreide toepassingen in de metabole engineering en synthese van zorgorganisaties.

<table><tbody><tr><td>2&rsquo;-Fucosyllactose&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-Fucosyllactose&nbsp;</td><td>Carbosynth&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (D-Glucose), Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>1100 Series HPLC systeem</td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 omgekeerde fase kolom</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>11815024</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth, Miller&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Lactose</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimal Salts, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate, Anhydrous</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Mass Selectieve Trap SL detector</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

Menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) zijn onderdelen van de complexe koolhydraten van menselijke moedermelk die overvloedig voordelen op de gezondheid van de baby vertonen. Optimalisatie van hun biotechnologische synthese wordt echter beperkt door de relatief lage doorvoer van detectie en kwantificering van monosaccharide en verbanden. Conventionele technieken van glycan analyse omvatten chromatografische/Massaspectrometrische methoden met doorvoer over de volgorde van honderden monsters per dag zonder automatisering. Wij tonen hier, een genetisch gecodeerde bacteriële biosensor voor de high-throughput, koppelings-specifieke detectie en kwantificering van de fucosylated HMO structuren, 2'-fucosyllactose en 3-fucosyllactose, die we via heterologe bereikt expressie van fucosidases. Als de aanwezigheid van lactose in melk of in biotechnologische processen tot valse positieven leiden kan, tonen we ook de vermindering van signaal uit lactose met behulp van verschillende strategieën. Vanwege de hoge doorvoer van deze techniek, kunnen veel reactie voorwaarden of bioreactor parameters vehiculumcontrolegroep worden parallel in een kwestie van uren, waardoor voor de optimalisatie van de HMO verwerkende industrie.

We ontwierpen een hele cel biosensor specifiek voor 2'-FL die kan worden gebruikt in combinatie met de biotechnologische productie van de oligosaccharide. Dit is gebaseerd op de specifieke enzymatische splitsing van wijzigen terminal suikers genereren van lactose en daarmee activering van het lac -operon, leidt tot expressie van een verslaggever fluorescent proteïne onder een lactose afleidbare promotor, in verhouding staan tot de hoeveelheid 2'-FL. Om aan te tonen van de specifi...

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van een aantal belangrijke vragen die betrokken zijn bij de productie van menselijke melk oligosaccharides. Ten eerste, hoeveel van het product heb ik? En ten tweede, wat is de specifieke koolhydraat koppeling?Het doel hier is om het proces van kwantificeren en karakteriseren van deze menselijke melk oligosadariden te vereenvoudigen en te versnellen. Deze methode heeft twee voordelen ten opzichte van de huidige stand van de techniek. Ten eerste is het vatbaar voor high-throughput screening.Dus, je je voorstellen dat je duizenden verschillende omstandigheden test of misschien zelfs een bibliotheek van syntheseenzymen in één dag met behulp van deze techniek. Ook maakt het gebruik van de unieke substraat specificiteit die de natuur heeft ontwikkeld in enzymen om ons informatie over de koolhydraat koppeling van die oligosadariden. Wij geloven dat deze methode de productie van menselijke melk oligosaccharides kan verbeteren, wat op zijn beurt kan leiden tot een betere kwaliteit zuigelingenvoeding die menselijke moedermelk beter nabootst en helpt de kloof tussen borstvoeding en formulegevoede baby's te dichten.De discretie van de gebruiker wor

analysis-fucosylated-human-milk-trisaccharides-biotechnological

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In deze studie beschrijven we een verbeterde protocol een gemultiplexte high-throughput antilichaam microarray met lectine detectiemethode die gebruikt kan worden in de glycosylering profilering van specifieke eiwitten. Dit protocol is voorzien van nieuwe betrouwbare reagentia en vermindert de tijd, kosten en lab-apparatuur eisen ten opzichte van de vorige procedure.

Chemisch-geblokkeerde Antilichaam Microarray voor multiplexverzending High-throughput Profilering van specifiek eiwit glycosylering in Complex Samples

Begin with a bacterial biosensor culture suspended in a medium.These engineered bacteria produce a transcription factor that, upon binding to a specific fecal metabolite, activates a promoter associated with a fluorescent reporter gene.To this culture, add a filtered human fecal sample containing metabolites, such as lactate, that are involved in host-microbiome interactions.Dilute this mixture with a fresh medium to maintain an optimal reaction volume.Incubate without shaking to mimic the...

Detection of Human Fecal Metabolites Using a Bacterial Biosensor

Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.

FIBS-enabled Noninvasive metabole

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Dit protocol beschrijft een snelle en gevoelige kwantificatie van Förster resonantie energieoverdracht (FRET) sensorgegevens met een maat draagbare FRET analyzer. De inrichting werd gebruikt voor maltose binnen een kritisch temperatuurtraject dat detectiegevoeligheid maximaliseert, zodat praktische en efficiënte evaluatie van het suikergehalte detecteren.

Uiterst gevoelige en Rapid fluorescentiedetectie met een Portable FRET Analyzer

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Een gedetailleerd protocol voor de zuivering en daaropvolgende analyse van een monoklonaal antilichaam uit geoogste celkweek vloeistof (HCCF) van geautomatiseerde microbioreactoren is beschreven. Het gebruik van analyses om kritische kwaliteitskenmerken (CQAs) te bepalen en beperkt sample volume te maximaliseren om vitale informatie te extraheren wordt ook gepresenteerd.

Zuivering en analyse van een monoklonaal antilichaam van Chinese Hamster Ovariumcellen met behulp van een geautomatiseerd Microbioreactor systeem

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer hoe je fucosylated human milk oligosaccharides detecteert met een whole-cell biosensor in E. coli. Deze high-throughput methode versnelt kwantificering en karakterisering voor biotechnologisch onderzoek.

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Meer video's verkennen