Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Dit protocol schetst een eenvoudige voorbereiding voor afm-beeldvorming van extracellulaire vikjes in gehydrateerde en uitgedroogde vormen, hun elektrostatische immobilisatie, oppervlaktescanning, vesicale identificatie en gegevensanalyse en -interpretatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de handige elektrostatische fixatie van vesicles op het huidoppervlak en de post-imaging analyse om rekening te houden met vormvervorming veroorzaakt door immobilisatie. De verkregen vesicles dimensionering resultaten komen overeen met de Gold Standard CryoTEM Imaging die blijft dure en uitdagende techniek.

Als u een nieuwe AFM-gebruiker bent, begint u met de karakterisering van droge monsters voordat u overgaat tot gehydrateerde monsters. Omdat er tal van extra factoren die van invloed kunnen zijn gehydrateerde monster verwerving. Om te beginnen isoleer extracellulaire vikjes van een biovloeistof zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.

Bevestig vervolgens stevig een micaschijf aan een magnetische roestvrijstalen monsterschijf. Maak de micaschijf met behulp van een scherp scheermes om een nieuwe laag materiaal bloot te leggen. Behandel het bovenste oppervlak van mica tien seconden met honderd microliter van een tien millimolar nikkel II chlorideoplossing.

Dit wijzigt de lading van het oppervlak van negatief naar positief. Dep de nikkel II chlorideoplossing met een pluisvrij doekje of blottingpapier. Was vervolgens het micaoppervlak drie keer met gedeïsized water en droog het met een stroom droge stikstof.

Plaats de AFM-monsterschijf met het bijgevoegde oppervlak gemodificeerde mica in een petrischaal. Verdun vervolgens de exosomen met PBS om een concentratie te verkrijgen tussen de vier en veertig miljard deeltjes per milliliter oplossing. Valideer de verdunde deeltjesconcentratie met behulp van nanodeeltjes tracking analyse.

Vorm een sessile druppel op het oppervlak van de mica door het legen van honderd microliter van de verdunde exosoom oplossing van een pipet. Plaats vervolgens het deksel op de petrischaal en verzegel het met parafenfilm om monsterverdamping te verminderen. Broed je twaalf uur in de koelkast.

Na incubatie, 80 tot 90 procent van het monster zorgvuldig aanzuigen zonder het oppervlak te verstoren. Op dit punt worden de exosomen elektrotisch geïmmobiliseerd op het mica-substraat. Bij beeldvorming gehydrateerde monsters, spoel het oppervlak drie keer met PBS.

Zorg ervoor dat het monster gehydrateerd te houden tijdens het spoelproces. Na het wassen van het micaoppervlak met PBS, verwijder 80 tot 90 procent van de vloeistof en pipette veertig microliters van verse PBS om het monster te dekken. Het gehydrateerde monster is klaar voor beeldvorming.

Bij het beeldvorming van de uitgedroogde EV's, verwijder de zouten van het oppervlak door het spoelen van het substraat drie keer met gedeïsized water. Na het aspirating zoveel mogelijk vloeistof, zonder het oppervlak aan te raken, droog de rest met een stroom van droge stikstof. Als u de uitgedroogde extracellulaire vieltjes wiltafbeeldingen, selecteert u een cantilever die is ontworpen voor het scannen in de lucht in tikkende en contactloze beeldvormende modi en monteer deze op de sondehouder.

Plaats het monster op het AFM-podium. De magnetische roestvrijstalen monsterschijf zal het monster op het podium immobiliseren. Plaats de sondehouder in de AFM.

Laat de tijd voor de voorbereiding en het podium thermisch teeven. Gebruik de tikmodus om een gebied te scannen dat 5x5 micron is gerasterd in 512-lijnen met een scansnelheid van één hertz. Verwerf zowel de hoogte- als faseafbeeldingen, omdat ze gratis informatie geven over de topografie en de oppervlakte-eigenschappen van het monster.

De scantijd neemt toe met een afgebeeld gebied en het aantal lijnen dat is geselecteerd om de afbeelding te vormen, maar neemt af met de scansnelheid. Aangezien snelle scansnelheden van invloed kunnen zijn op de beeldkwaliteit, moet de snelheid van rasteren een evenwicht zijn tussen de aanschaftijd en de beeldkwaliteit. Als u gehydrateerde akeltjes wiltafbeeldingen, selecteert u een cantilever die geschikt is voor het scannen van zachte, gehydrateerde monsters en monteer u de cantilever op een sondehouder die is ontworpen voor het scannen in vloeistoffen.

Maak de punt van de cantilever nat met PBS om de kans op het introduceren van luchtbellen in de vloeistof tijdens het scannen te verminderen. Immobiliseer het monster vervolgens op het AFM-podium. Zodra het monster thermisch in evenwicht is, beeldt u het gehydrateerde micaoppervlak in de tikmodus.

Verkrijg zowel de hoogte- als faseafbeeldingen. Als u de genomen afbeeldingen wilt analyseren, gaat u eerst naar de geselecteerde SPM-modi van het gegevensproces, gevolgd door Tip'en kies Modeltip'Selecteer de geometrie en de afmetingen van de tip die wordt gebruikt om het monster te scannen en klik op OK'Corrigeer de artefacten van de tiperosie door de oppervlaktereconstructie uit te voeren. Open de afbeelding.

Selecteer in het menu Gegevensproces en selecteer vervolgens SPM-modi', gevolgd door Tip' en kies vervolgens Surface Reconstruction'en klik op OK'Next, selecteer Gegevensproces, gevolgd door Niveau'en kies Vlakniveau'om het beeldvlak uit te lijnen en het XY-vlak van het laboratorium af te stemmen door de kanteling in het substraat uit de scangegevens te verwijderen. Lijn rijen in de afbeelding uit door Gegevensproces'gevolgd door Correcte gegevens' te selecteren en kies vervolgens Rijen uitlijnen'Er zijn verschillende uitlijningsopties beschikbaar, waaronder mediaan, een algoritme dat een gemiddelde hoogte van elke scanregel vindt en aftrek van de gegevens. Ga vervolgens naar Gegevensproces'gevolgd door Correcte gegevens'en kies Littekens verwijderen'Dit verwijdert veelvoorkomende scanfouten die bekend staan als Scars'Als u het mica-oppervlak op nulhoogte wilt uitlijnen, gaat u naar het menu Gegevensproces en selecteert u Base afvlakken in het vervolgkeuzemenu Niveau.

Identificeer de extra cellulaire azingjes op het gescande oppervlak door naar het menu van de korrels te gaan en Mark by Threshold'Dit algoritme identificeert oppervlaktegeïmmobiliseerde exosomen als deeltjes die uit het nuloppervlakteubstraat uitsteken door de hoogte boven de door de gebruiker geselecteerde drempelwaarde. Selecteer een drempelwaarde in het bereik tussen één en drie nanometer. Dit elimineert het grootste deel van de achtergrond interferentie.

Ten slotte voert u geometrische en dimensionale karakterisering van de geïdentificeerde vikjes uit met behulp van de beschikbare distributiealgoritmen die toegankelijk zijn via het menu Korrels. Exporteer de AFM-gegevens van Gwyddion voor gespecialiseerde analyse door andere rekentools en aangepaste computerprogramma's. De wijziging van het nikkelchlorideoppervlak resulteert in een immobilisatie van extra cellulaire akelige akelige die tijdsafhankelijk is.

De oppervlakteconcentratie van de geïmmobiliseerde adereilanden is te dicht na 24 uur incubatie, terwijl de 12-uurs incubatie leidt tot minder exosomen en scangegevens die gemakkelijker nauwkeurig te analyseren zijn. Dit AFM-beeld toont gehydrateerde MCF7 exosomen elektrostatisch geïmmobiliseerd op het gemodificeerde mica-oppervlak. Het bijbehorende AFM-fasebeeld bevestigt dat de korrels in het hoogtebeeld zachte nanodeeltjes zijn, zoals verwacht voor membraanveikels.

De hoogtegegevens voor drie vesicles langs dezelfde lijn worden hier weergegeven. Deze profielen illustreren een afgeplatte vorm veroorzaakt door de elektrostatische aantrekkingskracht van exosomen op het positief laadoppervlak van de gemodificeerde mica. De vormvervorming is zichtbaar in een vergroot beeld van de geïmmobiliseerde blaas en de dwarsdoorsnede.

Om de bolvormige grootte van de exosomen in de oplossing te schatten, kan het overeenkomen met de volumes die zijn ingesloten door oppervlaktegeïmmobiliseerde en bolvormige membraanenveloppen. De grootteverdeling van bolvormige vikjes in de oplossing werd bepaald aan de hand van de AFM-gegevens van 561 geïmmobiliseerde vesikels. De vesicle maten in CryoTEM beelden komen overeen met de AFM resultaten.

Voordat de hyrdrated exosomen worden gebeeldhed, is het belangrijk om te onthouden om het oppervlak grondig af te spoelen met PBS. Hierdoor worden inkomende exosomen verwijderd en wordt voorkomen dat ze gehecht zijn aan de AFM-tip. Bij het beeldvorming van de uitgedroogde exosomen, moet u DI-water gebruiken om het substraat te laten stijgen.

De DI-was voorkomt de vorming van zoutkristallen op het oppervlak als het substraat droogt. Indien aanwezig, zal zoutkristallen beeldverwerking een moeilijke taak maken.