Name: Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Leer een labelvrije AFM-imagingmethode voor extracellulaire vesikels met elektrostatische immobilisatie op gemodificeerd mica. Deze techniek levert consistente groottebepalingen en is geschikt voor beginnende en ervaren gebruikers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen financiële steun van de National Science Foundation (Award Number IGERT-0903715), de Universiteit van Utah (afdeling Chemical Engineering Seed Grant en de Graduate Research Fellowship Award), en Skolkovo Institute of Science en technologie (Skoltech Fellowship).

1. isolatie van EVs uit een biovloeistof
<ol><li>Isoleer EVs door een van de vastgestelde methoden, zoals de differentiële ultracentrifugatie8, precipitatie of grootte-uitsluitings chromatografie9.</li>
	<li>Bevestig de aanwezigheid van de verwachte oppervlakte-en Luminale biomarkers en de afwezigheid van biomarkers die kruisbesmetting van het preparaat aangeven. Bevestig de morfologie van de lipide-dubbelgelaagde van de geïsoleerde deeltjes met elektronenmicroscopie. Opmerking: bij het isoleren van de exosomen moet de hydrodynamische grootteverdeling, gemeten door nanodeeltjes-traceer analyse (NTA) of Dynamische lichtverstrooiing, in het verwachte bereik liggen. De details van EV en exosome isolatie vallen buiten het bestek van dit protocol. De gekozen methode zal afhangen van experimentele vragen en het doel van de studie10. De volgende stappen geven een concrete illustratie van de procedure om de exosomen te verrijken door precipitatie uit het groeimedium van MCF-7 borstkankercellen met behulp van een in de handel verkrijgbare neerslag Kit (tabel met materialen).</li>
	<li>Voor celkweek uitbreiding, bewaar MCF-7 borstkankercellen in vloeibare stikstof. Cellen ontdooien tot subcultuur.</li>
	<li>Na aseptische praktijken, uitvoeren van celplating op 150 mm platen. Gebruik het groeimedium bestaande uit de Eagle's minimale essentiële medium, 0,01 mg/ml humane recombinant insuline, en 10% exosome-vrij foetaal runderserum.</li>
	<li>Beluate de kweek met 95% lucht en 5% CO2 en inbroed bij 37 °C.</li>
	<li>Nadat de cellen zijn afgewikkeld (ongeveer 24 h na het beplating), verander de media. Splits de plaat met een verhouding van 1:10 en kweek tien platen, elk met 20 mL media.</li>
	<li>Oogst en pool media van 9 van deze platen (180 mL) bij ~ 70−80% samenloop wanneer cellen zich nog in de groeifase bevinden.</li>
	<li>Verdeel de media in 60 mL en 120 mL, verder opgesplitst in 30 mL/buis en centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Breng de supernatant van elke buis over naar een nieuwe steriele 50 mL Tube en voer de exosome isolatie uit.</li>
	<li>Isoleer exosomen door neerslag volgens gepubliceerde protocollen (zie bijvoorbeeld referentie11) of volg de instructies van defabrikant alser een commerciële isolatie kit (tabel met materialen) wordt gebruikt. Als eerste stap in het laatste geval, centrifuge Cell medium bij 3.000 x g gedurende 15 min. Zuig de supernatant op en gooi cellen en celresten weg.</li>
	<li>Voeg de precipitatie oplossing (1:5 volume verhouding) toe aan de supernatant, meng en koel de koeling 's nachts.</li>
	<li>Centrifugeer op 1.500 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant na het centrifugeren weg.</li>
	<li>Draai de overblijvende exosome pellet nog eens 5 min bij 1.500 x g. Zonder de pellet te verstoren, verwijder de resterende neerslag oplossing door aspiratie.</li>
	<li>Respendeer de pellet in 100−500 μL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer en verdeel in meerdere aliquots naar behoefte voor de downstream analyse.</li>
	<li>Onmiddellijk overgaan tot het oppervlak immobilisatie van de geïsoleerde exosomen voor AFM beeldvorming. Indien nodig, Vries de aliquots op-80 °C voor later gebruik tijdens het nemen van voorzorgsmaatregelen om beschadiging van het monster tijdens de Vries-ontdooien cyclus te voorkomen.</li>
</ol>2. oppervlakte fixatie van extracellulaire blaasjes
<ol><li>Gebruik sterke dubbelzijdige tape, epoxy of een alternatieve lijm om een mica-schijf stevig aan een AFM/scanning tunneling microscoop (STM) magnetische roestvrijstalen specimen schijf te bevestigen.</li>
	<li>Cleave mica disc met behulp van een scherp scheermesje of een mes, of door een plakband aan het bovenoppervlak te bevestigen en vervolgens af te maken om een laag materiaal te verwijderen. Opmerking: beide methoden moeten een maagdelijk oppervlak onthullen door een dun laagje mica te verwijderen dat eerder aan de omgeving is blootgesteld. Na de ingreep moet de bevestiging van mica aan de AFM/STM metaal preparaat schijf stevig blijven.</li>
	<li>Behandel bij kamertemperatuur het bovenste oppervlak van mica voor 10 s met 100 μL van 10 mM NiCl2 -oplossing, die de oppervlakte lading wijzigt van negatief naar positief.</li>
	<li>DEP NiCl2 oplossing met een pluisvrij veeg-of blotting papier. Was het mica-oppervlak 3x met gedeïoniseerd (DI) water en droog het met een stroom droge stikstof. Opmerking: het is een goede gewoonte om het gemodificeerde oppervlak met de AFM te scannen om te bevestigen dat het vrij is van verontreinigingen.</li>
	<li>Plaats de AFM-preparaat schijf met het daaraan gehechte oppervlakte gemodificeerde mica in een petrischaaltje.</li>
	<li>Verdun het exosome monster van stap 1,14 met 1x PBS om een concentratie te verkrijgen tussen 4,0 x 109 en 4,0 x 1010 deeltjes per ml oplossing. Valideer de verdunde DEELTJESCONCENTRATIE met NTA.</li>
	<li>Vorm een Sessile druppel op het oppervlak van mica door 100 μL van de verdunde exosome oplossing uit een pipet te legen.</li>
	<li>Plaats het deksel op de petrischaal en verzegel het met een paraffine folie om de verdamping van het monster te verminderen. Inbroed het monster voor 12−18 uur bij 4 °C. Opmerking: de oppervlaktedichtheid van de geïmmobiliseerde exosomen zal toenemen met de incubatietijd en de concentratie van EVs in de vloeistof. Een langere incubatietijd kan nodig zijn als exosomen in het monster bij lagere concentraties aanwezig zijn.</li>
	<li>Na incubatie, aspiraat 80−90% van het monster zonder het oppervlak te verstoren. Op dit punt zullen de exosomen elektrostatisch worden geïmmobiliseerd op het mica substraat.</li>
	<li>Spoel het oppervlak af met 1x PBS voordat u een gehydrateerde EVs Imaging. Herhaal 3x. Zorg ervoor dat het monster gehydrateerd blijft gedurende het spoelproces.</li>
	<li>Na het wassen van het mica-oppervlak met 1x PBS, verwijdert u 80%−90% van de vloeistof en Pipetteer ~ 40 μL verse 1x PBS om het monster te bedekken.</li>
	<li>Bij het beeldvorming van de gedroogde EVs, spoel het substraat met DI water. Herhaal 3x. Opmerking: spoelen met DI water voorkomt de vorming van zoutkristallen en de afzetting van opgeloste stoffen op het oppervlak als het substraat droogt.</li>
	<li>Vóór het beeldvormende gedroogde EVs, zuig zoveel mogelijk vloeistof op zonder het oppervlak aan te raken en de rest te drogen met een stroom droge stikstof.</li>
</ol>3. AFM-beeldvorming
<ol><li>Om de gedroogde EVs te kunnen afbeellen, selecteert u een Cantilever die is ontworpen voor het scannen in de lucht in de te tikken en contactloze beeldvormings modi en Monteer deze op de sonde houder. Opmerking: de kenmerken van een voorbeeld Cantilever vermeld in de tabel van materialen (123 μm lengte, 40 μm breedte, 7 nm punt straal en 37 N/m veerconstante) kunnen worden gebruikt als een leidraad bij het selecteren van een sonde die compatibel is met de BESCHIKbare AFM-instrumentatie.<ol>
<li>Plaats de bereiding vanaf stap 2,13 op het podium van AFM. De magnetische roestvrijstalen specimen schijf zal het monster op het podium immobiliseren. Tijd voor de bereiding en het podium om thermisch te equilibreren.</li>
		<li>Gebruik de tapmodus om een voldoende groot gedeelte van het oppervlak vande mica tescannen. Kies bijvoorbeeld een gebied van 5 x 5 μm, in 512-lijnen met een scansnelheid van ~ 1 Hz. Verkrijg zowel de hoogte-als de fase-installatiekopieën als ze aanvullende informatie over de topografie en de oppervlakte-eigenschappen van het monster bieden. Opmerking: de scantijd wordt verhoogd met het afbeeldingsgebied en het aantal regels dat is geselecteerd om de afbeelding te vormen, maar neemt af met de scansnelheid die is gedefinieerd als het aantal regels dat per seconde is gescand. Snelle scansnelheden kunnen van invloed zijn op de beeldkwaliteit. Daarom moet de snelheid van het rastering de afweging tussen de aanschaf tijd en de beeldkwaliteit in evenwicht brengen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor het beeld gehydrateerd blaasjes, selecteer een Cantilever geschikt voor het scannen van zachte, gehydrateerde monsters en monteer de cantilever op een sonde houder ontworpen voor het scannen in vloeistoffen. Opmerking: bij het selecteren van een sonde die compatibel is met de beschikbare AFM-instrumentatie, worden de specificaties van de sonde vermeld in de tabel met materialen (driehoekige Cantilever met 175 μm nominale lengte, 22 μm breedte, 20 nm punt straal, 0,07 N/m veerconstante, en geoptimaliseerd voorbeeld vorming met de aandrijf frequentie in het bereik van 4 tot 8 kHz) kan als leidraad worden gebruikt.<ol>
<li>Bevochtig de punt van de cantilever met 1x PBS om de kans op het inbrengen van luchtbellen in de vloeistof te verminderen tijdens het scannen.</li>
		<li>Plaats de bereiding vanaf stap 2,11 op het podium van AFM. De magnetische roestvrijstalen specimen schijf immobiliseren de bijgevoegde mica met geïmmobiliseerde EVs op het oppervlak.</li>
		<li>Tijd voor de bereiding en de AFM fase om thermisch te equilibreren.</li>
		<li>Afbeelding van het gehydrateerde mica-oppervlak in de tapmodus. Verkrijg zowel de hoogte-als de fase-installatiekopieën. Opmerking: de beeldkwaliteit wordt beïnvloed door de instrumentatie, de geselecteerde sonde en Scanparameters. Bij het optimaliseren van de scan condities kunnen de volgende keuzes worden gebruikt als uitgangspunt: 5 x 5 μm gebied gescand in 512 lijnen met ~ 0.8-1.0 Hz scan rate en aandrijf frequentie tussen 4 en 8 kHz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. beeldanalyse
Opmerking: de volgende gegevensverwerkings-en analysestappen worden toegepast op de verworven hoogte beelden. Een soortgelijke procedure kan worden aangepast om de fase gegevens te analyseren. De beschrijving hieronder is specifiek voor gwyddion12, een gratis en open source software beschikbaar onder GNU General Public License. Vergelijkbare mogelijkheden zijn beschikbaar in alternatieve software tools.
<ol><li>Ga naar Data proces, SPM modes, Tip en kies model Tip (Figuur 2). Selecteer de geometrie en de afmetingen van de tip die wordt gebruikt om het voorbeeld te scannen en klik op OK.</li>
	<li>Corrigeer de punt erosie-artefacten door de oppervlakte reconstructie uit te voeren. Open de afbeelding. Selecteer in het menu gegevens proces, SPM-modi, Tip, kies vervolgens oppervlakte reconstructie en klik op OK (afbeelding 3).</li>
	<li>Lijn het Imaging vlak uit zodat het overeenkomt met het laboratorium XY-vlak door de kanteling van de ondergrond te verwijderen uit de scangegevens. Als u deze taak wilt uitvoeren, selecteert u gegevens proces, niveau en kiest u vlak niveau (Figuur 4).</li>
	<li>Lijn de rijen van de afbeelding uit door gegevens proceste selecteren, gegevens te corrigeren en vervolgens rijen uitlijnente kiezen. Er zijn verschillende uitlijningsopties beschikbaar (Figuur 5). Mediaan is bijvoorbeeld een algoritme dat een gemiddelde hoogte van elke scanlijn vindt en deze van de gegevens aftrekt.</li>
	<li>Ga naar gegevens proces, Corrigeer gegevens en kies littekens verwijderen (Figuur 6), waarmee veelvoorkomende scan fouten die littekens worden genoemd, worden verwijderd.</li>
	<li>Lijn het mica-oppervlak uit op de nulhoogte, Z = 0, door basis niveau in het dropdown-menu vlak te selecteren dat toegankelijk is vanuit het gegevens proces (afbeelding 7).</li>
	<li>Identificeer EVs op het gescande oppervlak met behulp van Mark by Threshold in korrels drop-down menu (figuur 8a). Dit algoritme identificeert oppervlakte-geïmmobiliseerde exosomen als deeltjes uitsteekt van de Zero-oppervlakte substraat door de hoogte boven de door de gebruiker geselecteerde drempel. Selecteer een drempelwaarde in het bereik tussen 1 en 3 nm, waardoor de meeste achtergrond interferentie wordt geëlimineerd. Kleinere drempels worden gebruikt met schonere achtergrond. Opmerking: de drempelwaarde in figuur 8a is 1,767 nm. De uitkomst van de MCF-7 exosome identificatie met deze drempel is weergegeven in figuur 8b. Gwyddion biedt verschillende alternatieven voor drempelmethode als het algoritme voor het automatisch identificeren van blaasjes in de afbeelding, met inbegrip van geautomatiseerde drempel (methode van Otsu), randdetectie en het algoritme van de waterscheiding. Opmerking: deeltjesagglomeraten, indien aanwezig in het AFM-beeld, kunnen worden gemaskeerd en uitgesloten van de analyse.</li>
	<li>Voer geometrische en dimensionale karakterisering van de geïdentificeerde EVs uit met behulp van de beschikbare distributies algoritmen toegankelijk uit korrels menu. Opmerking: gwyddion biedt hulpmiddelen om de verdeling van scalaire waarden, Areal, volumetrische en andere eigenschappen van geïmmobiliseerde Ev's in een gehydrateerde of dessierd toestand te beoordelen. Een voorbeeld van een scalaire waarde eigenschap wordt weergegeven in afbeelding 9, die de verdeling van de maximale hoogten binnen de voetafdruk van elke geïdentificeerde exosome geeft.</li>
	<li>Exporteer de AFM-gegevens van gwyddion voor gespecialiseerde analyse door andere computationele tools en aangepaste computerprogramma's.</li>
</ol>

<ol><li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li>
<li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li>
<li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li>
<li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001(2018).</li>
<li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).</li>
<li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li>
<li>Nečas, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gwyddion%3A+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Physics%22%5BJournal%5D)">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li>
<li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).</li>
<li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li>
<li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603(2015).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva%2C+using+correlative+AFM%2C+FESEM%2C+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li>
<li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+amniocytes+express+hTERT%2C+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li>
<li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circulating+Biomarkers%22%5BJournal%5D)">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li>
<li>Pastré, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions%3A+A+Theoretical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification%2C+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De immobilisatie van EVs uit een biologische vloeistof, oppervlakte scanning en beeldanalyse zijn de essentiële stappen van het ontwikkelde protocol voor de AFM-karakterisering van Ev's in vloeistof. Het aantal blaasjes vatbaar voor AFM beeld schalen met het oppervlak van de afbeelding en de oppervlakte concentratie van de blaasjes geïmmobiliseerd op het substraat. Gezien een negatief Zeta-potentieel van ev's en exosomen18, pleiten we voor elektrostatische fixatie van EVS van vloeibare monsters na...

Extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn aanwezig in alle lichaamsvloeistoffen, waaronder bloed, urine, speeksel, melk en het vruchtwater. Exosomes vormen een districts klasse van EVs, onderscheiden van andere EVs door endosomale biogenese, de markers van het endosomale traject en de kleinste grootte onder alle Ev's. De grootte van exosomen wordt vaak gerapporteerd met een aanzienlijke variabiliteit tussen studies. De dimensionerings resultaten bleken methode afhankelijk te zijn, wat het verschil in fysische principes weerspiegelt dat door verschillende analytische technieken wordt gebruikt om de EV-grootten1,2teschatten. De nanodeeltjes Tracking Analysis (NTA)-de meest gebruikte maat karakterisatie techniek-schat de grootte van EVS als hun hydrodynamische diameters, die kenmerkend zijn voor de weerstand tegen de Brownische mobiliteit van EVS in de oplossing. Een grotere hydrodynamische diameter van een vesikel impliceert zijn lagere mobiliteit in vloeistof. De coronale laag rond blaasjes, bestaande uit oppervlakte eiwitten en andere moleculen die aan het membraanoppervlak zijn verankerd of geadsord, belemmert de mobiliteit aanzienlijk en vergroot de hydrodynamische grootte van Ev's. In relatieve termen is deze toename bijzonder groot voor de exosomen3, zoals geïllustreerd in Figuur 1.
De cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming is een definitieve techniek in het karakteriseren van blaasje maten en morfologie in hun gehydrateerde toestanden. Echter, de hoge kosten van de instrumentatie en de gespecialiseerde expertise die nodig zijn om het correct te gebruiken motiveren de verkenning van alternatieve technieken die kunnen beeld gehydrateerd EVs. Een relatief klein aantal EVs waargenomen of gekarakteriseerd in de verworven cryo-TEM beelden is een ander opmerkelijk nadeel van deze techniek.
Atomaire kracht microscopie (AFM) visualiseert de driedimensionale topografie van gehydrateerde of gedroogde ev's4,5,6 door een sonde over het substraat te scannen om het beeld van de deeltjes op het oppervlak te rasterlen. De essentiële stappen van het protocol om EVs door de AFM te karakteriseren, worden in deze studie uiteengezet. Voordat de blaasjes in vloeistof worden gevisualiseerd, moeten ze worden geïmmobiliseerd op een substraat door ofwel Tethering aan een Gefunctionaliseerde oppervlak, overvulling in een filter, of door elektrostatische aantrekkingskracht7. De elektrostatische fixatie op een positief geladen substraat is een bijzonder handige optie voor immobilisatie van exosomen waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben. Echter, dezelfde elektrostatische krachten die de extracellulaire blaasjes op het oppervlak immobiliseren, verstoren ook hun vorm, wat post-Imaging data-analyse essentieel maakt. We hebben dit punt uitgewerkt door het algoritme te beschrijven dat de grootte van de bolvormige blaasjes in de oplossing schat op basis van de gegevens van de AFM over de vervormde vorm van de exosomen geïmmobiliseerd op het oppervlak.
In het ontwikkelde protocol wordt de procedure voor de robuuste elektrostatische immobilisatie van blaasjes gepresenteerd en gevolgd door de stappen die nodig zijn om atoom kracht imaging in de gehydrateerde of drooghoudende toestanden uit te voeren. De factoren die invloed hebben op de oppervlakte concentratie van de geïmmobiliseerde blaasjes worden geïdentificeerd. De leiding wordt gegeven over het uitvoeren van de elektrostatische immobilisatie voor monsters met verschillende concentraties van EVs in de oplossing. De selectie van experimentele omstandigheden die de raming van empirische kansverdelingen van verschillende biofysische eigenschappen, gebaseerd op een voldoende groot aantal geïmmobiliseerde blaasjes, wordt besproken. Voorbeelden van post-Imaging analyse van de AFM-gegevens worden gegeven. Specifiek, een algoritme wordt beschreven voor het bepalen van de grootte van blaasjes in de oplossing op basis van de AFM karakterisatie van geïmmobiliseerde EVs. De representatieve resultaten tonen de consistentie van de blaasje dimensionering door de AFM met de resultaten van cryo-TEM Imaging.

<table><tbody><tr><td>AFM/STM Controller&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Multimode Nanoscope V</td><td>Deze AFM-controller ondersteunt het beeldvormen van biologische monsters in vloeistof en lucht.&nbsp;</td></tr><tr><td>AFM/STM metal specimen discs (10 mm)</td><td>TedPella</td><td>16207</td><td>Metaal specimen schijf waarop een mica schijf is bevestigd door een dubbelzijdige tape of andere middelen.</td></tr><tr><td>AFM/STM Mica discs (10 mm)</td><td>TedPella</td><td>50</td><td>Hoogwaardige graad V1 mica, 0,21 mm (0,0085&rdquo;) dik. Verschoven, in verpakkingen van 10. Kan worden gemonteerd op AFM/STM discs. Verkrijgbaar in vier diameters</td></tr><tr><td>AFM probe for imaging in the air</td><td>Bruker</td><td>TESP-V2</td><td>Hoge kwaliteit geëtste silicium proben voor tapping mode en non-contact mode voor scannen in de lucht.</td></tr><tr><td>AFM probe for soft sample imaging in liquid</td><td>Bruker</td><td>MLCT</td><td>Zachte siliciumnitride cantilevers met siliciumnitride tips, die zeer geschikt zijn voor vloeistofoperatie.&nbsp; Het bereik in krachtconstanten stelt gebruikers in staat om extreem zachte monsters in contact mode te beeldvormen, evenals hoge belasting vs. afstand spectroscopie.</td></tr><tr><td>Double sided tape</td><td>Spectrum</td><td>360-77705</td><td>Wordt gebruikt om de mica schijf op de metalen specimen schijf te bevestigen.</td></tr><tr><td>ExoQuick-TC</td><td>System Biosciences</td><td>EXOTC50A-1</td><td>ExoQuick-TC is een eigen polymer-based kit ontworpen voor exosome isolatie uit weefselkweek media.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glass probe AFM holder for imaging in liquid</td><td>Bruker</td><td>&nbsp;MTFML-V2</td><td>Deze glazen sonde houder is ontworpen voor scannen in vloeistof met de MultiMode AFM.&nbsp; De houder kan worden gebruikt in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode en krachtmodulatie.&nbsp; De sonde wordt akoestisch aangedreven door een aparte piëzo oscillator voor grotere amplitudemodulatie.&nbsp; De houder wordt geleverd met twee poorten, vereiste fittingen en accessoires kit voor het toevoegen en verwijderen van vloeistoffen.</td></tr><tr><td>Gwyddion</td><td>Czech Metrology Institute.</td><td>Versie 2.52</td><td>Open Source software voor visualisatie en analyse van datavelden verkregen door scanning probe microscopie technieken.</td></tr><tr><td>Lint-free blotting paper</td><td>GE Healthcare Whatman&nbsp;</td><td>Grade GB003 Blotting Paper</td><td>Gebruik dit blotting papier om NiCl2 te verwijderen na de modificatie van het mica's substraat.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Lint-free cleanroom wipes</td><td>Texwipe</td><td>AlphaWipe TX1004</td><td>Gebruik deze polyester doekjes voor oppervlaktereiniging.&nbsp;</td></tr><tr><td>Nickel(II) chloride (NiCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td>Poeder gebruikt om 10 mM NiCl2 in DI water te maken</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

imaging van extracellulaire vesicles door atoom kracht microscopie

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomen en andere extracellulaire blaasjes (Ev's) zijn moleculaire complexen bestaande uit een vesikel van het lipide membraan, de oppervlakte-inrichting door membraan eiwitten en andere moleculen, en diverse Luminale inhoud geërfd van een bovenliggende cel, waaronder Rna's, eiwitten en Dna's. De karakterisering van de hydrodynamische maten van EVs, die afhangt van de grootte van het vesikel en de coronale laag gevormd door oppervlakte decoraties, is routine geworden. Voor exosomen, de kleinste van EVS, is het relatieve verschil tussen de hydrodynamische en blaasjes maten significant. De karakterisering van blaasjes-maten door de cryogene transmissie elektronenmicroscopie (cryo-TEM) beeldvorming, een gouden standaardtechniek, blijft een uitdaging als gevolg van de kosten van het instrument, de expertise die nodig is om de monstervoorbereiding, beeldvorming en gegevensanalyse en een klein aantal deeltjes die vaak in beelden worden waargenomen. Een algemeen beschikbaar en toegankelijk alternatief is de atomaire kracht microscopie (AFM), die veelzijdige gegevens kan produceren over driedimensionale geometrie, grootte en andere biofysische eigenschappen van extracellulaire blaasjes. Het ontwikkelde protocol begeleidt de gebruikers bij het gebruik van deze analytische tool en schetst de workflow voor de analyse van EVs door de AFM, die de monstervoorbereiding voor beeldvormings EVs in gehydrateerde of gedroogde vorm omvat, de elektrostatische immobilisatie van blaasjes op een substraat, data-acquisitie, analyse en interpretatie. De representatieve resultaten tonen aan dat de fixatie van EVs op het gemodificeerde mica-oppervlak voorspelbaar, aanpasbaar is en de gebruiker in staat stelt om dimensionerings resultaten te verkrijgen voor een groot aantal blaasjes. De blaasje dimensionering op basis van de AFM gegevens bleek consistent te zijn met de cryo-TEM Imaging.

De oppervlakte fixatie van EVs is een kritieke stap in de beeldvormings sequentie. Elektrostatische oppervlakte immobilisatie van exosomen, waarvan bekend is dat ze een negatief Zeta-potentieel hebben, zal robuust optreden nadat het substraat van mica is aangepast om een positieve oppervlakte lading te hebben. Zonder de behandeling met NiCl2 om positieve oppervlakte veranderingen uit te voeren, bleek de immobilisatie van EVS op het substraat ineffectief te zijn. Het hoogte plaatje in afbee...

Een stapsgewijze procedure wordt beschreven voor het label vrij immobilisatie van exosomen en extracellulaire blaasjes uit vloeibare monsters en hun beeldvorming door Atoom kracht microscopie (AFM). De AFM-beelden worden gebruikt om de grootte van de blaasjes in de oplossing te schatten en andere biofysische eigenschappen te karakteriseren.

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Dit protocol schetst een eenvoudige voorbereiding voor afm-beeldvorming van extracellulaire vikjes in gehydrateerde en uitgedroogde vormen, hun elektrostatische immobilisatie, oppervlaktescanning, vesicale identificatie en gegevensanalyse en -interpretatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de handige elektrostatische fixatie van vesicles op het huidoppervlak en de post-imaging analyse om rekening te houden met vormvervorming veroorzaakt door immobilisatie. De verkregen vesicles dimensionering resultaten komen overeen met de Gold Standard CryoTEM Imaging die blijft dure en uitdagende techniek.Als u een nieuwe AFM-gebruiker bent, begint u met de karakterisering van droge monsters voordat u overgaat tot gehydrateerde monsters. Omdat er tal van extra factoren die van invloed kunnen zijn gehydrateerde monster verwerving. Om te beginnen isoleer extracellulaire vikjes van een biovloeistof zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol.Bevestig vervolgens stevig een micaschijf aan een magnetische roestvrijstalen monsterschijf. Maak de micaschijf met behulp van een scherp scheermes om een nieuwe laag materiaal bloot te leggen. Behandel het bovenste oppervlak van mica tien

imaging-of-extracellular-vesicles-by-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Source: Biller, S. J., et al. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the preparation of cyanobacterial extracellular vesicles for transmission electron microscopy by negative staining, enabling high-resolution visualization of vesicle morphology, size, and purity for structural and comparative analyses.

Visualization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles Using Transmission Electron Microscopy

In this video, we demonstrate an assay to visualize and quantify the cellular uptake of extracellular vesicles or EVs. This assay utilizes 3D fluorescent imaging using a confocal microscope and allows for distinguishing internalized EVs from ones adhered to the cell surface.

Extracellular Vesicle Uptake Assay: A Method to Visualize and Quantify Cellular Uptake of Extracellular Vesicles Using 3D Fluorescence Imaging Technique

This video demonstrates the immunocapture of extracellular vesicles using fluorescent-labeled capture antibody-magnetic nanoparticle conjugates. The process involves complex formation, staining with fluorescently labeled detection antibodies, magnetic separation, and flow cytometric analysis for antigenic characterization.

Immunocapture and Flow Cytometry of Extracellular Vesicles for Antigenic Characterization

Source: Lunelli, L., et. al. Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp.(2016).This video demonstrates the imaging of polysomes using atomic force microscopy. A nickel-ions-coated mica sheet anchors RNA with attached ribosomes. The sample is washed, dried, and mounted onto the microscope stage. The cantilever tip scans the sample surface, recording laser deflections to map the topology. Software is used to correct distortions and visualize high-resolution polysome...

 Imaging Polysomes Isolated from a Mouse Brain Using Atomic Force Microscopy

Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Extracellulaire blaasjes (EV's) dragen bij aan cellulaire biologie en intercellulaire communicatie. Er is behoefte aan praktische testen om de opname van EV's door de cellen te visualiseren en te kwantificeren. Het huidige protocol stelt de EV-opnametest voor door gebruik te maken van driedimensionale fluorescentiebeeldvorming via confocale microscopie, na EV-isolatie door een op nanofiltratie gebaseerd microfluïdisch apparaat.

Extracellulaire vesikelopnametest via confocale microscoopbeeldvormingsanalyse

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM) wordt gebruikt om de typische diffractielimiet van lichtmicroscopie te omzeilen en exosomen op nanometerschaal te bekijken. Het kan worden gebruikt in zowel twee als drie dimensies om exosomen te karakteriseren.

Directe stochastische optische reconstructiemicroscopie van extracellulaire blaasjes in drie dimensies

We presenteren een protocol voor de isolatie en bevriezing van extracellulaire blaasjes (EV's) afkomstig van kankerachtige urotheelcellen. De freeze-fracture-techniek onthulde de diameter en vorm van de EV's en - als een uniek kenmerk - de interne organisatie van de EV-membranen. Deze zijn van immens belang om te begrijpen hoe EV's interageren met de membranen van de ontvanger.

Freeze-Fracture Elektronenmicroscopie voor extracellulaire vesikelanalyse

De nieuwste generatie EV-karakteriseringstools is in staat om één EV-analyse over meerdere parameters tegelijk uit te voeren. Nano-flow cytometrie meet alle biologische deeltjes groter dan 45 nm zonder labeling en identificeert specifieke kenmerken van subpopulaties door een verscheidenheid aan fluorescerende etiketteringstechnieken.

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization door Nano-Flow Cytometry

Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.

Multimodaal analytisch platform op een multiplexed surface plasmon resonance imaging chip voor de analyse van extracellulaire vesikel subsets

Leer een labelvrije AFM-imagingmethode voor extracellulaire vesikels met elektrostatische immobilisatie op gemodificeerd mica. Deze techniek levert consistente groottebepalingen en is geschikt voor beginnende en ervaren gebruikers.

Imaging van extracellulaire vesicles door Atoom kracht microscopie

Meer video's verkennen