Visualisatie van de Superior oogbeschadigingen en/of Sulcus (hersenanatomie) tijdens Danio rerio embryogenese

Deze set standaardiseert protocollen kan worden gebruikt om nieuw inzicht te bieden in de superieure oculaire sulcus, of SOS, een onlangs ontdekte structuur van het ontwikkelende oog. Deze protocollen zullen elke experimentator over de hele wereld in staat stellen om de SOS duidelijk te visualiseren tijdens de ontwikkeling van zebravissenoogontwikkeling. Begin met het plaatsen van heterozygootlijke groei differentiatie factor zes Een mannelijke en vrouwelijke zebravis op afzonderlijke zijden van een scheidingswand in een tank van gedechloreerd water de avond voor hun koppeling.

De volgende ochtend, verwijder de verdeler en laat de vis te broeden voor niet meer dan 30 minuten. Verzamel aan het einde van de broedperiode de embryo's in petrischaaltjes met E3-medium voor hun incubatie in een couveuse van 28,5 graden. Vervang na 20 uur na de bevruchting het supernatant door E3-medium aangevuld met 0,004%1-Fenyl-2-thiourea om de productie van pigment te voorkomen en de embryo's te onderzoeken door lichte microscopie om te bevestigen dat ze zich allemaal in het juiste ontwikkelingsstadium bevinden.

Leg de monsters onder een ontledenmicroscoop. Gooi alle ontwikkelingsrijpe embryo's weg en gebruik fijne tangen om de chorions voorzichtig uit elkaar te trekken. Visualiseer de SOS, die kan worden weergegeven als een inkeping of lijn aan de dorsale rand van het oog.

Sorteer vervolgens de embryo's die sos-sluitingsvertraging laten zien van degenen die dat niet doen. Om deze embryo's te fotograferen met behulp van een ontledenmicroscoop, bereidt u een petrischaaltje met 1%agarose in E3-medium en prik het midden van de agarose lichtjes in om een ondiep gat te creëren waarin de dooier van het embryo kan worden geplaatst. Plaats vervolgens een verdoofd embryo lateraal op de agarose.

Om de embryo's met behulp van een verbinding of confocale microscoop in beeld te brengen, breng je een embryo over in een petrischaaltje van 35 millimeter met een kleine bolus van niet-gelled 1%laag smeltpunt in E3-medium en gebruik je fijne vislijn om het embryo snel in de zijdelingse positie te plaatsen. Wanneer de agarose is afgekoeld, giet genoeg E3 medium in de schotel om de agarose te dekken en gebruik een 20x water onderdompeling objectieve lens om de SOS visualiseren. Trek na beeldvorming voorzichtig de agarose uit het embryo en bevestig het weefsel in 4% paraformaldehyde of laat de zebravis zijn ontwikkeling voortzetten.

Om de SOS te visualiseren door fluorescerende mRNA-expressie, gebruikt u een micro-injectieapparaat om 300 picogrammen van verbeterde GFP-CAX mRNA in embryo's te injecteren in het stadium met één cel. Gebruik vervolgens een fluorescerende stereoscoop om te screenen op embryo's met een heldere verbeterde GFP-expressie en verkrijg beelden van de embryo's door een van de beeldvormende methoden zoals aangetoond. Voor het geheel monteren van immunofluorescente kleuring van embryonale zebravis laminine, dechorioneren de embryo's zoals aangetoond en bevestig de embryo's in een microcentrifuge buis in vers bereide 4%paraformaldehyde gedurende twee uur op een kamertemperatuur shaker.

Aan het einde van de fixatie, was de embryo's vier keer in PBS plus Tween, of PBST, gedurende vijf minuten per wasbeurt, gevolgd door permeabilisatie in 10 microgram per milliliter of Proteinase K bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Was de permeabiliseerde embryo's vier keer in PBST zoals aangetoond en blokkeer de embryo's in 5% geitenserum en twee milligram per milliliter runderserum albumine in PBST gedurende één tot twee uur op een kamertemperatuurshaker. Aan het einde van de blokkerende incubatie, incubeer de embryo's in de primaire anti-laminine antilichaam van belang op vier graden Celsius 's nachts op een shaker.

De volgende ochtend, was de embryo's vijf keer in PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt en etiket de weefsels met een geschikte secundaire antilichaam 's nachts op vier graden Celsius op de shaker beschermd tegen licht. De volgende ochtend was je de embryo's vier keer in PBST gedurende 15 minuten per wasbeurt en leg je de embryo's in een kleine petrischaal met verse PBST. Met behulp van fijne tangen, voorzichtig verstoren de dooiers en verwijder de dooier cellen door middel van milde schrapen van de dooier zakjes.

Breng de deyolked embryo's over in vers bereide 30%glycerol in PBS, zorg ervoor dat de embryo's bovenop de oplossing worden geplaatst en breng zo weinig mogelijk van de vorige oplossing over en wacht tot de embryo's naar de bodem van de buis zinken. Wanneer de embryo's de bodem van de container hebben bereikt, breng ze over op sequentiële 50% en 70%glycerol in PBS-oplossingen, zoals zojuist is aangetoond. Nadat de embryo's zijn gezonken naar de bodem van de 70%glycerol container, breng de monsters naar een kleine plastic schotel voor dissecties en verbreken de embryo's achterste naar de hindbrains.

Met behulp van fijne dissectie tools, beweeg een hoofd naar een glazen glijbaan met zo weinig glycerol mogelijk en voorzichtig steek een fijne gehaktspeld pin in de voorhersenen ventrikel van het interieur, naar beneden duwen om de rechter en linker helften van het hoofd van elkaar te scheiden. Wanneer het hoofd volledig is gefileerd in de middellijn, monteer elke kant van het hoofd middellijn naar beneden, eye-side omhoog. De SOS is waarneembaar door de ontledenmicroscoop bij 20 tot 23 uur na de bevruchting en via differentiële interferentie contrastbeeldvorming als een dunne lijn in het rugoog die de neus- en temporele helften van het zich ontwikkelende netvlies scheidt.

Bovendien kan een subtiele inkeping zichtbaar zijn in de ruggrens van het oog. Na de immunofluorescente kleuring van laminine kan de dunne lijn worden bevestigd als het keldermembraan. Wanneer SOS-sluiting wordt uitgesteld, kan de langdurige aanwezigheid ervan worden waargenomen als een uitgesproken spleet in de rugzijde van het oog onder een ontledende microscoop.

Wanneer waargenomen onder een samengestelde microscoop met behulp van differentiële interferentie contrast beeldvorming, deze functie is nog prominenter met de nasale en tijdelijke zijden van het oog gescheiden door de SOS, die duidelijk zichtbaar is als een lijn in het rugoog. Tegen 28 uur na de bevruchting bij wildtype zebravissen toont de lamininevlekken duidelijk aan dat de SOS volledig gesloten is, waardoor dit de ideale fase is voor het monitoren van vertragingen bij de sluiting van de spleet. De injectie van verbeterde GFP-CAX mRNA maakt de visualisatie van de celmembranen van levend of vast embryo mogelijk voor het bijhouden van veranderingen in de morfologie van de cellen die leiden tot SOS-sluiting.

Het visualiseren van de SOS kan moeilijk zijn, omdat het smal en van voorbijgaand is. Het is echter noodzakelijk dat u een consistente scoringsmethode handhaaft bij het evalueren van afsluitingsvertragingen op latere punten. Deze technieken kunnen worden gecombineerd met experimentele manipulaties voor het identificeren van genetische factoren of farmacologische agentia die de juiste SOS-vorming en -sluiting beïnvloeden.