Microinjection-gebaseerd systeem voor In Vivo implantatie van embryonale Cardiomyocytes in het aviaire Embryo

Dit protocol helpt ons te bepalen hoe veranderingen in de lokale biomechanica, weefselarchitectuur, paracrineomgevingen en neventakelinteracties cellulair fenotype beïnvloeden. Deze techniek stelt ons in staat om klassieke paradigma's en experimentele embryologie te verkennen zonder de grootschalige weefselbeledimenten te veroorzaken die normaal gesproken ontstaan in traditionele grafiekexperimenten. Om de juiste druk voor injectie te vinden, is het nuttig om te beginnen bij een lagere injectiedruk en stapsgewijs te verhogen totdat een gestage stroom van cellen is bereikt.

Het visualiseren van deze techniek helpt bij het bereiken van een direct inzicht in hoe de injectie-apparatuur moet worden gepositioneerd in relatie tot het doelweefsel. Het demonstreren van de procedure zal twee leden van mijn laboratorium, Trevor Henley en Kandace Thomas. Trek 24 uur voor de implantatie glazen haarvaten op een micropipettrekker volgens standaardprotocollen en dompel de haarvaten onder in siliconen om de buitenoppervlakken van de naalden te coaten.

Laad vervolgens 5 tot 10 microliter siliconen in een microinjectiepipetpunt en plaats de punt in het brede uiteinde van een extern gecoate getrokken glazen haarvat. Plaats de pipetpunt zo dicht mogelijk bij de glazen naaldpunt en gooi het siliconen middel uit terwijl u de laadpipet langzaam intrekt om luchtbellen in de naald te minimaliseren. Laat het siliconenmiddel 10 minuten in de glazen naald zitten voordat u een nieuwe laadpipet gebruikt om de oplossing aan tezuigen.

Droog vervolgens de naalden in een rookkap 's nachts. Voor de voorbereiding van het gastheerembryo, incubeer vruchtbare kippeneieren in een horizontale oriëntatie in een bevochtigde couveuse bij 38 graden Celsius en gebruik schuine tangen om een meer dan een millimeter diameter punctie in de bodem van het vlakke uiteinde van elk ei langs de e-evenaar te maken. Steek een 18 meter naald bevestigd aan een 10 milliliter spuit in de punctie om ongeveer vijf milliliter albumen te verwijderen.

En breng transparante tape aan op de bovenkant van de eierschaal. Scoor het afgeplakte gebied langs de bovenkant van het ei met schuine tangen en gebruik gebogen tenotomy schaar om een venster van ongeveer 2,5 centimeter in het afgeplakte gedeelte van het ei te snijden. Inspecteer en fase het embryo op basis van de criteria vastgesteld door Hamburger en Hamilton en gebruik een een millimeter spuit uitgerust met een 32-meter naald om ongeveer 200 microliters van een een tot vijf verdunning van India inkt in HBSS injecteren onder het embryo.

Sluit vervolgens de punctie af met transparante tape en voeg een milliliter HBSS-drop-wise toe op de embryonale schijf voordat u de besprenkeste schaal afsluit met paraffinefolie voor plaatsing van het ei terug in de bevochtigde couveuse. Wanneer de embryo's Hamburger en Hamilton fase 19 bereiken, spoel de met siliconen gecoate glasvaten met gedeïioniseerd water en laat de haarvaten drie tot vier uur drogen bij kamertemperatuur. Breng ondertussen een embryo van het ene ei over in een petrischaal van 100 bij 15 millimeter met steriele kamertemperatuur HBSS en leg de schotel onder een stereomicroscoop.

Met behulp van tangen, tenotomieschaar en een microspatel isoleren het hele embryonale hart van het embryo en isoleren de atria uit het hart. Plaats het atriumweefsel in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis met een milliliter HBSS op ijs. Wanneer al het donorweefsel is verzameld, pellet de weefsels door centrifugatie in een vaste schuine microcentrifuge.

Voor donorweefsel spijsvertering, opnieuw schorsen de pellets in een milliliter van voorverwarmde 05%trypsin EDTA voor een 15 minuten incubatie in een schudden warmteblok op 300 rotaties per minuut. Aan het einde van de incubatie, pipet de spijsvertering oplossing meerdere malen te breken resterende weefsel en pellet het hart lysaat door centrifugatie. Schors de pellet opnieuw in een milliliter trypsineneutraliserende oplossing voor een andere centrifugatie, gevolgd door re-suspensie in 400 microliters van rode fluorescerende kleurstofoplossing.

Na 20 minuten bij 37 graden Celsius, pellet de cellen door centrifugatie voor een tot drie wast in een milliliter HBSS per wasbeurt. Stel de gelabelde cellen vervolgens opnieuw op met vijf keer tien tot de vierde cel per microliterconcentratie in verse HBSS. Voor in vivo injectie van de donorcellen laadt u de celsuspensie terug in een droge, met siliconen behandelde glazen capillaire pipet zoals aangetoond en monteer u de pipet in het drukmicroinjectorapparaat.

Breng elk gastheerembryo over dat uit de bevochtigde couveuse in een eihouder wordt geïnjecteerd onder een fluorescerende stereoontledenmicroscoop. En gebruik steriele fijne tangen om het vitelline membraan te openen. Maak een incisie van 5 tot 1 millimeter in het pericardium en plaats de microinjecter zodanig dat de punt van de micro-injectienaald het doelweefsel binnendringt.

Stel de microinjector in om enkele pulsen van 5 seconden in duur en variërend van 100 tot 400 hectopascals in druk toe te passen. En druk-injecteren van de cellen. Het is van cruciaal belang om een succesvolle celimplantatie te verifiëren door het fluorescerende signaal te beeldteren voordat het ei opnieuw wordt afgenomen.

Het embryo kan ook gefotografeerd worden om deze procedure vast te leggen. Wanneer alle cellen zijn geïnjecteerd, trekt u het microinjectorapparaat in en verwijdert u het ei van de houder. Voeg vervolgens een milliliter warme HBSS drop-wise toe aan het embryo.

Verzegel het ei met transparante verpakkingstape en breng het ei 24 uur na de implantatie terug naar de bevochtigde couveuse. Hier wordt het hart en het omliggende weefsel van een gastheer embryonaal hart na donortrial myocytenimplantatie getoond. In dit representatieve experiment werden de donorcellen microinjecteerd in het proepicardium van een gastheerembryo in een vergelijkbaar stadium.

Optische secties met behulp van een confocale microscoop bleek dat de enige hartspier marker positieve cellen binnen het proepicardium waren de focally geïmplanteerde fluorescerende rode positieve cellen. Zorg ervoor dat u het embryo van de ontvanger niet te veel manipuleert, omdat breuken in het hart en de lokale vasculatuur veroorzaakt door de injectienaald kan resulteren in verminderde levensvatbaarheid. Na deze procedure kunnen verschillende downstream-tests worden uitgevoerd, waaronder immunohistochemie, in situ hybridisatie en celsorling.

Het siliconen middel is uiterst ontvlambaar en acuut giftig. Het moet altijd worden behandeld met zorg en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen in een rookkap.