Analyse van mitochondriale respiratoire ketencomplexen in gekweekte menselijke cellen met blauwe Native Polyacrylamide-Gel-elektroforese en Immunoblotting

Blue native polyacrylamide gel elektroforese maakt analyse van in-tact complexen van mitochondriale oxidatieve fosforylatie systeem. Het is een handige en goedkope techniek die kan worden gebruikt om de assemblage van hele complexen van mitochondriaal oxidatieve fosforylatie systeem te bedekken. Om de mitochondriale lysates voor te bereiden, gebruikt u eerst ijskoude PBS-oplossing om de cellen een keer voorzichtig te wassen.

Schraap de cellen en pellet ze op vier graden Celsius op 800 G gedurende 10 minuten. Was vervolgens de celpellet twee keer met de ijskoude PBS en centrifuge op vier graden Celsius op 800 G gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 200 microliter van 100x proteaseremmer toe aan 20 milliliter PBS.

Stel de cellen in het PBS proteaseremmermengsel opnieuw op tot een uiteindelijke eiwitconcentratie van vijf milligram per milliliter. Om 3,3 millimolar digitonin in PBS met proteaseremmer voor te bereiden, los u vier milligram digitonine op in één milliliter PBS bij 100 graden Celsius totdat er geen neerslag zichtbaar is. Koel onmiddellijk af op het ijs en voeg 10 microliter 100x proteaseremmer toe aan een milliliter van de digitonin-oplossing.

Voeg vervolgens het digitonin proteaseremmermengsel toe aan de cellen bij de uiteindelijke concentratie van 1,65 millimolar. Meng goed, en broed op ijs gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens het PBS proteaseremmermengsel toe aan de cellen tot het uiteindelijke volume van 1,5 milliliter.

Centrifuge bij vier graden Celsius op 10.000 G gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant en schort de mitochondriale pellet opnieuw op in de mitochondriale buffer. Bereid een milliliter verse 10% loreal gemonteerd in PBS remmer oplossing.

Voeg 10% loreal mountased aan de mitochondriën bij de laatste concentratie van 1%Incubate op ijs gedurende ten minste 15 minuten. Centrifuge bij vier graden Celsius op 20.000 G gedurende 20 minuten. Verzamel de supernatant in een nieuwe buis en voeg de monsterbuffer toe.

Om de gradiëntgel voor te bereiden op blauwe native pagina, plaats de gradiëntmaker eerst op een roerplaat en sluit deze aan met een flexibele slang met de peristaltische pomp. Bevestig een infuusset met een naald aan de slang. Plaats een magnetische roerder in de proximale kamer van de gradiëntmaker en was de slang met gedestilleerd water op de maximale pompsnelheid gedurende 10 minuten.

Maak vervolgens de slang en de verloopmaker leeg. Gebruik een pipet om restjes gedestilleerd water in het kanaal tussen de kamers van de gradiëntmaker te verwijderen. Sluit het kanaal en de slang met de klep.

Monteer twee glazen platen in de houder en leg deze op de standaard. Plaats met behulp van het gat op de bodem van de gelhouder de naald die is aangesloten op de slang tussen de glasplaten. Om een 8,3 bij 7,3 centimeter gel te maken, bereid je eerst 6% en 15% gel oplossingen voor en houd ze op ijs.

Meng ze voorzichtig om te voorkomen dat het maken van luchtbellen. Laad vervolgens het proximale uiteinde van de spanleerbuizenkamer met 2,6 milliliter van de 6%gel en het distale uiteinde met 2,1 milliliter van de 15%gel. Schakel vervolgens de magnetische roerder in en open de slang en het kanaal tussen de kamers van de gradiëntmaker.

Schakel de peristaltische pomp onmiddellijk in op vijf milliliter per minuut. Vul de glasplaten en verwijder de naald als er geen gel in de slang zit. Leg de gel voorzichtig over met gedestilleerd water en houd de gel minstens een uur op kamertemperatuur.

Was de slang onmiddellijk door de gradiëntkamers te vullen met gedestilleerd water en gebruik de peristaltische pomp op de maximale snelheid. Voeg zes milliliter van het gedestilleerde water toe aan drie milliliter van de 3x gel buffer om 1x gel buffer te maken. Verwijder met een filterpapier voorzichtig het gedestilleerde water van het oppervlak van de gel.

Was het oppervlak van de gel met de 1x gel buffer en verwijder voorzichtig de buffer met het filterpapier. Bereid 4% stapelen gel volgens het manuscript. Meng voorzichtig om te voorkomen dat het maken van luchtbellen.

Plaats vervolgens de kam tussen de glasplaten en giet de stapelgel onder de kam. Dompel de kam volledig onder. Laat de stapelgel minstens 30 minuten polymeriseren.

Verwijder vervolgens de kam en gebruik een pipet om de putten te wassen met 1x gel buffer. Om de blauwe inheemse gel elektroforese uit te voeren, voeg eerst de blauwe kathodebuffer toe aan de gelcassette. Gebruik een pipet om de putten te wassen en te vullen met de blauwe kathodebuffer.

Laad vervolgens vijf tot 30 microgram eiwitmonsters in de putten. Vul de gelcassette voorzichtig naar de top met de blauwe kathodebuffer en de tank met de anodebuffer. Eerst, voer de gel op een constante spanning van 40 volt gedurende 15 minuten.

Verhoog vervolgens de spanning tot 80 volt. Voer de gel uit tot de kleurstof 2/3 van de gellengte bereikt. Vervang de blauwe kathodebuffer door de kathodebuffer en ga door met elektroforese totdat de kleurstofvoorzijde van de gel is afgelopen.

Haal de glasplaten op en breng de eiwitten door middel van semi-droge blotting naar het PVDF-membraan. Gebruik een constante spanning van 25 volt en een stroom beperkt tot een ampère gedurende 30 minuten. De assemblage van de ademhalingsketencomplexen in de menselijke neuroblastoomcellen werd geremd bij chlooramphenicolbehandeling in vergelijking met de controlecellen zonder behandeling.

Complexen die door de nucleaire genen werden gecodeerd, werden daarentegen up-regulated. Afbraak van de oxidatieve fosforylatiecomplexen werd waargenomen bij meerdere vriesdooicycli. De kwaliteit van de gel kan de detectie van de oxidatieve fosforylatiecomplexen beïnvloeden.

Ook, strippen van het membraan verlaagde de signaal-ruis verhouding. Bij het uitvoeren van de procedure is het belangrijk om te onthouden om eenvoudige voorbereiding en gel elektroforese uit te voeren onder koude omstandigheden om in-tact OXPHOS complexen te behouden. Na blauwe native pagina, een tweede dimensie SDS pagina kan worden toegepast om de eiwit sub-eenheden van de luchtwegen keten complexen te bestuderen.

Blue native pagina kunnen onderzoekers bestuderen de assemblage van complexen en zelfs super-complexen van oxidatieve fosforylatie systeem.