Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Het protocol dat we hier presenteren is een snelle en goedkope halfgeleider, sequencing-gebaseerde methoden voor de screening van aneuploïdie in embryo's. Het verfijnde protocol voor het uitvoeren van sjabloonversterking en de indelingen van de sequencing-bibliotheek maken de PGTA-detectie reproduceerbaar, hoge doorvoer, kostenefficiënt en tijdbesparend. De runtime van deze halfgeleidersequent is slechts twee tot vier uur.

Verkorting van de doorlooptijd van het ontvangen van monsters tot het uitgeven van rapporten in vijf dagen. Deze methode biedt genoomsequencing voor aneuploïdiescreening, kopienummervariatie en enkele nucleotide polymorfismeroepingen. Vanwege verschillende sequencing chemie, kan de bibliotheek die door dit protocol wordt voorbereid niet direct op andere sequencing systemen worden gesequenced.

Maar dezelfde sequencer, maar verschillende bibliotheek voorbereiding, het is in staat om niet-invasieve prenatale screening te doen. Het aantonen van de procedure zal Xiangchun Guo, een technicus van ons laboratorium. Om te beginnen sequencing, vortex elke verdunde bibliotheek en kort draaien vier keer op de mini centrifuge voor drie seconden per keer.

Neem vervolgens vijf microliters van elke bibliotheek, om te poolen in de kern-vrij, een punt vijf milliliter buis. Vortex de gemengde bibliotheek en kort draaien op een mini centrifuge voor drie seconden. Voeg 150 microliter van de breekoplossing toe aan twee nieuwe herstelbuizen.

Installeer de nieuwe herstelbuizen, de herstelrouter en de versterkingsplaat. Meng door de oliefles drie keer om te keren. Zorg ervoor dat zowel de olie- als de terugwinningsoplossing ten minste twee derde vol is.

Vortex de master mix PCR buffer voor 30 seconden en kort spin op een mini centrifuge gedurende drie seconden. Vortex de bol deeltjes en de gemengde bibliotheek voor een minuut en kort draaien op een mini centrifuge gedurende drie seconden. Bereid vervolgens een 2400 microliter ligatiemix, door 172 microliter nuclease-vrij water, acht microliters van de gemengde bibliotheek, 120 microliter van de enzymmix en 100 microliter van de boldeeltjes toe te voegen aan de buis met 2000 microliter van de mastermix PCR-buffer.

Stel een pipet in op 800 microliters en laad het ligatiemengsel op het reactiefilter via de monsterpoort. Keer de oliefles drie keer om en gebruik een P1000 pipet om 200 microliter van de reactieolie aan het reactiefilter toe te voegen. Selecteer het programma Proton en selecteer vervolgens de ondersteunde knop, om ervoor te zorgen dat het apparaat correct is ingesteld, door de instructies op de monitor te volgen.

Klik vervolgens op Naast om het programma te starten. Laad 100 microliter van het emulsie-PCR-productmonster, 130 microliter van de gewassen kralen, 300 microliter van de ES-wasoplossing en 300 microliters van de smeltoplossing in de achtbuisstrook. Plaats de achtbuisstrook op het verrijkingssysteem.

Installeer een pipettip en een nieuwe nulpunt twee milliliter buis en start het programma. Centrifugeer de nulpunt twee milliliter buis op 15, 500 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en bewaar tien microliter van het verrijkingsproduct.

Voeg 200 microliters nuclease-vrij water toe aan de buis en meng door vortexing. Centrifuge de nulpunt twee milliliter buis weer. Gooi de supernatant weg en bewaar 10 microliter van het verrijkingsproduct.

Voeg 90 microliter nuclease-vrij water toe aan de buis en meng door vortexing. Om de sjabloon voor te bereiden, vortex de positieve controle en spin kort. Voeg vijf microliter van de positieve controle toe aan 100 microliter van het verrijkingsproduct.

Vortex en centrifuge op 15, 500 keer G gedurende vijf minuten. Gooi de supernatant weg en bewaar 10 microliter van de sjabloon. Voeg vervolgens 20 microliter van de sequencing primer en 15 microliter van de annealing buffer toe aan de sjabloonbuis.

Vortex de buis en kort draaien op een mini centrifuge voor drie seconden. Broed de buis in een thermische cycler met een verwarmd deksel. Voeg vervolgens 10 microliter van de laadbuffer toe aan de buis.

Meng door pipetting op en neer. Meng de 55 microliter van het monster door pipetting op en neer en laad het monster aan de lading goed van de chip. Houd de gebruikte pipettip en de nulpunt twee milliliter PCR-buis.

Plaats de chip op de chip mini centrifuge wanneer een monster in de chip. Controleer de positie en centrifugeer de chip gedurende 10 minuten. Bereid 50% annealing buffer door het toevoegen van 500 microliter van annealing buffer en 500 microliters van nuclease-vrij water in een een punt vijf milliliter buis.

Bereid de spoeloplossing voor, door 500 microliter annealing buffer en 500 microliter van 100% 2-propanol toe te voegen aan een één punt vijf milliliter buis. Bereid vervolgens het schuimmengsel voor, door 49 microliter van de 50%-annealingbuffer en één microliter van de schuimoplossing toe te voegen aan twee nieuwe éénpuntsvijftig milliliterbuizen. Pipette lucht in een van de schuimende mengsels, en laad 120 microliter van de bellen in de lading put.

Breng de overmatige verdreven vloeistof van de uitgang goed naar de lading goed, en centrifuge de chip voor 30 seconden op de chip mini centrifuge. Herhaal het proces voor het tweede schuimende mengsel. Voeg 55 microliter van de 50%annealing buffer toe aan de gehouden op nul punt twee milliliter buis.

Gebruik de bewaarde pipettetip om op en neer te pipetten. Laad alle 55 microliters van de annealing buffer naar de laadput. Centrifuge de chip gedurende 30 seconden op de aangewezen chip mini centrifuge.

Laad 100 microliter van de spoeloplossing in de chip die goed laadt en gooi de uitgestoten vloeistof uit de uitgang goed. Herhaal deze laadstap één keer. Laad 100 microliters van de 50%annealing buffer, in de chip belasting goed.

Herhaal deze laadstap in totaal drie keer. Voeg 60 microliter van de 50% annealing buffer en zes microliters van de sequencing enzym in een nieuwe one point vijf milliliter buis. Meng door pipetting op en neer.

Langzaam pipette 65 microliters van deze gemengde oplossing in de chip goed laden, het vermijden van bellen. Houd de chip uit de buurt van licht en incubbateren op kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Tot slot, na de incubatie, laad onmiddellijk de chip op de sequencer en klik op Start The Sequencing Run op het scherm om te beginnen met sequencing.

Een retrospectieve statistische analyse van 186 decolletéfase en 1135 blastocyst fase embryo's resulteerde in meer dan 95% WGA slagingspercentages in beide soorten monsters. Sequencing kwaliteitscontrole mislukking tarieven waren 3,4% in de decolleté fase groep en slechts 1,9% in de blastocyst fase groep. Naast aneuploidy kunnen de sequencing gegevens worden gebruikt voor andere analyses.

Bijvoorbeeld, kopieer nummer variaties met een grootte minder dan vijf megabase, of myconriaal DNA-analyse, afhankelijk van de volgorde diepte en kwaliteit. Met de verbetering van het bellen van het aantal exemplaren kunnen onderzoekers de toekomst van chromosomale mozaïekisme in vroege embryo's in het vroege stadium van de mens verder onderzoeken.