In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

Dit protocol biedt een lange termijn, in vitro, functionele methode voor de evaluatie van chimerische antigeenreceptor, of CAR T-cellen, door middel van repetitieve tumorcel uitdaging. Deze techniek is minder tijdrovend, en minder arbeidsintensief dan in vivo CAR T-celfunctie evaluatie, terwijl nog steeds het bereiken van een nauwkeurige weergave van de ware anti-tumor werkzaamheid. Deze in vitro techniek maakt de hoge doorvoer screening en differentiatie van CAR T cel anti-tumor potentie.

Die heeft de potentiële toepassing voor het beoordelen van de klinische effectiviteit van CAR T-celproducten. Begin met het scheiden van glioblastoom tumorsferen van een glioblastoom tumorsfeer cultuur. Met een milliliter koude accutase, en 30 tot 60 seconden pipetting.

Wanneer de tumorsferen zijn verstoord, stop de reactie met vijf milliliter warm co-cultuurmedium. En pellet de tumorcel suspensies door centrifugatie. Stel de glioblastoomcellen opnieuw op tot een 1,6 keer 10 tot de vijfde tumorcellen per milliliter verse cocultuurmediumconcentratie, en verdun T-cellen geoogst uit een CAR T-celkweek tot het juiste percentage CAR-positieve T-cellen per milliliter co-kweekmediumconcentratie.

Voeg vervolgens 100 microliter van de verdunde tumorcellen toe aan elke put van een 96 goed platte bodemweefselcultuurplaat. En 100 microliters van CAR T cellen in elke put van tumorcellen met zachte menging. Plaats de plaat vervolgens in een 37 graden Celsius, 5%koolstofdioxide incubator.

Op dag twee, vier en zes van de cultuur, voorzichtig verwijderen 50 microliter van medium uit elke put van de tumorcel, T cel co-cultuur plaat gepland voor rechallenge volgens de tabel. Voeg vervolgens 50 microliters verse glioblastoomcelsuspensie toe, bereid zoals net aangetoond, maar met twee keer het celnummer van de initiële co-cultuur aan elke put met zachte menging. En breng de plaat terug naar de celkweek incubator.

Dagen een, drie, vijf, en zeven van co-cultuur, de overdracht van de supernatant van elke put te worden geoogst in een nieuwe 96 goed ronde bodemplaat volgens de tabel en voeg 50 microliter van voorverwarmde 0,5%Trypsin EDTA in elk medium uitgeput goed. Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, bevestigen dat de cellen hebben losgemaakt van de bodem van elke put door lichte microscopie, en voorzichtig pipette het enzym oplossing rond de bodem van elke put om de cellen opnieuw tepenpen. Voor het overbrengen van de vrijstaande celsuspensie in de passende overeenkomstige putten van de nieuwe 96 puttenplaat.

Pellet de cellen door centrifugatie, en was de cellen met 200 microliter tl van fluorescerende geactiveerde cel sorteren staande oplossing, of FFS per goed met een tweede centrifugatie. Schort de pellets opnieuw op in 100 microliters van de antilichaamcocktail die van belang is voor 100 microliter SSS per put gedurende een incubatie van 30 minuten bij vier graden Celsius. A het einde van de incubatie verwijderen van niet-gebonden antilichaam door sequentiële 100 en 200 microliter FSS wast en opnieuw opschorten van de cellen in 100 tot 200 microliters van DAPI nucleaire vlek en FSS.

Analyseer vervolgens de cellen volgens de standaardstroomcytometrische analyseprotocollen. Voor functionele en fenotypische analyse van de CAR T-cellen na tumorcel co-cultuur, haal de gegevensbestanden uit de stroom cytometer, en gate alle levende DAPI negatieve cellen. Om de tumorcellen te kwantificeren, poort de CD45 negatieve populatie.

Om de CAR T cellen poort de CD45 positieve CAR positieve bevolking te kwantificeren. Vervolgens plot de tumor en CAR T cel nummers in de loop van de tijd van het experiment, het identificeren van T-cel activering door de co-expressie van 41BB, en CD69. T-celuitputting door de expressie van PD1, LAG3 en TIM3, en de T-celgeheugenstatus LAG3 en TIM3, en de T-celgeheugenstatus door CD45RO en CD62 ligand-expressie.

cd45RO en CD62 ligand expressie. Zowel CD4-positieve als CD8-positieve CAR T-cellen worden gelijk geactiveerd tegen glioblastoomcellen die het doelantigenen uitdrukken, zoals aangegeven door hun CD107a- en intracellulaire cytokine-expressie. Echter, zoals beoordeeld door repetitieve tumor uitdaging SA, CD4 positief, maar niet CD8 positief, CAR T cellen zijn in staat om meerdere ronde doden.

CD4 positieve CAR T cellen bereiken ook een robuustere uitbreiding. Wanneer CD4 positief, en CD8 positieve CAR T cellen worden gemengd op een een-op-een verhouding, deze cel combinatie uit presteert CD8 positief, maar niet CD4 positieve CAR T cellen in termen van lange termijn cytotoxiciteit. Bovendien wordt de uitbreiding van CD8-positieve CAR T-cellen veroorzaakt door de toevoeging van CD4-positieve T-cellen.

Terwijl CD4 positieve CAR T-celuitzetting wordt geremd in aanwezigheid van CDa-positieve cellen. 24 uur na de initiële co-cultuur worden zowel CD4-positieve als CD8-positieve CAR T-cellen op dezelfde manier geactiveerd. Tijdens de repetitieve tumor uitdaging, zowel CD4 positieve en CD8 positieve CAR T cellen tonen een overgang van een CD45RO positieve, CD62 ligan positieve centrale geheugen fenotype, naar een CD45RO positieve CD62 ligan negatieve effector geheugen fenotype.

CD8 positieve CAR T cellen zijn ook meer vatbaar voor uitputting in vergelijking met CD4 positieve CAR T cellen zoals beoordeeld door hun PD1, LAG3, en TIM3 expressie na drie dagen van co-cultuur. Verder zijn er geen verschillen waargenomen in CDa-positieve CAR T-celuitputting in de aanwezigheid of afwezigheid van CD4-positieve T-cellen, wat aangeeft dat CD4-geïnduceerde CD8-positieve CAR T-celexpansie niet wordt geassocieerd met een betere effectorfunctie. Dit essay kan ook worden gekoppeld aan het sorteren van de T-cellen vormen de co-cultuur om verdere analyse uit te voeren op transcriptomen, proteomics, en specifieke genen van belang.

Deze repetitieve tumor uitdaging kan ook worden gebruikt als een platform voor het onderzoeken van de biologische gebeurtenissen na CAR T cel tumor erkenning.