Name: Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Leer zuurstofverbruik meten in intacte Caenorhabditis elegans voor mitochondriale functieanalyse. Deze methode analyseert basale en maximale zuurstofconsumptie zonder mitochondriën te isoleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs wil erkennen van Dr. Kevin Bittman voor zijn leiding bij de vaststelling van de Seahorse XFp in het lab. National Institutes of Health verlenen dat gm088213 ondersteund dit werk.

Opmerking: Figuur 2 geeft een schematisch overzicht van het volledige protocol.
1. groei en synchronisatie van nematode bevolking9,10
<ol><li>Overdracht van L4 larven van gewenste genetische achtergronden (bijvoorbeeld N2 [wild type] en sel-12 dieren) op nematode groei media (NGM) platen (Zie tabel 1 voor recept) vers bezaaid met een gazon van Escherichia coli (OP50)11. Ten minste twee 100 mm of drie 60 mm platen te gebruiken voor elke stam. Incubeer de wormen bij de temperatuur van de juiste groei (tussen 15-25 ° C) voor 3-4 dagen of totdat de platen zijn geconcentreerd met groot aantal eieren en gravid wormen.</li>
	<li>Wassen van de eieren en de wormen uit de platen met behulp van ongeveer 6 mL M9 buffer (Zie tabel 1 voor recept) per 100 mm plaat van nematoden en overdracht glas mee Pasteur pipetten in individuele 15 mL centrifuge buizen voor elke stam. Draai deze buizen omlaag gedurende 3 minuten op 6.180 x g en aspirate uit de buffer van de M9, behoud van enkel de pellet dieren en eieren.</li>
	<li>Voeg 3-4 mL bleekwater oplossing (Zie tabel 1 voor recept) aan elke buis en met tussenpozen vortex voor 6 min. toevoegen M9 buffer te vullen van elke buis en draaien op 6,180 x g voor 1 min en supernatant gecombineerd. Herhaal dit wassen met M9 driemaal en verplaatsen van de ei-pellet tot een vers 15 mL koker met ongeveer 9 mL M9 buffer.</li>
	<li>Synchroniseren van de vers gearceerde wormen door nutating bij 20 ° C gedurende 16 – 48 h. Spin deze buizen omlaag bij 6,180 x g gedurende 1,5 min en de gesynchroniseerde L1 dieren neergezet op afzonderlijke NGM platen vers bezaaid met een gazon van OP50 (ongeveer 6000-10.000 dieren per 100 mm plaat) en houden bij 20 ° C.</li>
	<li>Deze dieren zullen het larvale stadium van L4 bereiken na ~ 42 h. Op dit moment gaan de larven van de L4 met behulp van een platina pick te OP50 zaadjes NGM platen met 0,5 mg / mL 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) om te voorkomen dat ze produceren nakomelingen. Opmerking: Zorg ervoor dat alle spanningen binnen een experiment zijn gesynchroniseerd voor een vergelijkbare hoeveelheid tijd. FUdR behandeling Steriliseert de dieren en voorkomt leggen en nakomelingen eiproductie, die OCR kan beïnvloeden. Deze gesteriliseerde dieren zullen de volgende dag (dag 1 volwassen dieren bij ~ 66 h) voor de bepaling worden geanalyseerd. FUdR is gemeld aan de Fysiologie en levensduur van bepaalde mutant worms beïnvloeden. Dus, dit moet rekening worden gehouden wanneer het geneesmiddel wordt gebruikt voor sterilisatie12,13,14. Wormen kunnen ook worden gesteriliseerd door middel van vrouwelijker mutaties zoals fem-1(hc17) of fem-3(e2006). Deze mutaties kunnen echter van invloed zijn mitochondriale functie.</li>
</ol>2. voorbereiding van de verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van sondes
Opmerking: Tijdens de test uitvoeren, zowel basaal en maximale ademhaling de nematoden zijn gemeten. Maximale ademhaling wordt geactiveerd in de dieren op de toevoeging van carbonyl cyanide-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), een ontkoppelingseiwit ionophore dat de Mitochondriale membraanpotentiaal verstoort en dus de ATP-synthese door het vervoer van protonen door middel van de mitochondriale membraan, terwijl het proton pompen, elektronentransport en zuurstofverbruik te gaan4,15 rekken van de ATP-synthese (Figuur 1). De laatste stap in de bepaling omvat de toevoeging van natriumazide (NaN3), een geneesmiddel dat complexen IV en V in het ETC remt, zodat naar niet-mitochondriale ademhaling16 (Figuur 1) te bepalen. De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd op de dag vóór de eigenlijke test run.
<ol><li>Bereiden 1 mL stamoplossingen van de FCCP (10 mM dimethylsulfoxide [DMSO]: 1000 x de laatste assay concentratie) en NaN3 (400 mM dH2O: 10 x laatste assay concentratie) en winkel bij-20 ° C. Opmerking: Voer een concentratie curve voor het optimaliseren van de concentratie van FCCP moet uitlokken maximale OCR reactie voor elk instrument en laboratorium instelling.</li>
	<li>Hydrateer de sensor cartridge door toevoeging van 200 µL dH2O aan elk putje (en de omliggende reservoir) in het slagperk, ervoor te zorgen dat de sensor sondes zijn ondergedompeld in de dH2O en winkel 's nachts bij kamertemperatuur. Opmerking: De cartridge sondes kunnen worden overgelaten ondergedompeld voor maximaal 72 uur maar in het geval van een langdurige hydratatie, de platen moeten worden verpakt in paraffine film en opgeslagen bij 4 ° C. Als overnachting hydratatie niet mogelijk is, moet de sensor cartridge voor ten minste 4 uur vóór de test worden gehydrateerd.</li>
	<li>Uitschakelen van het verwarmingselement binnen de interface van de respirometer en sla het instrument binnen een incubator van de 15 ° C's nachts tot lagere kerntemperatuur binnen het instrument om te voorkomen dat de dieren oververhitting tijdens de test worden uitgevoerd. Opmerking: De respirometer is uitgerust met een verwarmingselement maar niet kan worden gekoeld. Binnen een 15 ° C incubator, zal de respirometer hebben een stabiele temperatuur tussen 18-22 ° C, die een gezonde temperatuur voor C. elegans onderhoud.</li>
</ol>3. geneesmiddel laden en cartridge evenwichtsinstelling
<ol><li>Pipetteer uit en gooi de dH2O gebruikt om te hydrateren de sensor sondes en 200 µL van de kalibrant oplossing (pH 7.4) in elk putje te vervangen. Verdun de stockoplossing van de FCCP tot 100 µM FCCP in dH2O en Voeg 20 µL van de verdunde oplossing tot de injectie poort A in de sensor-patroon. 22 µL van 400 mM natriumazide toevoegen aan poort B van de senor patroon.</li>
	<li>Zet de respirometer op en op het beginscherm Selecteer Start; de sjablonen pagina verschijnt. Selecteer op de pagina sjablonen leeg of een eerder ontworpen sjabloon; de groepen pagina verschijnt. Op de pagina groepen selecteren de putjes A en H als de achtergrond putten en de resterende 6 putjes in de juiste groepen volgens de proefopzet toewijzen.</li>
	<li>Druk op de pijl op de lagere juiste hoek om te gaan naar de pagina van het Protocol. Zorg ervoor dat de knoppen uitgebalanceerd, basale en injecties 1 en 2 zijn geselecteerd op de pagina Protocol. Op deze pagina, het aanpassen van het aantal lezingen van basale OCR, alsmede maximale OCR (na injectie 1 met FCCP) en niet-mitochondriale OCR (na injectie 2 met natriumazide). Opmerking: Elke meting wordt voorafgegaan door een mix en wacht stap en de termijnen voor deze parameters worden weergegeven in tabel 2.</li>
	<li>Selecteer de pijl op de lagere juiste hoek en een prompt voor het laden van de sensor cartridge plaat verschijnt. Zorg ervoor dat de sensor cartridge plaat in de juiste richting, volg de instructies op het snelle scherm van herinnering is geladen. De respirometer zal nu de cartridge equilibreer. Opmerking: Deze evenwichtsinstelling biedt ruimschoots de tijd om de dieren in passende putjes van de plaat van de cel worden bepaald.</li>
</ol>4. voorbereiding van de worm plaat en kwantitatieve analyse uitvoeren
<ol><li>Voeg 200 µL van M9 buffer in elk van de 8 putjes van de plaat van de cel en in de reservoirs rondom de putten.</li>
	<li>Kies ~ 100 wormen uit elke stam op unseeded NGM platen en laat rusten gedurende 2-3 minuten nat het einde van de platina pick met M9 buffer en pak 20 leeftijd-gesynchroniseerde dieren in putten B-G, als u de achtergrond putten A en H leeg laat. Opmerking: Na het laden elk goed, wacht ongeveer 2 min om de dieren te vestigen in de bodem van de putten. Het is ook raadzaam dat een worm nummer curve voor het optimaliseren van het nummer van de worm per putje voor elk instrument en laboratorium instelling worden uitgevoerd.</li>
	<li>Nu, de respirometer moet worden gekalibreerd en u op OK klikt op het scherm, de plaat met kalibratie buffer wordt uitgeworpen en kan worden verwijderd uit de respirometer, terwijl de sensor cartridge binnen het instrument blijft. De plaat kalibrant wordt vervangen door de plaat met dieren. Laden van de plaat en sluit de deur door te raken Doorgaan en toestaan van de bepaling uit te voeren.</li>
</ol>5. na experiment gegevensanalyse
<ol><li>Zodra de test run voltooid is, volg de aanwijzingen op het scherm en verwijder de cel plaat en sensor cartridge en sluit een flashstation in de USB-poort van de run gegevens opslaan in de indeling .war. Verwijder de cassette sensor en toestaan dat de dieren het aantal dieren per putje te regelen naar de onderkant van de putten voor ongeveer 2 min. plaats de platen van de cel onder een stereo microscoop ontleden.</li>
	<li>Open de analysesoftware op de computer en opent u het tabblad normalisatie te normaliseren OCR op dierlijke getal. Toepassing van passende etiketten voor de verschillende groepen onder het tabblad wijzigen en het bestand als een prisma-bestand voor verdere analyse exporteren. Opmerking: Het gemiddelde van de eerste vijf metingen, voordat de toevoeging van FCCP de basale OCR, terwijl het gemiddelde van de vijf metingen is na toevoeging van de FCCP de maximale OCR is en het gemiddelde van de laatste vijf metingen (minimum van twee metingen moet gebeuren) na natrium azide toevoeging de niet-mitochondriale ademhalingsfrequentie is. De bepaling moet driemaal worden herhaald om de reproduceerbaarheid.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Mitochondriale ademhaling is een inzichtelijke indicator van mitochondriale functie; Daarom is het zeer waardevol kunnend meten de zuurstof verbruik in een biologisch systeem, of in vitro of in vivo. Respirometers zin zuurstofniveaus met behulp van porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die uitgeblust krijgen door zuurstof of via amperometrische zuurstofsensoren die afhankelijk zijn van de generatie van een elektrische huidige evenredige zuurstof onder druk. Clark-elektrode in de laatstgenoemde categorie valt en is uitgebre...

Adenosinetrifosfaat (ATP), de belangrijkste bron van cellulaire energie, wordt geproduceerd in de mitochondriën door enzymen in het elektronentransport keten (ETC) gelegen in het binnenste van de mitochondriale membraan. Pyruvaat, een belangrijke metaboliet gebruikt voor mitochondriale ATP productie, wordt geïmporteerd in de mitochondriale matrix waar er gedecarboxyleerd tot acetyl coenzym A (CoA). Vervolgens treedt acetyl CoA de citroenzuurcyclus resulterend in de generatie van nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), een belangrijke elektron vervoerder molecuul. Zoals elektronen uit NADH worden doorgegeven aan zuurstof via de enz, opbouwen protonen in de mitochondriale intermembrane ruimte, wat in het genereren van een elektrochemische gradiënt over het membraan resulteert. Deze protonen zal dan vloeien voort uit de intermembrane ruimte over deze elektrochemische gradiënt terug naar de mitochondriale matrix door middel van de proton porie van de ATP-synthase, rijden de rotatie en de synthese van ATP1 (Figuur 1).
Mitochondriale functie is niet beperkt tot de productie van energie, maar is ook van cruciaal belang voor de calcium-homeostase, reactieve zuurstof soorten (ROS) opruiming en apoptosis, kritisch positionering van hun functie in organisch gezondheid2. Mitochondriale functie kan worden beoordeeld met behulp van een verscheidenheid van tests, met inbegrip van maar niet beperkt tot analyses die meten van Mitochondriale membraanpotentiaal, ATP en ROS niveaus en concentraties van de mitochondriale calcium. Echter misschien deze testen bieden een enkele momentopname van mitochondriale functie en daarom niet een uitgebreid overzicht van mitochondriale gezondheid. Omdat zuurstofverbruik tijdens ATP generatie afhankelijk van een groot aantal opeenvolgende reacties is, dient het als een superieure indicator van mitochondriale functie. Interessant is dat verschillen in zuurstof verbruik geconstateerd als gevolg van mitochondriale dysfunctie3,4,5.
Zuurstof verbruik (OCR) levende monsters kan worden gemeten met behulp van technieken die kunnen grofweg worden verdeeld in twee groepen: amperometrische zuurstofsensoren en porfyrine gebaseerde fosfordeeltjes die kunnen worden gehard door zuurstof6. Amperometrische zuurstofsensoren zijn uitvoerig gebruikt om maatregel OCR in gekweekte cellen, weefsels, en in modelsystemen, zoals C. elegans. Echter porfyrine gebaseerde fosforen met respirometers bezitten de volgende voordelen: (1) zij voorzien in een side-by-side vergelijking van twee monsters in drievoud, (2) ze kleinere steekproefgrootte vereisen (bijvoorbeeld 20 wormen per putje versus ~ 2, 000−5, 000 wormen de kamer)7, en (3) de respirometer kan worden geprogrammeerd om te doen vier verschillende samengestelde injecties op gewenste tijden gedurende de experimentele, eliminerend de behoefte aan manuele toepassing.
In dit protocol zijn de stappen die betrokken zijn bij het gebruik van een porfyrine gebaseerde zuurstof detecterende respirometer maatregel OCR in live, intact C. elegans beschreven. Hoewel er een schriftelijke protocol voor het gebruik van het grote formaat, hoge doorvoer respirometer8, is dit protocol aangepast voor gebruik met een meer budget-vriendelijk, toegankelijk en kleinere schaal instrument geweest. Dit protocol is vooral handig voor het beoordelen van het verschil in OCR tussen twee stammen, waar high-throughput screening is niet nodig en het gebruik ervan overdreven hoog zouden uitvallen.

<table><tbody><tr><td>100 mm, 60 mm Petri dishes</td><td>Kord-Valmark Labware Products</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tubes</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 22 mm coverslip</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tryptone</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto yeast extract</td><td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Generic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Deionized water (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipettes</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4&middot;7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

meting van zuurstof verbruik in intact caenorhabditis elegans

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

Optimale mitochondriale functie is essentieel voor gezonde cellulaire activiteit, met name in de cellen met hoge energie eisen zoals die in het zenuwstelsel en de spieren. Overeenstemming met dit, mitochondriale dysfunctie is in verband gebracht met een groot aantal neurodegeneratieve ziektes en veroudering in het algemeen. Caenorhabditis elegans geweest een krachtige modelsysteem voor het ophelderen van de vele fijne kneepjes van mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling is een sterke indicator van mitochondriale functie en onlangs ontwikkelde respirometers bieden een state-of-the-art platform voor het meten van de ademhaling in cellen. In dit protocol bieden wij een techniek voor het analyseren van de live, intact C. elegans. Dit protocol omvat een periode van ~ 7 dagen en bevat stappen voor het (1) groeien en synchronisatie van C. elegans, (2) voorbereiding van verbindingen worden geïnjecteerd en hydratatie van de sondes, (3) drug laden en cartridge evenwichtsinstelling, (4) voorbereiding van worm assay plaat en test uitvoeren, en (5) na experiment data-analyse.

Met behulp van het protocol die hierin worden beschreven, OCR van wild type dieren en drie verschillende sel-12 mutant stammen werden bepaald. Sel-12 codeert de C. elegans ortholog presenilin17. Mutaties in menselijke presenilin zijn de meest voorkomende genetische aberratie in verband met de ontwikkeling van familiale van Alzheimer18. Onze studies hebben aangetoond verhoogde mitochondrial calciumgehalte in sel...

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitochondriale functie is van cruciaal belang voor cellulaire homeostase en zuurstofverbruik is een beslissende indicator van mitochondriale gezondheid. Dit protocol geeft gedetailleerde instructies voor het analyseren van het zuurstofverbruik in C.elegans. Dit protocol maakt gebruik van live, mobiele C.elegans die een wettelijke meting van mitochondriale functie.Het verhogen van de noodzaak om mitochondriën te isoleren, een stap die potentieel effect kan hebben op zijn integriteit. Om te beginnen, breng L4 larven van gewenste genetische achtergronden over op een vers ingezaaid gazon van Escherichia coli op nematode groeimedia of NGM-platen. Gebruik voor elke stam ten minste twee platen van 100 mm of drie platen van 60 mm.Broed de wormen drie tot vier dagen bij de juiste groeitemperatuur, of totdat de platen zijn geconcentreerd met een groot aantal eieren en gravidwormen. Was de eieren en wormen van de platen met ongeveer 6 milliliter M9 buffer per 100 millimeter plaat van aaltjes. Met behulp van glazen weide pipetten, breng de eieren en wormen in individuele 15 milliliter centrifuge buizen voor elke stam.Draai de buizen van de stellingen drie minuten naar beneden op 6, 180 g. Na centrifugatie, aspirate uit de M9 buffer behoud van alleen het dier en ei pellet. Voeg drie tot vier milliliter bleekmiddel oplossing aan elke buis en met tussenpozen vortex gedurende zes minuten.Voeg vervolgens M9-buffer toe om elke buis te vullen en draai gedurende een minuut op 6, 180 g. Aspirate de supernatant en herhaal deze was met de M9, drie keer. Verplaats na de was de eierpellet naar een verse buis van 15 milliliter met ongeveer negen milliliter M9-buffer.Synchroniseer de vers uitgebroede wormen door 16 tot 48 uur te nuteren bij 20 graden Celsius. Na het spinnen van deze buizen naar beneden op 6, 180 g gedurende 1,5 minuten, zet de gesynchroniseerde L-1 dieren neer op een vers ingezaaid gazon van OP50 op individuele NGM platen. Houd de platen op 20 graden Celsius totdat de dieren na ongeveer 42 uur het larvale stadium van L-4 bereiken.Gebruik op dit moment een platina pick om de L4 larven te verplaatsen naar OP50 gezaaide NGM-platen met 0,5 milligram per milliliter FUdR om te voorkomen dat het nageslacht produceert. Hydrateer de sensorcartridge door 200 microliter gedestilleerd water aan elke put op de plaat toe te voegen, zodat de sensorsondes onder water komen te staan. Bewaar de platen 's nachts op kamertemperatuur.Schakel het verwarmingselement in de respirometer-interface uit. Het opslaan van de machine in een 15 graden Celsius incubator verlaagt de kerntemperatuur in de machine en voorkomt dat de dieren oververhit raken tijdens de test. Na nachtelijke incubatie, pipet uit en gooi het gedestilleerde water gebruikt om de sensor sondes hydrateren, en vervang het door 200 microliters van de calibrant oplossing in elke put.Verdun de FCCP-voorraadoplossing tot 100 micromolar FCCP in gedestilleerd water. Voeg vervolgens 20 microliter van de verdunde oplossing toe aan injectiepoort A in de sensorcartridge. Voeg 22 microliter van 400 millimolar natriumanikides toe aan injectiepoort B van de sensorcartridge.Zet nu de respirometer aan. Selecteer start op het startscherm en de sjabloonpagina's worden weergegeven. Selecteer op de pagina sjablonen leeg of een eerder ontworpen sjabloon.De groepspagina wordt weergegeven. Selecteer op de groepspagina de putten A en H als achtergrondputten en wijs de resterende zes putten toe aan geschikte groepen volgens het experimentele plan. Toegang tot de protocolpagina door op de pijl rechtsonder te klikken en ervoor te zorgen dat de knop gelijk, basaal en injecties één en twee worden geselecteerd.Pas het aantal metingen van basale OCR aan, evenals maximale OCR en niet-mitochondriale OCR. Selecteer de pijl rechtsonder. Er verschijnt een prompt om de sensorcartridgeplaat te laden.Zorg ervoor dat de sensorcartridgeplaat in de juiste richting wordt geladen en volg de instructies op het herinneringspromptscherm. De respirameter zal nu de cartridge in evenwicht brengen. Voeg 200 microliter M9 buffer in elk van de acht putten en de omliggende reservoirs van de celplaat.Kies ongeveer 100 wormen van elke stam op ongeplaatste NGM-platen en laat twee tot drie minuten rusten. Maak vervolgens het einde van de platina pick met M9-buffer nat en kies 20 leeftijdsgesynchroniseerde dieren in putten B tot en met G, waardoor de achtergrondputten A en H leeg blijven. Klik nu op OK op de respirometersoftware om de plaat met kalibratiebuffer uit te werpen.Haal de plaat uit de respirometer, waardoor de sensorcartridge in het instrument blijft zitten. Vervang de remklauwplaat door de plaat met de dieren. Laad platen en sluit de deur door te raken blijven en laat de test te lopen.Zodra de test is voltooid, volg de aanwijzingen op het scherm om de celplaat en sensorcartridge te verwijderen. Plaats een flashdrive in de USB-poort om de run data war-indeling op te slaan. Verwijder de sensorcartridge en laat de dieren zich ongeveer twee minuten tot de bodem van de putten nestelen.Plaats de celplaten onder een stereoontledenmicroscoop en tel het aantal dieren per put. Open de analysesoftware, gevolgd door het normalisatietabblad, om het zuurstofverbruik te normaliseren tot het aantal dieren. Pas de juiste niveaus toe voor de verschillende groepen onder het tabblad Wijzigen en exporteer het bestand als prismabestand voor verdere analyse.Het gemiddelde van de eerste vijf metingen is de basale OCR. Het gemiddelde van de vijf metingen na FCCP toevoeging is de maximale OCR. Ten slotte is het gemiddelde van de laatste vijf metingen na natriumadetoevoeving de niet-mitochondriale ademhalingssnelheid.Aangezien calciumontregeling kan leiden tot een veranderde mitochondriale functie, werd OCR bij zowel de sel-12 mutanten als wilde diersoorten gemeten om het effect van sel-12 mutaties op mitochondriale functie en gezondheid te onderzoeken. Wilde diersoorten vertoonden consequent basale OCR-tarieven van minder dan vijf picomoles per minuut, per worm. Terwijl alle drie stammen van sel-12 mutanten significant verhoogde OCR, van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm toonden.Na de toevoeging van FCCP, was er een toename van de OCR van wilde type, evenals sel-12 mutanten, zoals verwacht. Wilde diersoorten toonden een maximale OCR van ongeveer zeven picomoles per minuut, per worm. Terwijl sel-12 mutanten OCR van ongeveer 10 picomoles per minuut hadden, per worm.Gebruik levende, goed gevoede en asynchroniseerde dieren in deze test, en vermijd de overdracht van eieren of karkassen in assay putten. Bovendien mag de interne temperatuur van het instrument niet hoger zijn dan 25 graden Celsius. Bleekmiddel, FCCP, FUdR en natriumadium zijn giftig.Daarom moet ervoor worden gezorgd dat beschermende handschoenen worden gedragen tijdens de voorbereiding van voorraadoplossingen en het laden van drugs.

measurement-oxygen-consumption-rates-intact-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit document beschrijft hoe u continue-stroom hypoxie kamers te gebruiken om atmosferen met bepaalde concentraties van O...

Het creëren van Defined Gasvormige omgevingen om de gevolgen van hypoxie Studie naar<em&gt; C. elegans</em

In deze video laten we een methode zien om een ontwikkelingsgesynchronleerde populatie steriele volwassen C. elegans teproduceren. Het voorbeeldprotocol synchroniseert wormen om zuurstofverbruik bij levende dieren te bestuderen.

Nematodensynchronisatie: een methode om populaties wormen in identieke stadia van ontwikkeling te verkrijgen

C. elegans is een nuttig model voor het bestuderen van de effecten van ethanol op het gedrag. We presenteren een gedragstest die de effecten van ethanol op de bewegingssnelheid van kruipende wormen kwantificeert; zowel de initiële gevoeligheid als de ontwikkeling van acute functionele tolerantie voor ethanol kunnen met deze test worden gemeten.

Een test voor het meten van de effecten van ethanol de voortbeweging Snelheid<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om signaaltransductieroutes te bestuderen die betrokken zijn bij oxidatieve stressresistentie. Hier bieden we een protocol om oxidatieve stressresistentie van C. elegans dieren in vloeibare fase te meten, met behulp van verschillende oxiderende agentia in 96-wells platen.

Het meten van oxidatieve stress Weerstand van<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In 96-well microtiterplaten

In dit document wordt een methode voor het meten van zuurstofverbruik met behulp van hoge-resolutie respirometrie in permeabel thoraxes van Drosophila beschreven. Deze techniek vereist een minimale hoeveelheid weefsel in vergelijking met de klassieke mitochondriale isolatie-techniek en de verkregen resultaten meer fysiologisch relevant zijn.

Meting van mitochondriale zuurstofverbruik in permeabel vezels van Drosophila met minimale hoeveelheden weefsel

Het meten van veranderingen in de stofwisseling staat centraal in het begrijpen van de progressie van verschillende ziektes en veroudering. Hier presenteren we een nieuwe techniek voor het meten van de hele hoofd zuurstofverbruik dat nauwer lijkt op de fysiologische toestand en kan steun bij het openbaren van nieuwe medicijnen die mitochondriale activiteit wijzigen.

Meten en interpreteren van zuurstof verbruik geheel vliegen hoofd segmenten

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Caenorhabditis elegans dienen als een uitstekend modelsysteem met robuuste en goedkope methoden voor het onderzoeken van de gezondheid, levensduur en veerkracht tegen stress.

Onderzoek naar goedkope methoden om levensduur en gezondheid te meten in Caenorhabditis elegans

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster.  Het verbruik van O2 per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer zuurstofverbruik meten in intacte Caenorhabditis elegans voor mitochondriale functieanalyse. Deze methode analyseert basale en maximale zuurstofconsumptie zonder mitochondriën te isoleren.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen