Name: Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer longitudinale intravital beeldvorming van hersentumorcellen voor oncologisch onderzoek bij muizen. Deze methode toont migratie, invasie en proliferatie aan voor en na chirurgische biopsie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Anko de Graaff en het Hubrecht Imaging Center voor hun beeldvormings ondersteuning en Ellen Wehrens en Hannah Johnson voor het lezen en bewerken van het manuscript.

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het dierenwelzijns Comité van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen, Nederland. De experimentele protocollen die in dit manuscript worden gebruikt, zijn goedgekeurd door de Centrale Commissie dierproeven (CCD) en het instantie voor dierenwelzijn (IvD).
1. tumor Cell implantatie en craniale Imaging Window voorbereiding
<ol><li>Chirurgische voorbereiding
	<ol>
<li>Gebruik volwassen muizen (> 6 weken oud) van elke stam of geslacht. Sedate een muis door te injecteren (fluanisone [neuroleptic] + fentanyl [Opioid]) (0,4 mL/kg) + benzodiazepine kalmerend (2 mg/kg) in een dosis van 1:1:2 in steriel water. Beoordeel de sedatie toestand van het dier met teen pinch. Opmerking: in dit protocol werden zowel vrouwelijke als mannelijke C57BL/6 muizen gebruikt als gevolg van dezelfde genetische achtergrond van de tumor cellijn gebruikt in deze experimenten (GL261). De muis blijft volledig verdoofd voor 1,5 h. alternatief, gebruik inhalatie anesthesie zoals Isofluraan (1.5% – 2% Isofluraan/O2 mengsel).</li>
		<li>Monteer de muis op een Stereotactisch frame en bevestig het hoofd met behulp van een neusklem en twee gehoor stangen.</li>
		<li>Gebruik een verwarmings lamp om de lichaamstemperatuur te behouden. Verwarmings lamp moet met voorzichtigheid worden gebruikt, als alternatief kunnen ook water Recirculerende verwarmings pads worden gebruikt.</li>
		<li>Breng oogzalf aan om het hoornvlies van de muis te beschermen tegen drogen.</li>
		<li>Gebruik een scherpe schaar om de vacht op de schedel te scheren (ruggedeelte van de ogen van de muis naar de basis van de schedel) en Desinfecteer de blootgestelde huid met 70% ethanol.</li>
		<li>Snijd de huid op een cirkelvormige manier met een scherpe schaar en schrael het periosteum eronder met een wattenstaafje. Breng een druppel lidocaïne 1% + adrenaline 1:100000 voor 5 min, en verwijder de overmaat met een wattenstaafje.</li>
		<li>Lijm de randen van de huid aan de schedel met Cyanoacrylaat lijm.</li>
		<li>Plaats het stereotactische frame onder een dissectie stereomicroscoop met 4x vergroting.</li>
		<li>Visualiseer de schedel door de dissectie-Microscoop en boor een cirkelvormige groef van 5 mm in diameter over het rechter pariëtale bot. Voer deze stap zorgvuldig en alleen oppervlakkig uit, Vermijd elke druk op de schedel.</li>
		<li>Breng een druppel cortex-buffer aan (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glucose, 10 mM HEPES-buffer, 2 mM MgSO4en 2 mm CACL2 [pH 7,4]) en til de botflap met dunne Tang.</li>
		<li>Voor de volgende stappen, houd het hersen oppervlak bedekt met cortex buffer tenzij anders aangegeven.</li>
		<li>Visualiseer het hersen oppervlak onder de dissectie-Microscoop en verwijder de dura mater met gebogen, taps toelopende, zeer fijne punt pincet. Als er een bloeding optreedt in dit stadium, gebruik dan een absorbabele gelatine spons om het te stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Tumor celinjectie
	<ol>
<li>Respendeer de gewenste hoeveelheid fluorescerende tumorcellen in ~ 3 μL PBS (bijv. voor de in dit protocol getoonde experimenten werden 1 x 105 GL261 cellen geïnjecteerd). Opmerking: Hoewel een fluorescerende marker kan worden gebruikt, wordt een nucleaire marker sterk aangeraden om individuele tumorcellen bij te houden tijdens de analyse. Daarnaast kan een met Histon verbonden fluorescerende marker, zoals H2B, worden gebruikt om chromosoom condensatie te visualiseren en zo de celdeling te bewaken. Het gebruik van een foto-schakelbaar marker, zoals Dendra2, maakt het mogelijk de foto-markering en het volgen van tumorcellen over meerdere dagen4,13.</li>
		<li>Laad de tumorcellen in een 10 μL gasdichte spuit met een punt stijl 2 naald en bevestig deze op de stereotaxic manipulator arm.</li>
		<li>Verwijder de cortex-buffer. Plaats de punt van de spuit in het midden van de craniotomie en steek deze op een diepte van 0,5 mm van het oppervlak van de schedel. Optioneel, maak een kleine ruimte in de hersenen om tegemoet te komen aan de tumor celsuspensie. Plaats hiervoor de spuit tot een diepte van 1 mm en haal deze vervolgens tot 0,5 mm voor de injectie.</li>
		<li>Breng een druppel cortex-buffer aan.</li>
		<li>Injecteer de celsuspensie langzaam met een micro spuitpomp injector (250 – 400 nL/min). Verwijder de spuit en gebruik een absorbabele gelatine spons om eventuele bloedingen te stoppen, indien nodig.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van het craniale beeldscherm
	<ol>
<li>Verwijder de cortex-buffer en plaats een druppel siliconenolie op de craniotomie-plaats om luchtbellen onder het raam te voorkomen.</li>
		<li>Seal de blootgestelde hersenen met een 6 mm coverslip. Breng Cyanoacrylaat lijm aan tussen de dekslip en de schedel. Druk zachtjes op de Afdeklijst tegen de schedel met behulp van fijne pincet om een minimale afstand tussen de hersenen en de dekslip te garanderen.</li>
		<li>Breng tandheelkundige acryl cement op het oppervlak van de schedel, bedekt de rand van de dekslip. Plaats een dunne roestvrijstalen ring (1,5 mm in buitendiameter, 1 mm in binnendiameter) rond de craniotomie en laat het tand cement drogen. Voeg desgewenst wat lijm aan de rand toe om de ring op de bovenkant van het hoofd vast te zetten. Opmerking: dit hoofd fixatiesysteem is optimaal voorbeeld vorming op een omgekeerde Microscoop: kleine magneten ingebed in de Imaging Box vergemakkelijken de craniale Imaging Window (CIW) fixatie. In de experimenten die in dit protocol worden getoond, werd een omgekeerde Microscoop gebruikt. Voor rechtopstaande microscopen kan fixatie worden bereikt door middel van een staaf of een ring met groeven die aan de Microscoop kunnen worden bevestigd met behulp van schroeven of een plaat die bij de ring past.</li>
		<li>Voor pijnbestrijding, Injecteer een enkelvoudige dosis van 100 μg/kg buprenorfine subcutaan en laat het dier te herstellen op een verwarmingskussen.</li>
		<li>Plaats de muis in een individuele kooi met versnipperd papier voor verrijking. Bewaak de muis dagelijks gedurende de eerste paar dagen en 2x per week, daarna, voor normaal gedrag, reactiviteit en uiterlijk.</li>
	</ol></li>
</ol>2. intravital beeldvorming
Opmerking: het tijdsinterval tussen de tumor celinjectie en de eerste intravital Imaging sessie is afhankelijk van het type tumor cellijn gebruikt. Voor de experimenten die in dit protocol worden getoond, werden 1x 105 GL261 cellen geïnjecteerd en 10 dagen later afbeelding gemaakt.
<ol><li>Voorbereiding van Imaging
	<ol>
<li>Sedate de muis met behulp van Isofluraan inhalatie anesthesie door middel van een gezichtsmasker (1.5% – 2% Isofluraan/O2 mengsel).</li>
		<li>Injecteer de muis subcutaan met 100 μL zout buffer om uitdroging te voorkomen. Opmerking: voor langdurige beeldvorming kan de muis worden gehydrateerd door middel van een subcutane infusiepomp.</li>
		<li>Plaats de muis face-up in een Imaging box. Gebruik een metalen plaat met een gat met 1 mm diameter en kleine magneten rond het diafragma om de CIW te fixeren op de beeldvormings doos. Introduceer Isofluraan via een gelaatsmasker en ventileren door een uitlaat aan de andere kant van de doos (0,8% – 1,5% Isofluraan/O2 mengsel). Gebruik desgewenst tape om de hoofdtekst van de muis vast te stellen. Opmerking: op dit punt kan het fluorescently gelabeld dextran voor bloedvat visualisatie of andere kleurstoffen intraveneus worden geïnjecteerd.</li>
		<li>Gebruik desgewenst een Pulse Oximeter en een verwarmings sonde om de Vitals van de muis te bewaken. Opmerking: in dit experiment was het niet nodig om een Pulse Oximeter en een verwarmings sonde te gebruiken, omdat de muis gedurende de beeldvormings periode stabiel was (2 – 3 uur). Voor langere beeldvormings tijden kan echter een grondige controle nodig zijn.</li>
		<li>Stel de water doelstelling 25x (bijv. HCX IRAPO NA 0,95 WD 2,5 mm) in op de laagste z-positie en voeg een grote druppel water toe. Opmerking: het gebruik van een water onderdompeling micro dispenser wordt sterk aangeraden voor lange termijn experimenten, omdat het wetenschappers in staat stelt om water toe te voegen tijdens het experiment. U ook een droge doelstelling gebruiken.</li>
		<li>Breng de beeldvormings doos over op de Microscoop die is uitgerust met een donkere klimaatkamer die op 37 °C wordt gehouden. Breng de doelstelling naar de CIW afdek tot de waterdruppel raakt.</li>
		<li>Observeer de tumor via het oculair met behulp van de epifluorescentie-modus en breng de cellen scherp.</li>
	</ol></li>
	<li>Time-lapse-beeld verwerving
	<ol>
<li>Selecteer verschillende posities van belang voor de afbeelding en noteer hun coördinaten in de software. Zorg ervoor dat de geselecteerde posities representatieve posities zijn van verschillende plaatsen van de tumor (elke tumor kan verschillend zijn, maar om consistentie te garanderen, selecteert u dezelfde hoeveelheid posities die centraal staan in de tumor kern en aan de randen over alle muizen). Opmerking: een tegel scan van een deel van de tumor of van de hele zichtbare tumor kan worden uitgevoerd; echter, als de tumor is groot, deze methode zal de time-lapse tussen de beelden te verhogen. Bovendien, als de tumorcellen snel bewegen, het kan lastig zijn om te volgen dezelfde cellen in de tijd.</li>
		<li>Schakel over naar de multiphoton-modus en stem de laser af op de juiste golflengte. Merk op dat, om foto schade te voorkomen, hogere golflengten gewenst zijn. Opmerking: voor Dendra2 Imaging werd een golflengte van 960 nm gebruikt. Met het doel dat in deze experimenten wordt gebruikt, was een zoom van 1,3 voldoende om een goede oplossing van de tumor kernen te krijgen en een representatief gebied van de tumor te scannen.</li>
		<li>Ga naar de Live-modus en definieer een z-stack voor elke positie om het maximale volume van tumorcellen verwerven zonder afbreuk te doen aan de tumor celresolutie. Definieer de stapgrootte tussen de beelden als 3 μm.</li>
		<li>Gebruik de bidirectionele modus om de scansnelheid te verhogen. De afbeeldingsresolutie moet ten minste 512 x 512 pixels zijn.</li>
		<li>Verwerven van beelden van het tumor volume op verschillende posities elke 20 min voor 2 h. Voeg water toe aan de doelstelling vóór elke beeld verwerving. Opmerking: timelapse-beelden kunnen automatisch worden verkregen door de juiste timelapse in de software in te stellen. De muis kan echter bewegen en de positie of z-stack kan in de loop van de tijd verschuiven, waardoor gegevens verloren gaan. Daarom is het raadzaam om de timelapse handmatig uit te voeren en te controleren en aan te passen voor xyz verschuivingen tussen overnames.</li>
		<li>Bij deze stap, optioneel, Photo-switch de Dendra2 fluorescerende marker. Opmerking: in tegenstelling tot time-lapse Imaging (die het mogelijk maakt het bestuderen van individuele tumorcellen eigenschappen en hoe ze veranderen na verloop van tijd), dit zal toelaten het bestuderen van het gebied van tumor cel infiltratie in de hersenen over meerdere dagen4. Een gedetailleerde uitleg van deze stap wordt beschreven door Gligorijevic et al.13.</li>
		<li>Nadat de laatste afbeelding is verkregen, verwijdert u de muis uit het werkgebied en laat u deze op een verwarmingspaneel herstellen. Om uitdroging te voorkomen, kan 100 μL zoutoplossing subcutaan worden toegediend. Plaats de muis in de kooi totdat de biopsie-achtige verwonding wordt uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
</ol>3. biopsie-achtige letsel en CIW vervanging
<ol><li>Maak een biopsie-achtige verwonding op de tumor site 1 dag na de eerste Imaging sessie. Opmerking: als alternatief kan een andere procedure, zoals gedeeltelijke tumor verwijdering, worden uitgevoerd.<ol>
<li>Sedate de muis met behulp van Isofluraan inhalatie anesthesie zoals eerder beschreven in stap 2.1.1. Opmerking: terwijl injecteerbare anesthesie kan worden gebruikt, deze procedure is korter dan de CIW implantatie, en inhalatie anesthesie maakt het mogelijk om nauwkeurig te controleren en te verminderen de tijd die de muis blijft verdoofd.</li>
		<li>Plaats de muis op een stereotaxic frame en bevestig de kop met twee gehoor stangen en een neusklem. Controleer de diepte van de anesthesie door het gebrek aan pedaal reflexen. Gebruik een verdoving masker voor stereotaxus chirurgie te houden van de muis verdoofd tijdens de procedure.</li>
		<li>Dompel een wattenstaafje in aceton en verdeel het rond de rand van de dekslip om de lijm te verzachten die de dekslip tegen de hersenen vasthoudt.</li>
		<li>Schuif de dunne punt Tang onder het dekglaasje om hem op te tillen. Als de dekslip op dit punt breekt, gebruik dan de tang om de stukjes glas te verwijderen.</li>
		<li>Breng cortex buffer om de hersenen vochtig te houden.</li>
		<li>Dompel een 25 G naald in de tumor tot een diepte van 1 mm. Verwijder de naald en stop het bloeden, indien nodig, door het aanbrengen van een gelatine steriele spons. Opmerking: deze stap kan worden uitgevoerd onder een fluorescerende stereomicroscoop om het tumor gebied nauwkeuriger te identificeren (als de tumor te klein is). Bovendien kan een 1 μL oplossing van fluorescerende polystyreen 1 μm kralen worden geïnjecteerd tijdens de punctie om het biopsied gebied te identificeren.</li>
		<li>Verzegel het hersen oppervlak met siliconenolie en lijm een 6 mm dekslip op de bovenkant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. herhaalde beeldvorming
<ol><li>Een dag na het toebrengen van de biopsie-achtige letsel (en op opeenvolgende dagen indien nodig), herhaal intravital beeldvorming zoals beschreven in stap 2 hierboven om te beoordelen hoe het tumor Celgedrag verandert na verloop van tijd. Selecteer verschillende posities van de tumor die representatief zou zijn voor het hele tumor gebied. Opmerking: als fluorescerende kralen werden gebruikt om het biopsied gebied te identificeren, lokaliseer ze naar beeld tumor Celgedrag in de biopsied regio's in vergelijking met niet-biopsied regio's.</li>
</ol>5. beeldanalyse
<ol><li>Als de timelapse-afbeeldingen handmatig zijn verkregen, combineert u deze in één map.<ol>
<li>Open de time-lapse LIF-bestand in de commerciële software die is gekoppeld aan de Microscoop (bijvoorbeeld LasX of LAS AF). Selecteer het tabblad proces &Gt; proces hulpmiddelen > samenvoegen. Selecteer de eerste afbeelding van de tijdreeks en klik op eerste. Selecteer de tweede afbeelding van de tijdreeks en klik op tweede. Selecteer bij samenvoegings dimensies t voor tijd. Klik op toepassen. Er wordt een nieuw bestand met twee tijdspunten gegenereerd. Herhaal dit proces voor alle tijdspunten, met behulp van het nieuw gegenereerde bestand als de eerste afbeelding van de reeks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrigeer de verworven z-stacks voor elke xyz -verschuiving. Opmerking: voor de experimenten die in dit protocol worden beschreven, is een speciaal ontworpen Visual Basic-softwareprogramma gebruikt voor correctie. U ook andere beschikbare software gebruiken, zoals ImageJ of Imaris.<ol>
<li>Exporteer de TIFF-bestanden van de software door met de rechtermuisknop op het samengevoegde time-lapse-bestand te klikken. Selecteer onbewerkte gegevens opslaan. De geëxporteerde bestanden worden geëxporteerd naar één map met de naam op basis van het kanaal, de tijd en de z-positie.</li>
		<li>Open de TIFF-bestanden in het speciaal ontworpen Visual Basic-softwareprogramma.</li>
		<li>Definieer het aantal tijdpunten, z-stacks en kanalen.</li>
		<li>Wijs een kleur toe aan elk kanaal door de volgorde van weergave.</li>
		<li>Corrigeer in het deelvenster formulier weergeven voor elk tijdpunt de verschuiving in de z door op de knoppen omhoog (U) of omlaag (D) te klikken.</li>
		<li>Selecteer in het deelvenster Intravital Image Building het kanaal dat moet worden gebruikt om de XY -verschuiving te corrigeren. Selecteer het groene kanaal om te corrigeren, op basis van het signaal van de tumorcellen. Klik op automatisch voor XY -correctie.</li>
		<li>Exporteer de gecorrigeerde afbeeldingen als een maximale projectie van drie opeenvolgende z-stacks. In de deelvenster selectieintroduceert u de nummers van de eerste (begin) en de laatste (eind) z-segmenten die u wilt exporteren. Selecteer Max. Selecteer afzonderlijke mappen voor Z. Klik op do. Voor elk van deze, drie z-stacks, time-lapse-beelden worden geëxporteerd naar een aparte map.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optioneel, correct voor de weefsel elastische vervorming. Opmerking: voor weefsel elastische vervorming experimenten, een match motion compensatie softwareprogramma werd gebruikt om te corrigeren voor stijve en elastische weefsel vervorming14.</li>
	<li>Volg enkele cellen in de volledige z-stack in de time-lapse-film. Opmerking: tumor cellen kunnen handmatig worden bijgehouden met bijvoorbeeld een ImageJ-plugin (MTrackJ). Hoewel nauwkeurig, dit is beperkt tot het XY -vlak en is zeer tijdrovend. Als alternatief, tumorcellen kunnen automatisch worden bijgehouden in het volledige z-volume, met behulp van tumor celsegmentatie (bv, imaris software). Echter, in zeer dichte tumoren, geautomatiseerde tracking is minder nauwkeurig en kan aanleiding geven tot meer tracking fouten.<ol>
<li>Open en volg elke time-lapse-serie (voor drie opeenvolgende z-stacks) afzonderlijk. Sleep de map met de timelapse-afbeeldingen naar ImageJ.</li>
		<li>Selecteer het tabblad Plugins > Tracking > mtrackj. Volg elke afzonderlijke cel door toevoegen te selecteren en te klikken op elke cel op elk tijdpunt.</li>
		<li>Pak de meting van de tracks uit door op meten te klikken en het bestand op te slaan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+cancer+genome+diagnostics+for+routine+clinical+use%3A+overcoming+the+roadblocks+to+personalized+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine.</a> Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).</li>
<li>van Malenstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+obtained+by+needle+biopsy+gives+additional+information+on+the+prognosis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).</li>
<li>Kretschmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+in-transit+metastases+after+sentinel+node+biopsy+in+patients+with+melanoma+%28Br+J+Surg+2004%3B+91%3A+1370-1371%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371).</a> British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+inflammation+inhibits+biopsy-mediated+changes+in+tumor+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior.</a> Scientific Reports. 7, 7529(2017).</li>
<li>Hobson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+induced+by+the+biopsy+of+mouse+mammary+tumors+promotes+the+development+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+Treatment%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis.</a> Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).</li>
<li>Weil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microtubes+convey+resistance+to+surgical+lesions+and+chemotherapy+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas.</a> Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).</li>
<li>Parsa, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+intracranial+dissemination+of+glioblastoma+multiforme+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults.</a> Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).</li>
<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31, 602-606 (2013).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4, 158ra145(2012).</li>
<li>Schreurs, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Multi-Parametric+Magnetic+Resonance+Imaging+of+Tumor+Response+to+Photodynamic+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy.</a> PLOS ONE. 11, e0165759(2016).</li>
<li>Nielsen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+tumor+neovascularization+in+a+transgenic+mouse+model+with+a+novel+64Cu-DOTA-knottin+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide.</a> Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+therapy+with+cytotoxic+mesenchymal+stromal+cells+optimized+by+bioluminescence+imaging+of+tumor+and+therapeutic+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response.</a> PLOS ONE. 7, e35148(2012).</li>
<li>Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendra2+photoswitching+through+the+Mammary+Imaging+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window.</a> Journal of Visualized Experiment. (28), e1278(2009).</li>
<li>Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoordmans%2C+HJ+%22Registration+and+analysis+of+in+vivo+multispectral+images+for+correction+of+motion+and+comparison+in+time%22">Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time</a>. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 106014(2011).</li>
<li>Kirkpatrick, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+resonant+scanning+multiphoton+microscopy%3A+An+emerging+technique+for+intravital+imaging+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment.</a> IntraVital. 1, (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een methode om veranderingen in het tumor Celgedrag op een enkel celniveau te bestuderen in reactie op invasieve chirurgische ingrepen, zoals een biopsie, in de hersenen van een levend dier. De combinatie van longitudinale multiphoton-beeldvorming met de chirurgische implantatie van een chronische CIW maakt de kwantificering van tumor Celmigratie, invasie en proliferatie voor en na biopsie in hetzelfde dier4mogelijk. In vergelijking met andere benaderingen die worden gebruikt voor Multi Day monitoring van de tumor, zoals bioluminescente beeld12, MRI10, of PET/CT11, visualiseert deze methode op unieke wijze tumoren op één celniveau en geeft zo inzicht in cellulair gedrag onderliggende tumorprogressie.
Om deze methode met succes uit te voeren, moeten verschillende procedures worden beheerst. De meest kritieke stappen van dit protocol zijn CIW implantatie en vervanging. De technische complexiteit van deze stappen vereist precisie en chirurgische vaardigheden die kunnen worden verworven met een stabiele training. Complicaties tijdens een CIW-operatie, zoals bloedingen die het hersen oppervlak kunnen bedekken, kunnen een uitdaging blijken voor latere beeldvorming. Een gebrek aan steriele gereedschappen of omgeving, evenals het falen om het hersen oppervlak volledig te verzegelen, kan een infectie op het hersen oppervlak veroorzaken (witte vloeistof onder de dekslip), waardoor Imaging problematisch wordt en het resulterende Interpretatie. Een ander veelvoorkomend probleem van dit protocol is de beweging van dieren tijdens de time-lapse-beeldvorming. Hoewel elke xyz -verschuiving kan worden gecorrigeerd na het experiment, wordt het aanbevolen om de coördinaat van elke positie vóór elk tijdspunt te corrigeren om verlies van informatie te voorkomen. Weefsel vervorming is een bijkomend probleem bij beeldvorming op een omgekeerde Microscoop. Hersenweefsel lijdt aan compressie wanneer de muis in liggende positie wordt geplaatst. Afhankelijk van de mate van weefsel vervorming, tumor cel tracking kan leiden tot een foutieve kwantificering van celverplaatsing. Om dit te voorkomen, kan een software voor stijve en elastische vervorming worden gebruikt14.
Terwijl deze procedure biedt een brede toepassing voor het bestuderen van veranderingen in tumor gedrag, bepaalde beperkingen moeten worden overwogen. Deze methode stelt wetenschappers in staat om beeld tot een diepte van 1,6 mm (met het gebruik van een optische parametrische oscillator); Dit betekent echter dat Imaging beperkt is tot oppervlakkige hersenschors gebieden15. Zo, sommige hersentumoren gelegen in diepe hersenstructuren, met inbegrip van diffuse intrinsieke Pontine gliomen gelegen in de hersenstam regio, kan niet worden bestudeerd in hun oorspronkelijke hersen omgeving met dit protocol. Een andere beperking van dit protocol is het volume van de tumor die kan worden gefotografeerd. Hoewel totale tumor volume Scanning gewenst is om maximale informatie te verkrijgen, vaak, tumorgrootte en de snelheid van de migratie cellen kan beperkende factoren zijn. Voor elk type tumor moet een optimale timelapse voorbeeld vorming overwogen worden. Als het tijdsbestek tussen de beelden te lang is, het kan moeilijk zijn om de tumorcellen te volgen. Het gebruik van een resonante scanner kan de scantijd sterk verkorten, waardoor de beeldvorming van een grotere tumor16mogelijk wordt. Ten slotte kan de handmatige beeldanalyse van dit protocol zeer tijdrovend zijn, dus in plaats daarvan kunnen Programma's voor geautomatiseerde 3D-tracking worden gebruikt. Het resultaat van het volgen moet echter altijd visueel worden bewaakt, omdat algoritmen voor geautomatiseerde celtracking zelden zijn ontworpen om exact de migratie van de cellen van belang te recapituleren.
Lichte aanpassingen van het hier beschreven protocol kunnen een nog breder scala aan toepassingen mogelijk maken. In plaats van het uitvoeren van biopsies, andere (chirurgische) interventies kunnen worden uitgevoerd, zoals gedeeltelijke tumorresectie of de levering van chemotherapie wafers. De toevoeging van verbindingen via een chirurgisch geïmplanteerde micro tube kan worden gecombineerd met dit protocol om farmacologisch gericht te zijn op specifieke moleculen van belang. We verwachten dat dit model nuttig zal zijn in studies gericht op het analyseren van de impact van een bepaalde interventie op tumor Celgedrag. De mogelijkheid van het uitvoeren van herhaalde maatregelen in hetzelfde dier biedt niet alleen nauwkeurigere gegevens over veranderingen die zich voordoen in de tumor, maar vermindert ook het aantal proefdieren dat nodig is per studie.

Standaard van de zorg voor de meeste solide tumoren omvat weefsel biopsie voor diagnose, prognose, en gepersonaliseerde behandeling bepaling1,2. Over het algemeen geven deze procedures klinisch voordeel, maar recent bewijs geeft aan dat biopsie en andere meer invasieve procedures, zoals tumorresectie, ook negatieve invloed kunnen hebben op de tumorprogressie3,4,5 , 6. Hoewel deze procedures onmisbaar blijven in de patiëntenzorg en hun voordelen hun negatieve effecten overwinnen, is het noodzakelijk om de mechanismen achter deze negatieve effecten volledig te begrijpen om de veiligheid van de patiënten en de positieve invloeden van deze procedures en maken ze nog meer klinisch nuttig.
Biopsie-gemedieerde ongewenste effecten op de progressie van de tumor worden veroorzaakt door systemische veranderingen en veranderingen in de tumor micro omgeving in reactie op weefsel verstoring4,5. Daarom is het noodzakelijk om dit proces in levende dieren te bestuderen. De subtiele gevolgen van deze minimaal invasieve ingrepen kunnen echter vaak worden vermomd door grote variaties tussen individuen. Conventionele methoden op basis van Immunohistochemie of transcriptionele expressie analyse kunnen deze effecten vergeten of grote aantallen dieren vereisen om ze te identificeren. Bovendien, deze statische benaderingen ontbreekt het vermogen om te identificeren van veranderingen in tumor Celgedrag zoals migratie en invasie, dynamische processen die correleren met tumor maligniteit. Deze tumor cel kenmerken zijn van bijzonder belang voor zeer agressieve hersentumoren, zoals multiform glioblastoom multiforme (GBM), waar de lokale verspreiding van tumorcellen beperkt chirurgische resectie en vermindert patiënt overleving7. Om volledig te begrijpen hoe biopsieën het gedrag van GBM-cellen beïnvloeden, is een longitudinale benadering nodig die het mogelijk maakt om deze cellen in de fysiologische context van levende organismen te visualiseren.
De recente ontwikkeling van intravital beeldvorming met hoge resolutie in combinatie met chirurgisch geïmplanteerde chronische beeldvormings Vensters stelt wetenschappers in staat om het dynamische gedrag van tumorcellen in levende muizen te bestuderen over meerdere dagen8,9. Met behulp van deze krachtige aanpak, we kunnen bestuderen hoe tumorcellen proliferative, migratie, en infiltratief gedrag verandert over meerdere dagen in reactie op een biopsie in dezelfde muis. In vergelijking met andere technieken die Multi-Day monitoring van tumoren in levende muizen mogelijk maken, zoals magnetische resonantie imaging (MRI)10, positron emissie tomografie/computertomografie (PET/CT)11, of bioluminescente beeld12, dit aanpak uniek biedt de mogelijkheid van het bestuderen van de tumor cel gedrag op één cel niveau en ontraveling subtiele veranderingen die zich voordoen binnen de tumor.
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode om biopsie-achtige verwondingen en pre-en postbiopsie longitudinale intravital beeldvorming in de hersenen van tumor-dragende muizen uit te voeren. Deze methode kan mogelijk worden toegepast om andere chirurgische ingrepen te bestuderen, zoals gedeeltelijke tumorresectie of de implantatie van chemotherapie-wafers.

<table><tbody><tr><td>25g x 16 mm hypodermische naalden</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10uL SYR ZONDER NAALD</td><td>Hamilton</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>Absorbeerbare gelatine spons</td><td>Pfizer</td><td>Gelfoam</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes rond 6 mm</td><td>VWR international</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylaatlijm</td><td>Pattex</td><td>Pattex Ultra gel</td><td></td></tr><tr><td>Tandheelkundig cement</td><td>Vertex Dental</td><td>Vertex Self-Curing</td><td></td></tr><tr><td>Boor</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000 (tandheelkundige boor kan handiger zijn) + 105 Graveermes</td><td></td></tr><tr><td>Fijne gebogen pincet</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm (Fentanyl citraat 0,315 mg/ml + Fluanisone 10 mg/ml)</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td>Midazolam Actavis 5mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>Oogzalf</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxische Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Olie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxische frame</td><td>Stoelting</td><td>Lab standaard stereotaxisch, rat en muis</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch stereo microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic (0,3 mg/ml)</td><td>BD Pharmaceuticals</td><td>283732</td><td></td></tr><tr><td>Vannas T&uuml;bingen Spring Scissors</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100.000) Lokaal verdovingsmiddel</td><td>Astrazeneca</td><td>Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100.000)</td><td></td></tr></tbody></table>

longitudinale intravital beeldvorming van hersen tumor celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies zijn standaard van zorg voor de behandeling van kanker en zijn klinisch voordelig omdat ze een solide tumor diagnose, prognose, en gepersonaliseerde behandeling bepaling. Echter, perturbatie van de tumor architectuur door biopsie en andere invasieve procedures is in verband gebracht met ongewenste effecten op de progressie van de tumor, die moeten worden bestudeerd in de diepte om het klinisch voordeel van deze procedures verder te verbeteren. Conventionele statische benaderingen, die alleen een momentopname van de tumor bieden, zijn beperkt in hun vermogen om de impact van biopsie op tumor Celgedrag zoals migratie te onthullen, een proces dat nauw verwant is aan tumor maligniteit. In het bijzonder, tumor Cell migratie is de sleutel in zeer agressieve hersentumoren, waar de verspreiding van de lokale tumor maakt totale tumorresectie vrijwel onmogelijk. De ontwikkeling van multiphoton Imaging en chronische beeldvormings Vensters stelt wetenschappers in staat om dit dynamische proces in levende dieren na verloop van tijd te bestuderen. Hier beschrijven we een methode voor de hoge-resolutie longitudinale beeldvorming van hersentumor cellen voor en na een biopsie in hetzelfde levende dier. Deze aanpak maakt het mogelijk om te bestuderen van de impact van deze procedure op tumor Celgedrag (migratie, invasie, en proliferatie). Verder bespreken we de voordelen en beperkingen van deze techniek, evenals het vermogen van deze methodologie om veranderingen in het gedrag van kankercellen te bestuderen voor andere chirurgische ingrepen, waaronder tumorresectie of de implantatie van chemotherapie Wafels.

Om de impact van biopsie op hersentumor Celgedrag te beoordelen, hebben we de in dit protocol beschreven procedure uitgevoerd. Glioom — GL261 cellen — het uiten van een nucleair fluorescerende eiwit (H2B-Dendra2) werden geïnjecteerd in de hersenen van C57BL/6 muizen, en een chronische CIW werd geïmplanteerd. Time-lapse intravital beeldvorming werd uitgevoerd op hetzelfde dier pre-en post-biopsie-achtige letsel aan de tumor (Figuur 1a, B). De migratie van individuele tumorcellen werd bepaald door het migratie traject na verloop van tijd in verschillende XY -vlakken van de z-stack (figuur 1c) te volgen en te worden uitgezet als een percentage van de migratie cellen pre-en postbiopsie (Figuur 1f). Het tumor celproliferatie percentage werd gekwantificeerd op basis van H2B-Tagged Dendra2 condensatie op mitose (figuur 1d) en uitgezet als een percentage van de scheidings cellen pre-en postbiopsie (Figuur 1e). We vergeleken de verdeling van de migratiesnelheid voor en na biopsie in dezelfde tumor en ontdekten dat het aantal migratie cellen (snelheid > 4 μm/h) steeg na de interventie, met een geassocieerde afname van het aantal langzame/niet-migrerende cellen ( snelheid < 4 μm/h) (Figuur 2a). Gemiddeld per tumor, we waargenomen een 1,75 (SD = 0.16)-fold toename van het percentage van de migratie cellen wanneer een biopsie-achtige letsel werd uitgevoerd, in vergelijking met controle muizen die niet biopsied (Figuur 2b). We gecontroleerd tumor Celgedrag voor een andere week en vond dat, hoewel het percentage van de migratie tumorcellen uiteindelijk daalde in zowel de controle en de biopsied muizen, de biopsied muizen nog steeds een hogere migratie capaciteit dan de controle muizen vertoonden ( Figuur 2c). De analyse van tumorcellen proliferatief gedrag na verloop van tijd toonde een 1,52 (SD = 0.26)-fold toename van het aantal mitotische gebeurtenissen op biopsie, ten opzichte van niet-biopsied controle muizen (figuur 2D).
Om te testen of de waargenomen effecten van biopsie op tumor cel proliferatieve en migratie gedrag was een artefact als gevolg van CIW vervangende chirurgie (nodig om een biopsie-achtige letsel uit te voeren), we gecontroleerd tumor Celgedrag in een groep van muizen die onderging CIW vervanging zonder een biopsie. In deze groep, we hebben niet observeren een inductie van migratie of proliferatie van tumorcellen, wat aangeeft dat de boost in tumor celproliferatie en migratie tarieven specifiek werden veroorzaakt door biopsie-achtige letsel (Figuur 3a, B).
Stabiele foto-convertibiliteit van de fluorescerende proteïne Dendra2 zorgt voor het bestuderen van tumor cel infiltratie over meerdere dagen. Bij blootstelling aan ultraviolet/blauw licht is Dendra2 onherroepelijk overgeschakeld van groen naar rood. Met behulp van deze eigenschap, een vierkante gebied van de tumor werd verlicht en ~ 200 Dendra2-uitdrukken tumorcellen waren foto-gemarkeerd voor biopsie (Figuur 4). Een dag na de biopsie, we verplaatst de foto-geschakelde regio en gemeten het volume van tumorcellen die in het omringende tumorweefsel had geïnfiltreerd. We constateerden dat het infiltratie gebied 1,72 (SD = 0,41) keer groter was in tumoren na een biopsie-achtige verwonding in vergelijking met niet-biopsied controle tumoren (Figuur 4). Hoewel deze aanpak geeft alleen informatie over tumor Cell bulk infiltratief gedrag en niet op een enkel celniveau, het is minder tijdrovend dan de time-lapse Imaging aanpak en kan de methode van keuze voor onderzoek vragen gericht uitsluitend op het bestuderen van infiltratief gedrag.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg"> Figuur 1: experimentele opstelling voor longitudinale intravital beeldvorming van het biopsie effect op tumor Celgedrag. A) diagram dat het ontwerp van de ring en de magnetische houder weergeeft. B) Schematische weergave van de experimentele workflow. Tumor cellen worden geïnjecteerd in de hersenen van muizen en een CIW is vastgesteld. Bij tumor ontwikkeling wordt een eerste (prebiopsie) time-lapse Imaging sessie uitgevoerd. De volgende dag worden de biopsie en de CIW-vervanging geïmplementeerd. De dag na Imaging (postbiopsie), wordt een tweede time-lapse Imaging sessie uitgevoerd. Voor langetermijneffecten kunnen daaropvolgende beeldvormings sessies worden uitgevoerd. (C) beelden tonen representatieve snapshots van een time-lapse film waar GL261 H2B-Dendra2 tumorcellen werden bijgehouden. Rode lijnen verbeelden individuele tumor celsporen. De schaalbalk = 50 μm. (D) representatief in vivo timelapse-beelden die scheidings cellen weergeven in GL261 H2B-Dendra2 tumoren. Er zijn verschillende stadia van de mitose geïndiceerd: profase (P), tijdens (PM), metafase (M), anafase (a) en telophase (T). De schaalbalk = 50 μm. grafieken geven het percentage van (E) trekkende en (F) scheidings cellen voor-en postbiopsie aan. Elke stip geeft het percentage van de migratie cellen aan in alle posities die in een individueel dier worden gemeten. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. van zes muizen (* *P < 0,01, gepaarde t-toets). Dit cijfer is gewijzigd van Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg"> Figuur 2: representatieve resultaten tonen de impact van biopsie op tumor Cell migratie en proliferatie tarieven. A) waterval percelen die de verandering van de celsnelheids verdeling ten opzichte van de basale migratie in individuele muizen aantonen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± S.E.M. van vijf muizen. B) het aantal migratie cellen in de controle (blauw) en de biopsied (rode) dieren genormaliseerd naar het aantal voorbereidende interventie cellen (n = 6 muizen, * * *P < 0,0001, student t-toets). (C) tumor Celgedrag werd gedurende meerdere dagen bijgehouden. Weergegeven zijn de genormaliseerde (ten opzichte van voor interventie) aantal migratie cellen in individuele muizen na verloop van tijd (n > 4 muizen per aandoening, * * *P < 0,0001, twee richtingen ANOVA). D) het genormaliseerde aantal scheidings cellen in de controle (blauw) en de biopsied (rode) dieren. Per individueel dier werden de waarden na interventie genormaliseerd naar de waarden preinterventie (n = 5 muizen, * *P < 0,01, student t-toets). Dit cijfer is gewijzigd van Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg"> Figuur 3: de vervanging van CIW heeft geen effect op het tumor Celgedrag. Longitudinale intravital Imaging toont aan dat de vervanging van de CIW zonder biopsie geen invloed heeft op de migratie-en proliferatie percentages. A) de toename van het aantal migratie cellen voor de aangegeven voorwaarden. Elk symbool vertegenwoordigt het gemiddelde van een individuele muis en n≥ 4 muizen. B) de toename van het aantal prolifererende cellen voor de aangegeven omstandigheden. Elk symbool vertegenwoordigt het gemiddelde van een individuele muis (n≥ 4 muizen, * *p < 0,01, * * *p < 0,001, NS = niet-significante, one-way ANOVA met Newman-Keuls post hoc test). Dit cijfer is gewijzigd van Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg"> Figuur 4: diagram met de experimentele Setup en representatieve resultaten die zijn verkregen met Dendra2 Photo-switching. Om te controleren tumor Cell infiltratie op biopsie, Dendra2-uitdrukken tumorcellen zijn foto-overgeschakeld in een vierkante regio door UV/blauw licht verlichting en imaged, 1 dag voor de biopsie. Een dag na de biopsie wordt het fotoomschakelde gebied verplaatst en teruggezet. Getoond zijn representatieve Dendra2 beelden van tumor celinfiltratie, gecorrigeerd met behulp van kanaal aftrekken. De witte stippellijn staat voor het infiltratie gebied. De schaalbalk = 50 μm. De grafiek toont het grotere foto-geschakelde gebied getekend voor biopsied (rood) en Control (blauwe) muizen. Elke stip vertegenwoordigt de gemiddelde waarde van een individuele muis (n≥ 5 muizen, *P < 0,05, student t-toets). Dit cijfer is gewijzigd van Alieva et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een methode voor High-Resolution time-lapse multiphoton Imaging van hersentumor cellen voor en na invasieve chirurgische ingrepen (bijv. biopsie) binnen hetzelfde levende dier. Deze methode maakt het bestuderen van de impact van deze invasieve chirurgische ingrepen op tumorcellen ' migratie, invasief, en proliferatief gedrag op een enkel celniveau.

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Dit protocol stelt de gebruiker in staat om de impact van invasieve chirurgische ingrepen die in de kliniek worden gebruikt op tumorcelgedrag, zoals migratie, invasie en proliferatie, te bestuderen. Deze methode maakt het op unieke wijze mogelijk om dezelfde tumor voor en na een invasieve procedure te visualiseren, waardoor een inzicht wordt geboden dat kan worden gemist in een niet-longitudinale benadering. Na bevestiging van een gebrek aan respons op teen knijpen in een verdoofde volwassen muis, monteer de muis op een stereotactisch frame en zet het hoofd vast met een neusklem en twee oorbalken.Gebruik een verwarmingslamp om de lichaamstemperatuur te behouden en breng zalf aan op de ogen van het dier. Met behulp van een scherpe schaar scheer je de vacht op de schedel van de ogen naar de basis van de schedel en gebruik je 70% ethanol om de blootgestelde huid te steriliseren. Snijd de huid op een cirkelvormige manier, en gebruik een wattenstaafje om weg te schrapen de blootgestelde periosteum.Behandel het chirurgische gebied met een druppelocaïne en een concentratie van 1:100, 000 tot 000 epinephrinum gedurende vijf minuten voordat u de overtollige oplossing met een wattenstaafje verwijdert. Gebruik cyanoacrylaatlijm om de randen van de huid aan de schedel te hechten en plaats het stereotactische frame onder een dissectie-stereomicroscoop met een 4x vergroting. Boor vervolgens voorzichtig een oppervlakkige, vijf millimeter diameter, cirkelvormige groef over het rechter pariëtale bot.En breng een druppel cortex buffer aan op de groef. Gebruik dunne tangen om de botflap op te tillen om het hersenoppervlak te visualiseren en gebruik gebogen, taps toelopende, zeer fijne puntkrachten om de dura mater te verwijderen. Als bloeding optreedt, gebruik dan een absorbeerbare gelatine spons om hemostase te bereiken.Voor tumorcel injectie, belasting ongeveer drie microliters van de cellen in een vijf microliter gas-strakke spuit uitgerust met een punt stijl twee naald. Bevestig de naald op de stereotaxic manipulator arm, en verwijder de cortex buffer uit het blootgestelde weefsel. Plaats de punt van de spuit in het midden van de craniotomie en steek de naald op een diepte van 0,5 millimeter van het oppervlak van de schedel.Voeg vervolgens een druppel cortexbuffer toe aan de craniotomie en gebruik een microsyruitpompinjector om de cellen te leveren met een snelheid van 250 tot 400 nanoliter per minuut. Ter voorbereiding van de craniale beeldvorming venster, vervang de cortex buffer met een druppel siliconen olie naar de craniotomie site om luchtbellen onder het raam te voorkomen. Verzegel de blootgestelde hersenen met een zes millimeter coverslip, en breng cyanoacrylaat lijm tussen de coverslip en de schedel.Gebruik vervolgens fijne pincet om de coverslip voorzichtig tegen de schedel te drukken. Plaats de muis op het juiste experimentele moment in een beeldvormingsdoos en stel de 25x-waterdoelstelling in op de laagste z-positie. Voeg een grote druppel water toe aan het doel en breng de beeldvormbox over in de 37 graden Celsius donkere klimaatkamer van de microscoop.Breng het doel naar de craniale beeldvorming venster coverslip totdat het waterdruppel raakt de coverslip. En met behulp van de epifluorescentie modus, observeer de tumor door het oculair om de cellen in beeld te brengen. Stem de laser af op de juiste golflengte en selecteer de live-modus.Na het selecteren van verschillende posities van belang voor beeldvorming, registreren hun coördinaten in de software. Definieer een z-stack voor elke positie om het maximale volume van tumorcellen te verwerven zonder afbreuk te doen aan de resolutie van de tumorcel, met de stapgrootte tussen afbeeldingen ingesteld op drie micrometers. Verwerf vervolgens gedurende twee uur elke 20 minuten beelden van het tumorvolume op verschillende posities, waardoor water aan de doelstelling wordt toegevoegd vóór elke beeldverwerving.Nadat de laatste afbeelding is verkregen, breng je de muis over naar een verwarmingskussen met bewaking tot volledig herstel. Een dag na de eerste beeldvormingssessie beveiligt u de verdoofde muis in het stereotaxic-frame zoals aangetoond en gebruikt u een met aceton doordrenkt wattenstaafje om de randen van de coverslip af te vegen totdat de lijm wordt verzacht. Schuif een naald van 25 meter onder de coverslip en gebruik dunne punt tangen om het op te tillen, en hydrateren de craniotomie met verse cortex buffer.Prik de tumor tot een diepte van een millimeter met een naald van 25 meter, stop elke bloeding met een steriele gelatinespons en sluit het oppervlak van de hersenen af met verse siliconenolie. Lijm dan een nieuwe zes millimeter coverslip over de wond. Open voor beeldanalyse het time-lapse LIF-bestand in het microscoopsoftwareprogramma en selecteer het tabblad Proces, Proceshulpprogramma's en Samenvoegen.Selecteer de eerste afbeelding van de tijdsequentie en klik eerst. Selecteer de tweede afbeelding van de tijdsequentie en klik op de tweede. Selecteer in Afmetingen samenvoegen t voor tijd en klik vervolgens op Toepassen.Er wordt een nieuw bestand met twee tijdpunten gegenereerd. Nadat u elke time-lapse-serie voor drie opeenvolgende z-stacks afzonderlijk hebt bijgehouden, sleept u de map met de time-lapse-afbeeldingen naar ImageJ. Selecteer het tabblad Plug-ins, Tracking en MtrackJ.Als u elke afzonderlijke cel wilt bijhouden, selecteert u Toevoegen en klikt u op elke cel op elk tijdstip. Klik vervolgens op meten en sla het bestand op om de maat van de tracks te extraheren. De migratie van individuele tumorcellen kan worden bepaald door het migratiepad in de loop van de tijd te volgen in verschillende xy-vlakken van de z-stack en uitgezet als een percentage van de migrerende cellen pre en post biopsie.De tumorcel proliferatie tarief kan worden gekwantificeerd op basis van H2B-tagged Dendra2 condensatie op mitose en uitgezet als een percentage van de delende cellen pre en post biopsie. Het vergelijken van de verdeling van de migratiesnelheid voor en na de biopsie in dezelfde tumor, toont aan dat het aantal migratiecellen toeneemt na de interventie, met een bijbehorende afname van het aantal langzame tot niet-migrerende cellen. Gemiddeld per tumor wordt een 1,75-voudige toename van het percentage trekcellen waargenomen wanneer een biopsie-achtige verwonding wordt uitgevoerd, in vergelijking met controle, niet-gebiopte muizen.Hoewel het percentage trekkende tumorcellen uiteindelijk afneemt in zowel controle- als bioptmuizen, vertonen bioptmuizen nog steeds een hogere migratiecapaciteit dan controlemuizen in het algemeen. Tumorcelproliferative gedrag toont ook een 1.52-voudige toename van het aantal mitotische gebeurtenissen op biopsie na verloop van tijd, ten opzichte van niet-gebiopte controle muizen. Van nota, wordt geen inductie van tumorcelmigratie of proliferatie waargenomen na schedelbeeldvormingsvenstervervanging zonder biopsie, wat erop wijst dat de impuls in de proliferatie van tumorcellen en migratietarieven specifiek door de biopsie-als verwonding wordt veroorzaakt.Het is belangrijk om te werken met hoge precisie en chirurgische vaardigheid tijdens de craniale beeldvorming, implantatie, en vervanging stappen. Uitgebreide praktijk kan nodig zijn.

longitudinal-intravital-imaging-brain-tumor-cell-behavior-response-to

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

This video presents a surgical procedure to implant cranial window in a mouse model for stable optical access to different regions of the brain.

Implantation of Cranial Imaging Window in Mouse Model: A Surgical Procedure to Implant Glass-based Coverslip for Stable Optical Access to Regions of Murine Brain

In this video, we perform intravital imaging of pre-injected cancer cells in a mouse model via an implanted cranial window. This high-resolution time-lapse imaging technique enables the study of dynamic behavior of cancer cells in the live mouse.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: An Imaging Technique to Study the Behavior of Pre-injected Cancer Cells in the Brain of a Murine Model

Source: Ciraku, L., et. al. An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the imaging of luciferase-expressing tumor cells in an organotypic mouse brain slice. Luciferin is added to the medium, and the plate is placed inside the chamber of the in vivo imaging system. Parameters for image capture are adjusted, and the tumor's shape and size are defined. The bioluminescent signals emitted by the tumor...

Bioluminescence Imaging to Assess Tumor Growth in an Organotypic Mouse Brain Slice

A Novel Hoge-resolutie<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging techniek om de Dynamic Response van intracraniële structuren om tumorgroei en Therapeutics Studie

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Dit protocol beschrijft de intravital beeldvorming van transgene muizen uiting van cel-specifieke fluorescente markeringen. Intravital imaging biedt een niet-invasieve methode voor hoge resolutie waarnemingen in levende dieren met behulp van implanteerbare windows waardoor de microscopische visualisatie van de processen mogelijk is. Deze methode is vooral handig om longitudinale processen te bestuderen.

Intravital microscopie van Tumor-geassocieerde therapieën met behulp van geavanceerde dorsale huidplooien venster Chambers op transgene fluorescerende muizen

We rapporteren een techniek die live beeldvorming mogelijk maakt van microtubule dynamica in glioblastoom (GBM) cellen die een gewerveld hersenweefsel binnendringen. Door de orthotopische injectie van fluorescerend gelabelde GBM-cellen te koppelen aan een transparant zebravisbrein met intravitale beeldvorming met hoge resolutie, kan de cytoskeletdynamiek worden gemeten tijdens in situ kankerinvasie.

Live imaging van microtubulidynamica in glioblastoomcellen die het zebravisbrein binnendringen

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Leer longitudinale intravital beeldvorming van hersentumorcellen voor oncologisch onderzoek bij muizen. Deze methode toont migratie, invasie en proliferatie aan voor en na chirurgische biopsie.

Longitudinale Intravital beeldvorming van hersen tumor Celgedrag in reactie op een invasieve chirurgische biopsie

Meer video's verkennen