Name: Vergadering van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise Metamolecules met behulp van DNA Origami sjablonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer de assemblage van gouden nanostaafjes in chirale plasmonische metamoleculen met DNA origami. Deze methode maakt fabricage van complexe driedimensionale nanostructuren met sterke chiroptische responsies mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S. Voutilainen bedanken de auteurs voor haar hulp bij CD spectrometer. De auteurs erkennen het aanbieden van faciliteiten en technische ondersteuning via Aalto Universiteit van OtaNano - Nanomicroscopy Center (Aalto-NMC). Dit werk werd gesteund door de Academie van Finland (grant 308992) en de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma onder het Marie Skłodowska-Curie subsidieovereenkomst nr. 71364.

1. ontwerp van de DNA-origami
<ol><li>Bepaal de gewenste relatieve ruimtelijke rangschikking van AuNRs en de geschikte vorm van de DNA origami sjabloon(afbeelding 1). Schatten van de structurele parameters van de AuNRs en de origami-sjablonen. Zoek de geschatte posities van nietjes moeten verdere wijziging (Figuur 1B).</li>
	<li>Download en installeer caDNAno18 om een DNA-origami ontwerpsjabloon. In caDNAno, route de steiger en nieten strengen volgens de gewenste vorm van de sjabloon en de volgorde van stapelvezels strengen genereren door te klikken op Seq Tool. Klik op De knop Paint en markeer het nietje strengen die verder moeten worden gewijzigd (Figuur 1C).</li>
	<li>Klik op Hulpprogramma voor het exporteren als u wilt het nietje opeenvolgingen van DNA (Figuur 1C) exporteren naar een CSV-bestand.</li>
	<li>Double-stranded sloten vast de Θ van de hoek tussen de twee bundels van origami te ontwerpen. Afhankelijk van de relatieve stand van de twee bundels, kunt de origami-construct links - of rechtshandig (LH/RH) chirale ruimtelijke configuratie (Figuur 1B) aanpassen.</li>
	<li>De nietjes CSV-bestand importeren in een spreadsheetprogramma. Een reeks van polyA10 toevoegen aan het einde van de nietjes gebruikt voor AuNR montage (grepen). Wijzig de nietje strengen op de sites van de ontworpen slot met lock sequenties. Opmerking: De assemblages in de representatieve resultaten bevatten 36 handgrepen uitsteekt aan de 3' einde van de staple strengen, 18 op elke DNA origami bundel, gelijkmatig verdeeld over twee parallelle helices elke 21 nt. De afstand tussen de eerste en de laatste positie van de greep is 168 nt, ongeveer 57 nm (Zie de bijgevoegde caDNAno-bestand).</li>
</ol>2. montage van de DNA-origami-sjablonen
<ol><li>Voorbereiden van een voorraad van de werken van stapelvezels strengen (SM), met inbegrip van strengen met grepen en sloten, door het mengen van gelijke hoeveelheden van concentratie-genormaliseerd nietje oligonucleotides (b.v., 100 µM). Opmerking: Origami structuren bevatten meestal enkele honderden nietje strengen. Nietjes worden meestal gekocht van leveranciers die zijn gespecialiseerd in de chemische synthese van DNA oligonucleotides in multiwell (bijv., 96-Wells) platen.</li>
	<li>Voor 500 µL van 10 nM origami, Meng 50 µL van Tris-EDTA (TE, 10 x), 100 µL van MgCl2 (100 mM), 25 µL van NaCl (100 mM), 175 µL van H2O, 100 µL van SM (0,5 µM), 5 µL van lock strengen (5 µM) , en een 50 µL steiger (100 nM).</li>
	<li>Ontharden het mengsel in een thermocycler van 80 ° C tot 20 ° C in tabel 1beschreven.</li>
</ol>3. DNA origami zuivering
Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor agarose gel zuivering. DNA origami sjablonen kunnen ook gezuiverd worden met behulp van alternatieve benaderingen38,39.
<ol><li>Voor 1% gel, los 1 g agarose in 100 mL Tris-boraat-EDTA (TBE, 0,5 x) door verwarming van het mengsel in een magnetron. Voeg 10 µL van 10.000 x DNA stain volgens de specificatie van de vlek. Gebruiken om te minimaliseren van de blootstelling aan UV-licht op de extractie stap (3.6), een DNA-vlek die onder blauwe excitatie kan worden gevisualiseerd.</li>
	<li>Koel de oplossing tot ongeveer 40 ° C en voeg langzaam 1 mL MgCl2 (1.3 M) terwijl het schudden. Gegoten gel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Stel het apparaat elektroforese en giet er koud (4 ° C) lopende buffer (0,5 x TBE met 11 mM MgCl2) in het vak van de gel. Plaats de gel-vak in een waterbad van ijs.</li>
	<li>Laden buffer toevoegen aan de monsters van de origami (6 x laden buffer bevat 15% polysucrose 400 en 0,25% bromophenol blauw in water). Laad de monsters in de putjes met een juiste volume volgens de kam gebruikt (, bijvoorbeeld 50 µL voor een 8-well kam van 1,5 mm dikte).</li>
	<li>Voer de elektroforese gedurende 2 uur bij 80 V. Opmerking: Om te karakteriseren de origami en scheiden van de open en gesloten structuur, 2% gel gebruiken in plaats van 1% en de lopende tijd tot 4 h verlengen.</li>
	<li>Het imago van de gel met de gel imager (Figuur 2). Gebruik een blauwe lichte transilluminator te visualiseren van de banden, snijden de origami-band smash van de gel op een parafilm en uitpakken van de vloeistof. De herstel-opbrengst is ongeveer 40%.</li>
	<li>Pipetteer van de vloeistof in een centrifugaal filter eenheid en draai bij 3000 x g gedurende 5 min. meten van de absorptie van de origami-oplossing bij 260 nm met een UV-zichtbaar (UV-VIS) spectrometer. Schatting van de concentratie van origami met behulp van een aanpassingscoëfficiënt vast die uitsterven van 1.3 x 108 M-1-•cm-1. Opmerking: De typische concentratie van origami oplossing nadat agarose gel zuivering is 1-2 nM.</li>
	<li>De gezuiverde origami sjablonen bij 4 ° C voor later gebruik opslaan.</li>
</ol>4. synthese van gouden nanostaafjes
Opmerking: Het protocol voor AuNR synthese is aangepast uit de vorige literatuur40 met kleine wijzigingen.
<ol><li>Alle glaswerk met koningswater gedurende 5 minuten wassen, spoelen met water, bewerk het ultrasone trillingen ten met ultrazuiver water en droog het vóór gebruik.</li>
	<li>Bereiden van 0,2 M hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB), 1 mM HAuCl4, 4 mM AgNO3, 64 mM L (+)-ascorbinezuur, en 6 mM NaBH4. Gebruik koud water (4 ° C) te ontbinden NaBH4 en bewaar deze in een koelkast bij 4 ° C. Ascorbinezuur oplossing moet vers worden bereid. Let op: CTAB is gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend), via ingestie en inhalatie. Draag geschikte beschermende kleding. Bij ontoereikende ventilatie een geschikte adembescherming dragen. NaBH4 is zeer gevaarlijk in geval van contact met de huid (irriterend), contact met de ogen (irriterend), via ingestie en inhalatie. Draag splash bril, een laboratoriumjas, handschoenen en een gasmasker damp en stof. Zorg ervoor dat u een erkend/gecertificeerd gasmasker of een vergelijkbare groep.</li>
	<li>Au zaden voor te bereiden.<ol>
<li>Voeg 500 µL van CTAB (0,2 M), 250 ÂµL van ultrazuiver water en 250 µL van HAuCl4 (1 mM) in een glazen ampul. Roer op 450 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.</li>
		<li>De opzwepende verhogen tot 1.200 tpm. Voeg 100 µL van koude NaBH4 oplossing (6 mM, 4 ° C). Na 2 minuten, stop de roeren en Incubeer de oplossing in een waterbad bij 30 ° C gedurende 30 minuten vóór gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>AuNRs voor te bereiden.<ol>
<li>Ontbinden 0.55 g CTAB en 0.037 g van 2,6-dihydroxybenzoic zuur in 15 mL warm water (60-65 ° C) in een rondbodemkolf. De oplossing tot 30 ° C afkoelen, voeg 600 µL van AgNO3 (4 mM) en roer bij 450 omwentelingen per minuut gedurende 2 minuten. Dan, laat de oplossing ongestoord gedurende 15 minuten staan bij 30 ° C.</li>
		<li>Voeg toe 15 mL HAuCl4 (1 mM) aan de oplossing, en roer bij 450 rpm voor 15 min. 120 toevoegen µL van L (+)-ascorbinezuur (64 mM), en vervolgens onmiddellijk, roer op 1.200 rpm voor 30 s. Voeg 12 µL van Au zaden en Blijf roeren op 1.200 rpm voor 30 s.</li>
		<li>Incubeer de oplossing in een waterbad bij 30 ° C gedurende 18 h. Niet storen van de oplossing en gebruik een dop te sluit de kolf of fles.</li>
		<li>Breng de resulterende oplossing centrifuge buizen en centrifuge 9.500 x g gedurende 12 minuten bij 20 ° C. Verwijder het supernatant, verspreiden de pellet in 20 mL ultrazuiver water en één meer centrifugeren stap uitvoeren.</li>
		<li>Het verspreiden van de laatste pellet in 3 mL gedestilleerd water. Schatting van de concentratie van AuNRs van een UV-VIS absorptie metingen met behulp van de coëfficiënt van uitsterven voor de longitudinale plasmon resonantie. De coëfficiënt uitsterven kan worden voorspeld met behulp van de AuNR vorm parameters41. Bewaar de AuNRs bij 4 ° C voor verder gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. functionalization van gouden nanostaafjes met single-stranded DNA
Opmerking: Deze sectie beschrijft het protocol voor AuNR functionalization met single-stranded DNA (ssDNA), na de zogenaamde lage pH-route aangepast uit de vorige literatuur42. Het AuNRs bedekt met DNA zijn gezuiverd door middel van centrifugeren; u kunt ook kan de zuivering worden uitgevoerd met behulp van de Elektroforese van het gel van de agarose.
<ol><li>Incubeer 20 µL van thiol-matiemaatschappij polyT DNA-strengen (1 mM) met 20 µL van vers bereide tris(2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride (TCEP, 14 mM) voor 1 h om disulfide bindingen. Opmerking: De vorm van de groepen thiol obligaties met AuNRs, en de reeks polyT hybridizes met de polyA10 greep op de origami, waarin te veel of te weinig basenparen tot een storing of een unstable vergadering leiden kan. Let op: TCEP kan ernstige huid brandwonden en oog schade veroorzaken. Draag beschermende handschoenen/beschermende kleding/oogbescherming bescherming/voor het gezicht.</li>
	<li>Mix 150 µL van AuNRs (10 nM) en 40 µL van TCEP-behandelde thiol-DNA (0.5 mM). 1% natrium dodecyl sulfaat (SDS) toevoegen aan de oplossing van de AuNR voor het bereiken van een SDS-eindconcentratie van 0,05%. Breng de pH aan 2.5-3 met ~ 1 µL van HCl (1 M).</li>
	<li>Incubeer gedurende 2 h terwijl het schudden bij 70 t/min. Opmerking: De AuNR-naar-DNA-verhouding moet in de volgorde van 1:5, 000-15.000, afhankelijk van de grootte van de wikkels. Voor de AuNRs (70 nm x 30 nm) bereid volgende het protocol beschreven in sectie 4, een overtollige 13.000 van thiol-DNA is aanbevolen.</li>
	<li>Toevoegen van NaCl om te bereiken van een definitieve NaCl-overleg van 0,5 M en incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur tijdens het schudden bij 70 t/min. Opmerking: Een kleurverandering bij deze stap kan duiden op een defecte DNA-functionalization.</li>
	<li>Breng de pH op ~8.5 met FSME buffer (10 x) en na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Wassen van de DNA-AuNRs 4 x door het mengen van de monsters met 1 mL buffer te wassen (0,5 x TBE met 0,1% SDS), en centrifugeer bij 7.000 x g gedurende 30 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de DNA-AuNRs in de resterende vloeistof (~ 40 µL). Schatting van de concentratie van DNA-AuNRs van een UV-VIS absorptie metingen zoals beschreven in stap 4.4.5. Opmerking: De oplossing zou kunnen worden iets 'troebel' stappen 5.3-5.4 als gevolg van de CTAB vervanging van het oppervlak van de AuNRs door thiol-DNA. De oplossing moet worden duidelijk op de opwarming van de aarde tot ~ 35 ° C gedurende 5 minuten.</li>
</ol>6. montage van gouden nanostaafjes op DNA origami sjablonen
<ol><li>Voeg MgCl2 toe aan de oplossing van gezuiverde DNA-AuNRs, om een eindconcentratie van 10 mM. Meng de gezuiverde DNA-AuNRs en origami naar een verhouding 10:1. Opmerking: Een lagere ratio kan het product opbrengst43afnemen.</li>
	<li>Ontharden het mengsel in een mixer met een temperatuur van 40 ° C tot 20 ° C terwijl het schudden bij 400 rpm, overeenkomstig de procedure van tabel 2. Opmerking: Voor de karakterisering van de CD, de steekproef kan worden gemeten na deze stap zonder verdere zuivering.</li>
	<li>0,7% agarose gelelektroforese (3,5 h bij 80 V) gebruiken voor het zuiveren van de definitieve origami-AuNR-structuren.</li>
	<li>Gebruik een witte lichte transilluminator voor imaging. Snijd de product band (origami-AuNR dimeer) (Figuur 3), smash van de gel op een parafilm, en haal de vloeistof. Pipetteer de vloeistof in een centrifugaal filter eenheid en de spin bij 3000 x g gedurende 5 min. resuspendeer de origami-AuNRs in de oplossing. De opbrengst van de terugwinning van de gel is ongeveer 50%.</li>
	<li>Schatting van de concentratie van de origami-AuNR structuren van een UV-VIS absorptie metingen zoals beschreven in stap 4.4.5.</li>
</ol>7. Transmissie Electronenmicroscopie imaging
Opmerking: Deze uranyl formate (UFo) kleuring protocol is aangepast uit de vorige literatuur44.
<ol><li>Mix-200 µL van UFo oplossing (0,75%) en 1 µL van NaOH (5 M) en vortex onmiddellijk voor 2-3 min. de vlek oplossing voor 3-4 min bij 14.000 x gcentrifugeren. De vlek behoeden door blootstelling aan licht (bijvoorbeeld door het te verpakken in aluminiumfolie). Let op: UFo is giftig als ingeademd of ingeslikt en leiden irritatie van de ogen tot kan. In het geval van kortstondige blootstelling of lage vervuiling, een respiratoire filter-apparaat te gebruiken. In het geval van intensieve of langere blootstelling, een self-contained respiratoire beschermende apparaat te gebruiken. Draag handschoenen. Het handschoenmateriaal moet waterdicht en bestand tegen UFo en haar oplossingen. Strak verzegelde bril dragen.</li>
	<li>Gloed-kwijting koolstof/formvar-gecoate TEM rasters voor 6 s net voor gebruik verhogen hydrophilicity en bevorderen de steken van de structuren. Pipetteer 5 µL monster druppels op de grid TEM, Incubeer gedurende 5-8 minuten en verwijder de daling door zachtjes aan te raken een filtreerpapier met de rand van het raster.</li>
	<li>Pipetteer een grote (~ 20 µL) en één kleine (~ 10 µL) drop van de oplossing van de vlek op een parafilm. Zet het raster op de daling van de oplossing van de kleine vlek en droog onmiddellijk door het aanraken van het filtreerpapier met de rand van het raster. Dan, zet het op de daling van de oplossing van het grote vlek voor 30 s.</li>
	<li>Verwijder de vloeistof op de grid door het aanraken van het filtreerpapier met de rand van het raster. Schakel het raster in de raster-houder. Wachten op de grid voor ten minste 10 min. drogen.</li>
	<li>Kenmerkend zijn de monsters van origami (Figuur 4), AuNRs (Figuur 5) en origami-AuNRs (Figuur 6) door TEM.</li>
</ol>8. circulair dichroïsme meting
<ol><li>Verwijderen van de CD-spectrometer met N2 voor 20 min. Opmerking: De meeste van de CD-spectrometers nodig zuiveren met N2 vóór lamp ontsteking. Raadpleeg de handleiding van de spectrometer CD.</li>
	<li>De bandbreedte, scannen bereik en overname stap instellen. Opmerking: Het scannen bereik hangt af van de optische eigenschappen van AuNRs, die afhankelijk van de grootte van de AuNRs.</li>
	<li>Maatregel lege CD met buffer.</li>
	<li>Het meten van de spectra van de CD van origami-AuNR monsters (Figuur 7). Opmerking: Gebruik quarts of glas cuvettes voor meting van de CD. Kunststof cuvettes zijn ongeschikt voor CD spectroscopie. Ook, de meeste CD-spectrometers toestaan de gelijktijdige overname van absorptie en gegevens van de CD.</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol introduceert de hele workflow van ontwerp, assemblage, zuivering en karakterisering van DNA origami gebaseerde chirale vergaderingen van AuNRs. De DNA origami sjablonen gebruikt in het protocol zijn bijzonder geschikt voor de fabrikatie van prikkels-responsieve assemblages. Verschillende soorten reacties en functionalizes kunnen worden opgenomen in de lock-strengen die de chirale staat van de origami sjabloon (afbeelding 1B)24,25,26,31te definiëren. Voor statische assemblages zijn eenvoudiger blok-vormige sjablonen vaak voldoende14,45,46,47.
De DNA origami gebaseerde benadering voor de fabricage van Enterprise nanostructuur erft beperkingen van de DNA origami techniek48. De grootte van de origami-sjablonen is meestal beperkt door de grootte van de steiger streng. De stabiliteit van DNA structuren wordt verminderd onder omstandigheden recht-zout. De kosten van synthetische nietje strengen blijft vrij hoog. Echter, recente ontwikkelingen op het gebied van structurele DNA nanotechnologie naar verwachting zullen overwinnen deze beperkingen49,50,51,52,53,,54 , 55.
Vergeleken met andere moleculaire gebaseerde benaderingen voor het genereren van chirale assemblages van AuNRs34,35,,36,,37, biedt DNA origami een hoge mate van ruimtelijke precisie en programmeren.
Voor het bereiken van betrouwbare en reproduceerbare optische reacties van chirale samenstellen, raden wij de protocollen voor AuNR synthese40, aan te passen, aangezien de kwaliteit en de optische eigenschappen van commerciële producten tussen partijen variëren kunnen. Extra onthardende (stap 6.2) is vaak van cruciaal belang voor het waarborgen van de correcte gehechtheid van AuNRs aan DNA origami sjablonen (Figuur 6).
Tot slot, het protocol hier beschreven is niet beperkt tot chirale assemblages. DNA origami biedt een zeer flexibel platform voor de fabrikatie van complexe Enterprise nanostructuren9,10.

DNA nanostructuren, DNA origami in het bijzonder hebben al gebruikte moleculen en andere componenten van de nanoschaal (bijvoorbeeld eiwitten en nanodeeltjes [NPs]), ordenen met nanometer precisie in bijna willekeurige geometrieën1,2 , 3 , 4 , 5. de mogelijkheid om te regelen van metalen NPs op DNA origami sjablonen met een hoge opbrengst en de nauwkeurigheid laat de fabricage van Enterprise structuren met nieuwe optische eigenschappen6,7,8, 9 , 10. DNA origami techniek is vooral handig voor de generatie van chirale Enterprise structuren, waarvoor werkelijk driedimensionale platforms11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20.
Dit protocol beschrijft in detail het gehele proces van de fabricage van DNA origami-templated chirale vergaderingen van AuNRs. De software gebruikt voor het ontwerp21 en structuur voorspelling22,23 van DNA origami is intuïtief en vrij beschikbaar. De origami fabricage en AuNR synthese gebruiken gemeenschappelijke biochemie lab apparatuur (bijv. thermocyclers, de gelelektroforese van het, kookplaten, centrifuges). De structuren zijn gekenmerkt met behulp van standaard TEM en CD spectroscopie.
De fabricage van soortgelijke Enterprise nanostructuren met topdown methoden (bijvoorbeeld electron beam lithografie) zou vereisen nogal ingewikkelde en dure apparatuur. Daarnaast bieden DNA origami sjablonen de mogelijkheid om op te nemen structurele herconfigureerbaar in Enterprise assemblages24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33, die zeer uitdagend voor structuren vervaardigd met litho technieken is. Vergeleken met andere moleculaire gebaseerde benaderingen34,35,,36,,37, biedt DNA origami gebaseerde fabricage een hoge mate van ruimtelijke precisie en programmeren.

<table><tbody><tr><td>2,6-Dihydroxybenzoic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D109606-25</td><td>98+%</td></tr><tr><td>AgNO3</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA1141414</td><td>99.90%</td></tr><tr><td>Blue light transilluminator&nbsp;</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-06</td><td>FastGene LED Transilluminator</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Acros Organics</td><td>403160050</td><td>Voor agarosegel&nbsp; laadbuffer</td></tr><tr><td>Centrifugaal filter units</td><td>Merck Millipore</td><td>42600</td><td>DNA-extractie uit agarose</td></tr><tr><td>Chirascan CD spectrometer&nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvet&nbsp;</td><td>Hellma&nbsp;</td><td>105-202-85-40</td><td>Kwarts SUPRASIL</td></tr><tr><td>DNA lobind buizen</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biospectrometer&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>6135000904</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP525-10</td><td>Polysucrose 400 (voor agarosegel&nbsp; laadbuffer)</td></tr><tr><td>Gel elektroforese sets</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Gel Doc XR+ System&nbsp;</td></tr><tr><td>HAuCl4&bull;3H2O</td><td>Alfa Aesar</td><td>AA3640006</td><td>99.99%</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Scharlau</td><td>AC07441000</td><td>1M</td></tr><tr><td>Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9151-100</td><td>BioXtra, 98+%</td></tr><tr><td>L(+)-ascorbinezuur</td><td>Acros Organics</td><td>401471000</td><td>99+%</td></tr><tr><td>M13p7560 scaffold strand</td><td>Tilibit nanosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull;6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-500</td><td>BioXtra, 99+%</td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Acros Organics</td><td>200050250</td><td>99%</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-500</td><td>BioXtra, 99.5+%</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500</td><td>BioXtra, 98+%</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7668-1EA</td><td>PARAFILM M</td></tr><tr><td>PBS buffer (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP3991</td><td>Moleculaire biologie</td></tr><tr><td>ProFlex PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484073</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74255-250</td><td>99+%</td></tr><tr><td>Stapel strands</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sybr Safe</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>S33102</td><td>Voor DNA-kleuring</td></tr><tr><td>TBE buffer (10X)</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td>Moleculaire biologie</td></tr><tr><td>TE buffer (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP24771</td><td>Moleculaire biologie</td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>FEI Tecnai F12</td></tr><tr><td>Thiol-gefunctionaliseerde&nbsp; ssDNA&nbsp;</td><td>Biomers.net</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)fosfine hydrochloride (TCEP-HCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI20491</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapuur water (Type 1)</td><td></td><td></td><td>Milli-Q Direct 8 systeem</td></tr><tr><td>Uranyl formiate</td><td>Tebu-bio</td><td>24762-1</td><td></td></tr><tr><td>White light transilluminator</td><td>UVP</td><td>TW-26</td><td></td></tr></tbody></table>

vergadering van gouden nanostaafjes in chirale enterprise metamolecules met behulp van dna origami sjablonen

Assembly of Gold Nanorods into Chiral Plasmonic Metamolecules Using DNA Origami Templates

De inherente serverprocessor van DNA origami structuren maakt ze ideaal sjablonen voor de rangschikking van de metalen nanodeeltjes in complexe Enterprise nanostructuren. De hoge ruimtelijke precisie van een DNA origami-templated vergadering kan controle van de koppeling tussen Enterprise resonanties van individuele deeltjes en kan afstemmen van de optische eigenschappen van de geconstrueerde nanostructuren. Onlangs, chirale Enterprise systemen trok veel aandacht te wijten aan de sterke correlatie tussen de ruimtelijke configuratie van Enterprise assemblages en hun optische Reacties (bijvoorbeeld circulair dichroïsme [CD]). In dit protocol beschrijven we de hele workflow voor de generatie van DNA origami gebaseerde chirale assemblages voor gouden nanostaafjes (AuNRs). Het protocol bevat een gedetailleerde beschrijving van de ontwerpprincipes en experimentele procedures voor de fabricage van DNA origami sjablonen, de synthese van AuNRs en de vergadering van origami-AuNR structuren. Bovendien, is de karakterisatie van structuren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en spectroscopie van de CD opgenomen. Het beschreven protocol is niet beperkt tot chirale configuraties en kan worden aangepast voor de bouw van diverse Enterprise-architecturen.

TEM beelden van DNA origami sjablonen, AuNRs en definitieve origami-AuNR assembly's worden weergegeven in Figuur 4 Figuur 5en Figuur 6A, respectievelijk. Te wijten aan hun bindende voorkeur aan TEM rasters, worden origami-AuNR assembly's meestal gezien als parallelle origami bundels en stangen (Figuur 6A). Thermische gloeien is vereist voor de juiste uitlijning van de AuNRs van origami sjablonen (Figuur 6A, B). Het protocol maakt hoge rendementen van de vergadering van de AuNRs in chirale metamolecules met sterke Enterprise CD Reacties (Figuur 7).
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatuur (° C)</td>
			<td>Tijd</td>
		</tr>
<tr>
<td>80</td>
			<td>15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>79 - 71</td>
			<td>1 ° C/1 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>70 - 66</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>65 - 60</td>
			<td>1 ° C/30 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>59 - 37</td>
			<td>1 ° C/60 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>36 - 30</td>
			<td>1 ° C/15 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>29 - 20</td>
			<td>1 ° C/5 min</td>
		</tr>
<tr>
<td>20</td>
			<td>Houd</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Temperaturen en tarieven voor de thermische gloeien van DNA origami sjablonen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Temperatuur (° C)</td>
			<td>Tijd (min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>40</td>
			<td>130</td>
		</tr>
<tr>
<td>36</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>32</td>
			<td>180</td>
		</tr>
<tr>
<td>22</td>
			<td>Houd</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: temperaturen en bedrijf tijden voor het gloeien AuNRs en DNA origami sjablonen. De koeling tarief tussen de stappen is ingesteld op 0,1 ° C/min. De origami-AuNR DNA-monsters worden gegloeid terwijl het schudden van 400 toeren per minuut.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig1.jpg"> Figuur 1 : Ontwerp van DNA origami-templated chirale metamolecules. (A) identificeren de gewenste relatieve ruimtelijke rangschikking van gouden nanostaafjes (AuNRs) en een geschikte vorm van de DNA origami sjabloon. (B) schatten de structurele parameters van de AuNRs (D-AuNR, LAuNR) en de origami-sjabloon (Worigami, Lorigami, Θ). Zoek de geschatte posities van de nietjes die verdere wijziging nodig. (C) ontwerp van DNA origami sjablonen met behulp van caDNAno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig2.jpg"> Figuur 2 : De Elektroforese van het agarose gel van origami. (A) zuiveren met 1% agarose gelelektroforese gedurende 2 uur bij 80 V. (B) karakterisering met 2% agarose de Elektroforese van het gel voor 4 uur bij 80 V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig3.jpg"> Figuur 3 : De agarose gel elektroforese zuivering van origami-AuNRs. Gel (0,7%) 3,5 uur werd bij 80 V voor de monsters bereid volgens de procedure van de vergadering met verschillende DNA-AuNR-naar-origami-ratio's (20:1, 5:1) en monsters (DNA-AuNRs-naar-origami-ratio 10:1) met/zonder gloeien procedure geleid. Voor TEM beelden van de monsters in banden 1 Zie 2 en 3, Figuur 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig4.jpg"> Figuur 4 : Vertegenwoordiger TEM beeld van de DNA origami sjablonen. De origami-structuur bestaat uit twee 14-helix bundels (80 nm x 16 nm x 8 nm) met elkaar verbonden door de steiger strand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig5.jpg"> Figuur 5 : Vertegenwoordiger TEM beeld van de AuNRs. De gemiddelde afmetingen van gesynthetiseerde AuNRs zijn 70 x 30 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig6.jpg"> Figuur 6 : TEM beelden van origami-AuNR assemblages. (A) AuNR Dimeren op origami na gloeien (band 1 in Figuur 3). (B) AuNR Dimeren op origami zonder gloeien (band 2 in afbeelding 3). (C) Origami-AuNR aggregaten (band 3 in Figuur 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59280/59280fig7.jpg"> Figuur 7 : CD spectra van de vergaderingen van de origami-AuNR. De spectra van de CD van de gesloten structuren (de origami-sjablonen door lock strengen vast in een rechtshandige configuratie, met 50° tussen twee origami bundels) en de open structuur (de origami sjablonen zonder slot strengen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59280/59280fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

We beschrijven het gedetailleerd protocol voor de DNA origami gebaseerde montage van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise metamolecules met sterke chiroptical reacties. Het protocol is niet beperkt tot chirale configuraties en kan gemakkelijk worden aangepast voor de fabricage van diverse Enterprise-architecturen.

Vergadering van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise Metamolecules met behulp van DNA Origami sjablonen

The inherent addressability of DNA origami structures makes them ideal templates for the arrangement of metal nanoparticles into complex plasmonic ...

Deze methode maakt het mogelijk om driedimensionale chirale plasmonische samenstellingen met sterke chiroptical reacties. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk maakt de vervaardiging van complexe metalen nanostructuren met behulp van vrij beschikbare software tools en gemeenschappelijke biochemie lab apparatuur. Het aantonen van de procedure zal Yike Huang een afgestudeerde student en Minh-Kha Nguyen een postdoc uit mijn laboratorium.Gebruik caDNAno om een DNA-origamisjabloon te ontwerpen. Route de steiger in nietjes strengen volgens de gewenste vorm van de sjabloon. Genereer vervolgens de nietjestrengsequenties door op het gereedschap Reeksen te klikken.Klik op het gereedschap Verf en markeer de nietjesstrengen die verdere wijzigingen vereisen. Klik op het gereedschap Exporteren om de DNA-basissequenties naar een CSV-bestand te exporteren. Importeer vervolgens het CSV-bestand in een spreadsheettoepassing.Voeg een polyadenine sequentie toe aan het einde van de nietjes die gebruikt moeten worden als handgrepen voor gouden nanorod-assemblage. Wijzig de nietjes op de ontworpen vergrendelingssites met vergrendelingsreeksen. Bereid een werkvoorraad van nietjes strengen met inbegrip van strengen met handvatten en sloten door het mengen van gelijke hoeveelheden concentratie genormaliseerde nietje oligonucleotiden.Bereid vervolgens het origamimengsel zoals beschreven in het tekstprotocol. Anneal het mengsel in de thermocycler van 80 graden tot 20 graden Celsius. Los voor een 1%gel een gram agarose op in 100 milliliter TBE door het mengsel in de magnetron te verwarmen.Voeg 10 microliter van 10, 000X DNA vlek volgens de vlek specificatie. Om de blootstelling aan UV-licht bij de extractiestap te minimaliseren, gebruikt u een DNA-vlek die kan worden gevisualiseerd onder blauwe excitatie. Giet de gel en uitbroed gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Plaats vervolgens de geldoos in een ijswaterbad. Voeg laadbuffer toe aan de origamimonsters en laad de monsters in de putten met een goed volume volgens de gebruikte kegel. Voer de elektroforese twee uur uit op 80 volt.Beeld de gel met de gel imager. Gebruik een blauw licht transilluminator om de banden te visualiseren en snijd de origami band. Smash de gel op parafilm en extract van de vloeistof.De herstelopbrengst is ongeveer 40%Pipette de vloeistof in een centrifugaal filter eenheid en spin op 3,000 keer G gedurende vijf minuten. Meet de absorptie van de origamioplossing op 260 nanometer met een UV-zichtbare spectrometer. Los 0,55 gram CTAB en 0,037 gram 2, 6-dihydroxybenzoëzuur op in 15 milliliter warm water in een ronde bodemkolf.Na het afkoelen van de oplossing tot 30 graden Celsius, voeg 600 microliter van vier millimolar zilvernitraat toe en roer twee minuten bij 450 RPM. Laat de oplossing 15 minuten ongestoord bij 30 graden Celsius. Voeg vervolgens 15 milliliter van een millimolar waterstof tetrachloroauraat aan de oplossing en roer op 450 RPM gedurende 15 minuten.Voeg ook 120 microliter van 64 millimolar L-ascorbinezuur toe en roer onmiddellijk op 1, 200 RPM gedurende 30 seconden. Voeg nu 12 microliter goudzaden toe en blijf 30 seconden roeren bij 1,200 rpm. Broed de oplossing in een waterbad op 30 graden Celsius gedurende 18 uur.Verstoor de oplossing niet en gebruik een dop om de kolf te sluiten. Breng de resulterende oplossing over naar centrifugebuizen en centrifuge op 9, 500 keer G gedurende 12 minuten bij 20 graden Celsius. Gooi de supernatant weg en verdeel de pellet in 20 milliliter ultra zuiver water.Voer nog een centrifugatiestap uit en verdeel vervolgens de uiteindelijke pellet in drie milliliter gedestilleerd water. Schat de concentratie van gouden nanorods van een UV zichtbare absorptiemeting met behulp van de extinctiecoëfficiënt voor de longitudinale plasmonresonantie. Meng 150 microliter van 10 nanomolar goud nanorods en 40 microliter van 0,5 millimolar TCEP behandeld thiol DNA.Voeg 1%SDS toe aan de gouden nanorod-oplossing totdat een uiteindelijke SDS-concentratie van 0,05% is bereikt. Pas de PH aan tussen 2,5 en drie met ongeveer één microliter van één molaire HCL. Incubeer gedurende twee uur tijdens het schudden op 70 RPM.Voeg natriumchloride toe om een laatste natriumchlorideconcentratie van 0,5 molair te bereiken en vier uur lang bij kamertemperatuur uit te broeden terwijl u schudt bij 70 RPM. Pas vervolgens de PH aan op ongeveer 8,5 met 10X TBE-buffer en incubeer 's nachts. Was de DNA-goud nanorods vier keer door het mengen van de monsters met een milliliter wasbuffer en centrifuge op 7,000 keer G gedurende 30 minuten.Verwijder de supernatant en resuspend de DNA-goud nanorods in de resterende vloeistof. Schat de concentratie van DNA-goud nanorods van een UV-zichtbare absorptiemeting als voorheen. Voeg magnesiumchloride toe aan de oplossing van gezuiverde DNA-goudnanorods tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolar.Meng de gezuiverde DNA-goud nanorods en origami tot een verhouding van 10 tegen één en geef het mengsel in een mixer met een temperatuurregeling van 40 graden Celsius tot 20 graden Celsius terwijl het schudden bij 400 RPM. Gebruik 0,7%agarose gel elektroforese om de uiteindelijke origami gouden nanorod structuren te zuiveren. Voor TEM-beeldvorming, meng 200 microliter van 0,75%uranyl formate oplossing en 1 microliter van vijf molaire natriumhydroxide.Vortex onmiddellijk voor twee tot drie minuten. Centrifuge de vlek oplossing voor drie tot vier minuten op 14.000 keer G.Then, de vlek te beschermen tegen blootstelling aan licht door het te verpakken in aluminiumfolie. Na het verhogen van de hydrofaliciteit van de TEM-rasters zoals beschreven in het tekstprotocol, druppelen er vijf microlitermonsterdruppels op het TEM-raster.Na een incubatie van vijf tot acht minuten, verwijder de druppel door voorzichtig aanraken van een filter papier met de rand van het raster. Nu, pipet een grote druppel en een kleine druppel van de vlek oplossing op een stuk parafilm. Zet het rooster op de kleine vlek oplossing vallen en onmiddellijk drogen door het aanraken van het filter papier met de rand van het rooster.Dan, zet het op de grote vlek oplossing drop voor 30 seconden. Hier wordt een TEM-afbeelding van DNA-origami-sjablonen weergegeven. De origamistructuur bestaat uit twee 14 helixbundels die door de steigerstreng met elkaar verbonden zijn.Hier wordt een representatief TEM-beeld van gouden nanorods getoond. De gemiddelde afmetingen van gesynthetiseerde gouden nanorods zijn 70 bij 30 nanometer. Dit beeld toont gouden nanorod dimers op origami na het gloeien.Vanwege hun bindende voorkeur voor TEM-rasters, origami gouden nanorod assemblages worden meestal gezien als parallelle origami bundels en staven. Het protocol maakt hoge opbrengsten van de assemblage van gouden nanorods in chirale metamoleculen met sterke plasmonische cirkel dichroismereacties mogelijk. Hier zijn de spectra van de gesloten structuren en de open structuren.Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers om plasmonische optische eigenschappen van complexe zelf geassembleerde metalen nanostructuren te verkennen. Zoals beschreven in het tekstprotocol worden bij deze methode verschillende gevaarlijke chemische stoffen gebruikt. Controleer het materiaalveiligheidsinformatieblad zorgvuldig en neem de nodige voorzorgsmaatregelen.

assembly-gold-nanorods-into-chiral-plasmonic-metamolecules-using-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

DNA-origami is een krachtige methode voor het vervaardigen van nauwkeurige nanoschaal objecten door de zelf-assemblage van DNA-moleculen programmeren. Hier beschrijven we hoe origami DNA kan worden gebruikt om een ​​robot robot kan voelen biologische signalen en reageren door vormverandering vervolgens doorgegeven aan een gewenst effect te ontwerpen.

Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Oplossing-opgehangen goud nanobuizen met gecontroleerde afmetingen kunnen worden gesynthetiseerd door elektrochemische depositie in poreuze anodische aluminiumoxide (AAO) membranen met een hydrofoob polymeer kern. Goud nanobuisjes en nanobuis arrays veelbelovend voor toepassingen in plasmonische biosensing, oppervlakte-enhanced Raman spectroscopie, foto-thermische verwarming, ionische en moleculaire transport, microfluidics, katalyse en elektrochemische detectie.

Sjabloon gerichte synthese van Plasmonische Gold nanobuizen met afstelbare IR absorptie

DNA origami is een krachtige methode voor het fabriceren van nauwkeurige objecten op nanoschaal door het zelfsamenstellen van DNA-moleculen te programmeren. Hier beschrijven we een protocol voor het vouwen van een bio-responsieve robot uit DNA origami, de zuivering en negatieve kleuring voor transmissie-elektronenmicroscopische beeldvorming (TEM).

Vouwen en Karakterisatie van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

DNA-tegeling is een effectieve benadering om programmeerbare nanostructuren te maken. We beschrijven de protocollen om complexe tweedimensionale vormen te construeren door de zelfassemblage van enkelstrengse DNA-tegels.

Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

We beschrijven het gedetailleerd protocol voor ontwerp, simulatie, NAT-lab experimenten en analyse voor een herconfigureerbare DNA accordeon rek van 6 bij 6 mazen.

Ontwerp en de synthese van een accordeon herconfigureerbare DNA-Rack

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor T4 afbinding en denatureren pagina zuivering van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien en inheemse pagina analyse van circulaire tegels-, montage- en AFM beeldvorming van 1D en 2D DNA nanostructuren, evenals agarose gel elektroforese en centrifugeren zuivering van eindige DNA nanostructuren.

Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen

Hier, wordt een protocol inzake de bescherming van DNA origami nanostructuren in Mg-uitgeput en nuclease-rijke media met behulp van natuurlijke kationische polysaccharide chitosan en synthetische lineaire polyethyleneimine (LPEI) coatings gepresenteerd.

Gentherapie geïnspireerd Polycation Coating voor bescherming van DNA Origami nanostructuren

Hier beschrijven we een protocol om discrete en nauwkeurige anorganische nanostructuren op substraten te maken met behulp van DNA-origami vormen als leidende templates. De methode wordt aangetoond door het creëren van plasmonic gouden bowtie-vormige antennes op een transparante ondergrond (Sapphire).

DNA origami-gemedieerde substraat nano-Atterning van anorganische structuren voor sensing toepassingen

Dit protocol demonstreert single-molecule surface-enhanced Raman scattering (SERS) metingen met behulp van een DNA origami nanoantenna (DONA) in combinatie met colocalized atomic force microscopy (AFM) en Raman metingen.

Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Scattering Measurements mogelijk gemaakt door Plasmonic DNA Origami Nanoantennas

We beschrijven experimentele details van de synthese van patronen en herconfigureerbare deeltjes van tweedimensionale (2D) precursors. Deze methodologie kan worden gebruikt om deeltjes te maken in een verscheidenheid van vormen zoals veelvlakken en grijpinrichtingen bij lengteschalen variërend van micro tot centimeter schaal.

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

Leer de assemblage van gouden nanostaafjes in chirale plasmonische metamoleculen met DNA origami. Deze methode maakt fabricage van complexe driedimensionale nanostructuren met sterke chiroptische responsies mogelijk.

Vergadering van gouden nanostaafjes in chirale Enterprise Metamolecules met behulp van DNA Origami sjablonen

Meer video's verkennen