Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm
12 april 2019
In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek 96-wells-plaat
Dit protocol presenteerde een eenvoudige en betrouwbare methode om gealkde fosfataseactiviteit in de biofilmcultuur van S.aureus te meten. Het zal ons helpen om de functie van ALP in biofilmvorming te begrijpen. Het grote voordeel van deze techniek is een hoge doorvoer.
Het is zeer gevoelig en gemakkelijk uit te voeren. Demonstreren van de procedure zal Kevin Danikowski, een voormalige student van Harper College. Om TSB voor te bereiden, voeg alvleeskliervertavel van caseïne, papaïsche vertering van sojameel, natriumchloride, dextrose en dipotassiumfosfaat toe aan gedestilleerd water.
Bedek de kolf met aluminiumfolie en doe het in een autoclave om te steriliseren voor gebruik. Om een TSA voor te bereiden, voeg agar toe aan TSB en zet het in de autoclave voor sterilisatie. Laat het dan afkoelen tot kamertemperatuur.
Giet het vervolgens in de petrischaal met een verhouding van 20 milliliter per gerecht. Om een biofilm kweekmedium voor te bereiden, voeg glucose toe aan autoclaved TSB om de concentratie van 10 gram per liter te bereiken. Met behulp van een vacuümfiltratiekit filtrate de oplossing met een filter van 0,2 micrometer.
Om te inenten, gebruik een gesteriliseerde inentingslus om een individuele kolonie Staph aureus uit de petrischaal te plukken en deze in de kweekbuis te plaatsen gevuld met 10 milliliter TSB. Zet de buis in de couveuse om 's nachts te groeien op 37 graden Celsius. Met een micropipet, teken 100 microliters van 's nachts cultuur en breng het naar een cultuur buis gevuld met 10 milliliter TSB met glucose voor een 1:100 volume verhouding verdunning.
Vortex voorzichtig te mengen voor een consistente concentratie. Gebruik een micropipet om 200 microliter van verdunde cultuur over te brengen in een totaal van 18 putten van een 96 put plaat. Incubeer de 96 put plaat op 37 graden Celsius gedurende 24 uur voor biofilm vorming.
Voor de beste biofilmvorming van S.aureus is het beter om een platte of ronde bodem 96 putplaat te kiezen. Daarna kantel je de plaat iets om de supernatant te decanteren door aspiratie vanaf de rand van elke put. Was elk goed met 1X PBS.
Doe de plaat in de centrifuge om vijf minuten te draaien bij 8.000 omwentelingen per minuut en decanteer de supernatant door aspiratie. Voeg 75 microliters gebufferd ALP-substraat toe bestaande uit commercieel verkrijgbaar PNPP aan elke put en gebruik een timer om elk keer punt in drievoud op te nemen. Voeg na elk incubatietijdpunt 75 microliters van vijf molaire natriumhydroxide toe aan elk van de drie putten om de reactie te stoppen.
Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 800 omwentelingen per minuut. Gebruik een pipet om 100 microliter supernatant over te brengen in een nieuwe 96 putplaat voor calorimetrische meting. Gebruik een 96 goed plaatlezer om de absorptie van elke put te meten op 405 nanometer.
Gebruik de tijdputten van 30 minuten om achtergrondgeluid te regelen. Herhaal het hele experiment in drie 96 putplaten. Dit protocol ontwikkelt een snelle en betrouwbare test om alp-activiteit in S.aureus biofilm te meten die geen eiwitisolatie vereist.
Het representatieve resultaat van de ALP-activiteit laat een verhoogde trend zien gedurende maximaal 75 minuten. Na 75 minuten werd geen toename van de ALP-activiteit waargenomen. Het is zeer belangrijk om een goede biofilm cultuur vast te stellen en het kan nogal wat proeven te beheersen.
U biofilmvorming bevestigen door kristalviolettest uit te voeren zoals eerder gemeld door ons en anderen of u de plaat vooraf behandelen met menselijk plasma om biofilmvorming te vergemakkelijken. Na de ontwikkeling u potentiële ALP-remmers screenen die de vorming van biofilms kunnen verstoren. Het resultaat zal belangrijke informatie in de richting van biofilm management in medisch veld.
Vijf molaire natriumhydroxide kan gevaarlijk zijn in geval van contact. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt bij het hanteren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript presenteert een high-throughput methode om de alkalische fosfatase-activiteit in S. aureus biofilmculturen te kwantificeren met behulp van een 96-well tissue culture plaat. De methode is ontworpen om sensitief en eenvoudig uit te voeren te zijn, wat onderzoek naar de rol van alkalische fosfatase bij biofilmvorming faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Biofilmonderzoek
- Enzymologie
Achtergrond
- Alkalische fosfatase (ALP) is een enzym dat betrokken is bij diverse biologische processen.
- Inzicht in de rol van ALP bij biofilmvorming is essentieel voor microbiologische studies.
- High-throughput-methoden zijn onmisbaar voor een efficiënte gegevensverzameling in het onderzoek.
- Biofilms zijn complexe gemeenschappen van micro-organismen die een impact kunnen hebben op de gezondheidszorg en de industrie.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het meten van ALP-activiteit in biofilms.
- Om het inzicht in de functie van ALP bij biofilmvorming te vergroten.
- Om een protocol te bieden dat eenvoudig door onderzoekers kan worden overgenomen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van TSB met gebruik van pancreasdigest van caseïne, papaïnedigest van sojameel, natriumchloride, dextrose en dipotassiumfosfaat.
- Gebruik van een 96-wells weefselkweekplaat voor analyse met een hoge doorvoer.
- Meting van de alkalische fosfataseactiviteit in S. aureus biofilmculturen.
- Demonstratie van de procedure door Kevin Danikowski, een voormalige student van Harper College.
Belangrijkste resultaten
- De methode kwantificeert met succes de ALP-activiteit in biofilmculturen.
- De hoge gevoeligheid van de techniek maakt nauwkeurige metingen mogelijk.
- Het protocol is eenvoudig en kan gemakkelijk worden geïmplementeerd in diverse laboratoria.
- De inzichten uit deze studie kunnen toekomstig biofilmonderzoek informeren.
Conclusies
- De gevestigde methode is effectief voor het bestuderen van ALP in biofilms.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van de dynamiek van biofilms.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op dit protocol om andere aspecten van de biofilmbiologie te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Deze methode maakt een snelle, high-throughput kwantificering van de alkalische fosfatase-activiteit in S. aureus biofilm mogelijk zonder proteïne-isolatie, wat vroege target-validatie bij de ontdekking van antimicrobiële middelen ondersteunt. Door een sensitieve, reproduceerbare uitlezing van de extracellulaire enzymactiviteit te bieden, faciliteert het de mechanistische de-risking van therapeutische hypothesen met betrekking tot biofilms. De compatibiliteit van de assay met 96-wells plaatformaten maakt een naadloze integratie in screeningscascades voor lead-identificatie en het opbouwen van predictieve betrouwbaarheid mogelijk.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt de therapeutische hypothese dat alkalische fosfatase bijdraagt aan de vorming en persistentie van biofilms.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van targets mogelijk door middel van kwantitatieve meting van enzymactiviteit in intacte biofilmsystemen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door ALP-modulatie te koppelen aan biofilms-inhibitie-fenotypes.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt een gestandaardiseerd high-throughput formaat voor om de effecten van verbindingen op extracellulaire enzymatische markers te evalueren.
- Kwantitatieve output: Genereert op absorptie gebaseerde metingen bij 405 nm die dosis-responsanalyse en hit-bevestiging mogelijk maken.
- Schaalbaarheid: Maakt gebruik van een 96-wells plaatformaat om medium-throughput screening van inhibitor-bibliotheken te ondersteunen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Verbindt ALP-activiteit met de biofilm van S. aureus, een belangrijke virulentiefactor bij apparaatgerelateerde en chronische infecties.
- Translationele continuïteit: Biedt een op biomarkers afgestemde uitlezing die de brug slaat tussen ontdekking en preklinische effectiviteitstesten.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert go/no-go-criteria op basis van target-engagement en fenotypische impact in biofilmmodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het continuüm van de vroege ontdekking, waardoor targetvalidatie kan bijdragen aan leadidentificatie en de preklinische evaluatie van anti-biofilmstrategieën.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door ALP te meten als een functionele output van het biofilmmetabolisme.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten die geschikt zijn voor het screenen van verbindingenbibliotheken in microtiterplaten.
- Analytics: Biedt kinetische en eindpuntmetingen die een statistische vergelijking mogelijk maken tussen behandelde en controlecondities.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de ontwikkeling van biomarkers door enzymactiviteit te koppelen aan biofilmvorming en potentiële therapeutische interventies.
- Enterprise hergebruik: Creëert een herbruikbaar platform voor het bestuderen van extracellulaire enzymen in microbiële biofilms over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanische ambiguïteit rond de rol van ALP in biofilm te verminderen.
- Operationele waarde: Levert standaardisatie, sensitiviteit en reproduceerbaarheid via een eenvoudige colorimetrische uitlezing.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle screening van ALP-modulatoren mogelijk te maken met duidelijke fenotypische verbanden met biofilm.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door targetmodulatie te koppelen aan anti-biofilm effectiviteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist basiskennis van microbiologie voor de steriele biofilmkweek en het werken met S. aureus.
- Afhankelijk van toegang tot een plaatlezer voor 96-wells platen die in staat is tot absorbentiemetingen bij 405 nm.
- Maakt standaardisatie van de biofilmvormingscondities over wells en platen heen noodzakelijk voor betrouwbare vergelijkingen.
- Omvat optimalisatie-overwegingen bij uitbreiding naar andere bacteriële soorten of extracellulaire markers.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak om te corrigeren voor achtergrondabsorbentie en het waarborgen van een correcte reactiestop met NaOH.
