Name: Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Leer een hoogdoorvoets colorimetrische methode om alkalische fosfatase-activiteit te kwantificeren in S. aureus biofilmculturen met behulp van een 96-putjesplaat. Dit gevoelige protocol vergemakkelijkt onderzoek naar biofilmvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken William Rainey Harper College en de Universiteit van Illinois in Chicago voor de mogelijkheid om de uitvoering van deze experimenten. Wij danken ook McGraw Hill Foundation voor hun gulle steun.

1. middelgrote voorbereiding
<ol><li>1 L van al soja Bouillon (TSB) bereiden: in 1 L gedestilleerd water, voeg 15 g van alvleesklier digest van caseïne, 5 g van papaic digest van sojameel, 3 g natriumchloride, 2,5 g dextrose, en 2,5 g van dikaliumhexafluorozirkonaat fosfaat. Steriliseren vóór gebruik.</li>
	<li>Voor al soja Agar (TSA), 15 gram agar toevoegen aan 1 L van TSB, autoclaaf. Vervolgens laten afkoelen tot kamertemperatuur. Vervolgens giet in een verhouding van 20 mL per petrischaal (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Biofilm kweekmedium: Voeg 10 g glucose tot 1 L van gesteriliseerde met autoclaaf TSB. Steriliseren door filtratie met behulp van een 0,2 µm filter.</li>
</ol>2. S. aureus Biofilm vorming in 96 goed weefselkweek plaat
Opmerking: De biofilm van S. aureus is gekweekt als eerder beschreven6,21.
<ol><li>Een individuele kolonie van S. aureus van TSA in TSB 10 mL beënten en 's nachts groeien bij 37 ° C.</li>
	<li>Verdun de overnachting cultuur in 10 mL TSB/glucose (10 g/L) bij een verhouding van 1:100 (v/v). Vortex voorzichtig te mengen voor een consistente concentratie.</li>
	<li>Breng 200 mL verdunde cultuur in een totaal van 18 putten (meer voor experimentele groepen, deze een controle van de niet-biofilm te suggereren een relatie met ALP activiteit6) van één 96 goed plaat. Drieling gebruiken voor elk punt van de tijd: 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min. Zie stap 3.2.</li>
	<li>Incubeer de 96 goed plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur voor de biofilm vorming6,21.</li>
	<li>De bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.</li>
	<li>Wassen elk goed met 1 x fosfaatgebufferde oplossing (PBS, pH 7.4), gedurende 5 min bij 15.000 x g centrifugeren en de bovendrijvende vloeistof decanteren door aspiratie.</li>
</ol>3. meting van de ALP activiteit in S. aureus Biofilm
Opmerking: ALP activiteit werd gemeten als beschreven6,18.
<ol><li>Voeg 75 mL gebufferde ALP substraat verkrijgbare pNPP uit aan elk putje van stap 2.6 en beginnen met het opnemen van de tijd. Elk punt van de tijd opnemen in drievoud.</li>
	<li>Na incubatie gedurende een gevarieerd tijd: 0 min (control), 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min respectievelijk 75 µL van 5 M NaOH om te stoppen met de reactie toevoegen.</li>
	<li>De plaat gedurende 5 minuten bij 15.000 x gcentrifugeren.</li>
	<li>Pipetteer 100 µL van de bovendrijvende substantie in een nieuwe 96 goed plaat voor colorimetrische meting.</li>
	<li>Meet de extinctie van elke goed bij het gebruiken van 405 nm plaat een 96 goed lezer. Gebruik 0 min tijd wijs wells controle voor achtergrondruis van 405 nm.</li>
	<li>Herhaal het hele experiment in drie afzonderlijke 96 goed platen.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In onze assay gebruikten we pNPP als de ALP substraat. Dit is een werkende oplossing ontworpen voor ELISA en niet te worden verdund. Na hydrolyse door ALP, een gele product ontwikkelt en kan worden gemeten op 405 nm. Aan het einde van de enzymatische reactie, we kort de 96 goed plaat gecentrifugeerd en het supernatant overgebracht naar een verse 96 goed plaat voor het meten van de absorptie met behulp van de-afleesapparaat. We vonden dat deze extra centrifugeren stap is van cruciaal belang, aangezien hierdoor de samenhan...

Alkalische fosfatase (ALP) is overal uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen1. Het kan het katalyseren van de hydrolyse van monofosfaat uit verschillende moleculen zoals nucleotiden, eiwitten, alkaloïden, fosfaatesters en afgeleide anhydriden van fosforzuur. Bij de mens is eukaryote ALP aanwezig in vele weefsels, waaronder bot, lever, darm en placenta2. Het speelt een belangrijke rol in proteïne fosforylatie, celgroei, apoptosis, stamcel processen evenals normale skelet mineralisatie. Eukaryotische ALP is ook een belangrijke serum-indicator voor de aanwezigheid van ziekten in bot, lever en andere weefsels/organen wanneer verhoogde3,4.
Prokaryote ALP is geconstateerd in een verscheidenheid van bacteriële cellen, met inbegrip van E. coli5, S. aureus6,7 en sommige gemeenschappelijke pens bacteriën in de bodem-8. Bacteriële ALP activiteit is gebruikt als een biosensor in de detectie van bacteriële besmetting10, pesticiden en zware metalen9 . De constitutieve uitdrukking van ALP is gebruikt om te identificeren van de staphylococcen11 en Serratia onderscheiden van Enterobacter12. Verder wordt voorgesteld dat de constitutieve ALP productie is gecorreleerd met pathogeniteit in staphylokokken13. Hoewel ALP is onderzocht in verschillende instellingen,3,4, is nog weinig gerapporteerd voor de activiteit en de functie in biofilms culturen.
Een biofilm heeft gedocumenteerd te hebben een verschillend functionerende bacteriële leven ten opzichte van haar free-living bacteriële cel tegenhanger14. In S. aureus, is de vorming van een biofilm geconstateerd in een verscheidenheid van klinische omstandigheden en rekeningen voor de resistentie tegen antibiotica en chronische ontsteking15,16. Veel moleculen te vinden in een biofilm matrix zoals polysacchariden, eiwitten, nucleïnezuren en lipiden had gemeld, maar het mechanisme van biofilm vorming is niet volledig begrepen14. Om te begrijpen van de rol van ALP in biofilm vorming, we gekweekt van S. aureus biofilms in 96 goed weefselkweek platen en de activiteit van de ALP met behulp van para-nitrophenylphosphate (pNPP) gemeten.
De pNPP van het molecule is een kant-en-klare substraat voor ALP en is wijd verbeid gebruikt voor het meten van de ALP activiteit6,17,18. Deze colorimetrische bepaling is gebaseerd op de omzetting van para-nitrofenyl fosfaat (pNPP) te para-nitrofenol, resulterend in een gekleurd product op 405 nm. Vergeleken met andere conventionele ALP assay, zoals agarose gel elektroforese19, tarwekiemen agglutinin (WGA) neerslag, en WGA-HPLC20, deze test zeer specifiek is, zorgt gevoelig, gemakkelijk te reproduceren, en de meeste bovenal voor hoge doorvoer.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH pellets</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrofenylfosfaat (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Typische concentraties van vloeibare pNPP-substraten, vaak gebruikt in enzymgekoppelde immunosorptietests (ELISA), variëren tussen 10 tot 50 mM. Net als bij de meeste kant-en-klare vloeibare pNPP-substraten, zoals degene die hier wordt gebruikt, wordt de exacte pNPP-concentratie niet bekendgemaakt vanwege de bedrijfsgeheimen.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; g/L Pancreatische digestie van Caseïne............ 15.0 Papaïne digestie van sojameel.........5.00 Natriumchloride.............................. 3.00 Destrose........................................&nbsp; 2.50 Dikaliumfosfaat..................2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 wells tissuecultuur platen</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>U gevormde bodem</td></tr></tbody></table>

colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in s. aureus biofilm

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Alkalische fosfatase (ALP) is een gemeenschappelijk enzym uitgedrukt in zowel prokaryote en eukaryote cellen. Het katalyseert de hydrolyse van fosfaat monoesters uit veel moleculen met een pH van fundamentele en speelt een onmisbare rol in het metabolisme van fosfaat. Bij de mens is eukaryote ALP een van de meest gebruikte enzymatische signalen in de diagnose van verschillende ziektes zoals cholestase en rachitis. In S. aureus, ALP wordt gedetecteerd uitsluitend op de celmembraan; het wordt ook uitgedrukt als een secretoire vorm ook. Nog, er is weinig bekend over de functie bij de vorming van biofilms.
Het doel van dit manuscript is om een snelle en betrouwbare test voor het meten van de ALP activiteit in S. aureus biofilm die geen eiwit isolatie vereist. Met behulp van p-nitrofenyl fosfaat (pNPP) als substraat, we gemeten ALP activiteit in S. aureus biofilm gevormd in de weefselkweek 96-wells-platen. Activiteit is gebaseerd op de vorming van de oplosbare reactieproduct gemeten door absorptie van 405 nm. De aard van de hoge doorvoer van de methode van de plaat 96 goed weefselkweek biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor ALP activiteit testen. Hetzelfde experimentele instellen kan ook worden uitgebreid tot andere extracellulaire moleculaire merkers aan biofilm vorming gerelateerde meten.

Figuur 1 toont een representatief resultaat van ALP activiteit van biofilm culturen van S. aureus in 96 goed weefselkweek platen. 75 μL van verkrijgbare pNPP oplossing was toegevoegd aan elk goed en bebroede bij kamertemperatuur. Na incubatie gedurende verschillende tijden (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min en 75 min, respectievelijk) 75 μL van 5 M NaOH toevoegde aan zet de reactie stop. Het product werd vervolgens gemeten in een 96 goed afleesap...

In dit manuscript opgericht wij een hoge doorvoersnelheid methode om te kwantificeren van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus biofilm cultuur van weefselkweek 96-wells-plaat

Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Dit protocol presenteerde een eenvoudige en betrouwbare methode om gealkde fosfataseactiviteit in de biofilmcultuur van S.aureus te meten. Het zal ons helpen om de functie van ALP in biofilmvorming te begrijpen. Het grote voordeel van deze techniek is een hoge doorvoer.Het is zeer gevoelig en gemakkelijk uit te voeren. Demonstreren van de procedure zal Kevin Danikowski, een voormalige student van Harper College. Om TSB voor te bereiden, voeg alvleeskliervertavel van caseïne, papaïsche vertering van sojameel, natriumchloride, dextrose en dipotassiumfosfaat toe aan gedestilleerd water.Bedek de kolf met aluminiumfolie en doe het in een autoclave om te steriliseren voor gebruik. Om een TSA voor te bereiden, voeg agar toe aan TSB en zet het in de autoclave voor sterilisatie. Laat het dan afkoelen tot kamertemperatuur.Giet het vervolgens in de petrischaal met een verhouding van 20 milliliter per gerecht. Om een biofilm kweekmedium voor te bereiden, voeg glucose toe aan autoclaved TSB om de concentratie van 10 gram per liter te bereiken. Met behulp van een vacuümfiltratiekit filtrate de oplossing met een filter van 0,2 micrometer.Om te inenten, gebruik een gesteriliseerde inentingslus om een individuele kolonie Staph aureus uit de petrischaal te plukken en deze in de kweekbuis te plaatsen gevuld met 10 milliliter TSB. Zet de buis in de couveuse om 's nachts te groeien op 37 graden Celsius. Met een micropipet, teken 100 microliters van 's nachts cultuur en breng het naar een cultuur buis gevuld met 10 milliliter TSB met glucose voor een 1:100 volume verhouding verdunning.Vortex voorzichtig te mengen voor een consistente concentratie. Gebruik een micropipet om 200 microliter van verdunde cultuur over te brengen in een totaal van 18 putten van een 96 put plaat. Incubeer de 96 put plaat op 37 graden Celsius gedurende 24 uur voor biofilm vorming.Voor de beste biofilmvorming van S.aureus is het beter om een platte of ronde bodem 96 putplaat te kiezen. Daarna kantel je de plaat iets om de supernatant te decanteren door aspiratie vanaf de rand van elke put. Was elk goed met 1X PBS.Doe de plaat in de centrifuge om vijf minuten te draaien bij 8.000 omwentelingen per minuut en decanteer de supernatant door aspiratie. Voeg 75 microliters gebufferd ALP-substraat toe bestaande uit commercieel verkrijgbaar PNPP aan elke put en gebruik een timer om elk keer punt in drievoud op te nemen. Voeg na elk incubatietijdpunt 75 microliters van vijf molaire natriumhydroxide toe aan elk van de drie putten om de reactie te stoppen.Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 800 omwentelingen per minuut. Gebruik een pipet om 100 microliter supernatant over te brengen in een nieuwe 96 putplaat voor calorimetrische meting. Gebruik een 96 goed plaatlezer om de absorptie van elke put te meten op 405 nanometer.Gebruik de tijdputten van 30 minuten om achtergrondgeluid te regelen. Herhaal het hele experiment in drie 96 putplaten. Dit protocol ontwikkelt een snelle en betrouwbare test om alp-activiteit in S.aureus biofilm te meten die geen eiwitisolatie vereist.Het representatieve resultaat van de ALP-activiteit laat een verhoogde trend zien gedurende maximaal 75 minuten. Na 75 minuten werd geen toename van de ALP-activiteit waargenomen. Het is zeer belangrijk om een goede biofilm cultuur vast te stellen en het kan nogal wat proeven te beheersen.U biofilmvorming bevestigen door kristalviolettest uit te voeren zoals eerder gemeld door ons en anderen of u de plaat vooraf behandelen met menselijk plasma om biofilmvorming te vergemakkelijken. Na de ontwikkeling u potentiële ALP-remmers screenen die de vorming van biofilms kunnen verstoren. Het resultaat zal belangrijke informatie in de richting van biofilm management in medisch veld.Vijf molaire natriumhydroxide kan gevaarlijk zijn in geval van contact. Zorg ervoor dat u persoonlijke beschermingsmiddelen draagt bij het hanteren.

colorimetric-analysis-alkaline-phosphatase-activity-s-aureus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Source: Vidilaseris, K., et al. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a colorimetric assay to screen inhibitors of bacterial membrane-bound pyrophosphatase (mPPase) by quantifying orthophosphate release. The method enables identification of compounds that inhibit mPPase from Thermotoga maritima, a potential antimicrobial drug target.

Screening Inhibitors of Bacterial Membrane-Bound Pyrophosphatase Using a Colorimetric Assay 

Source: Tay, S. B., et al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method to quantify biofilm biomass in a pathogenic bacterium, comparing untreated controls with samples treated with a quorum-quenching enzyme. The enzyme disrupts bacterial signaling during early incubation, reducing cell adhesion. After washing and further incubation, control wells form dense biofilms, while treated wells show...

Quantifying Enzyme-Induced Biofilm Suppression in Pathogenic Bacteria

This video demonstrates an in vitro assay to study neutrophil-biofilm interaction. The pathogenic bacteria embedded in the biofilm and isolated neutrophils were tagged using fluorescent labels, and the immune response by the neutrophils and the evasion of the immune response by the bacteria were assessed using a fluorescence microscope.

An In Vitro Assay to Study the Interaction between Neutrophils and Biofilm

Unlike die gezien eukaryoten, er een gebrek aan studies die details membraan depolarisatie en ionenconcentratie veranderingen in bacteriën, vooral als hun kleine formaat maakt conventionele meetmethoden moeilijk. Hier hebben we detail protocollen voor toezicht op dergelijke gebeurtenissen in de grote Gram-positieve ziekteverwekker Streptococcus pneumoniae met behulp van fluorescentie technieken.

Monitoring Veranderingen in Membrane Polariteit, Membraan Integriteit, en intracellulaire Ion concentraties in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Het gebruik van fluorescente kleurstoffen

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

De meeste bacteriële infecties produceren een biofilm. Vanwege hun omgeving zijn biofilm-geassocieerde bacteriën vaak fenotypisch resistent tegen geneesmiddelen. Nieuwe antibacteriële moleculen die bacteriën in biofilms doden, hebben dus een hoge prioriteit. We stellen een test op om snel te screenen op antimicrobiële verbindingen die effectief zijn bij het uitroeien van biofilms.

Gericht op biofilm geassocieerde<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met behulp van Resazurin Gebaseerd Drug-gevoeligheid Assay

Dit manuscript beschrijft een protocol om te bestuderen van de antimicrobiële werking van 5-aminolevulinic zuur-gemedieerde Fotodynamische therapie (PDT-ALA) op een biofilm Staphylococcus aureus . Dit protocol kan worden gebruikt om een in vitro model om te bestuderen van de behandeling van bacteriële biofilms met PDT in de toekomst te ontwikkelen.

Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm

Het protocol beschrijft de teelt van cross-kingdom biofilms bestaande uit Candida albicans en Streptococcus mutans en presenteert een confocale microscopie-gebaseerde methode voor het monitoren van extracellulaire pH in deze biofilms.

Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms met behulp van ConfocalMicroscopie

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor de meting van isolevuglandinen in weefsels door immunofluorescentie met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde ScFv D11-antilichamen. Hypertensiemodellen bij zowel muizen als mensen worden gebruikt om de stapsgewijze procedures en fundamentele principes uit te leggen die verband houden met isolevuglandinemeting in weefselmonsters.

Directe detectie van isolevuglandinen in weefsels met behulp van een D11 scFv-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en immunofluorescentie

Dit protocol beschrijft de studie van neutrofiel-biofilm interacties. Staphylococcus aureus biofilms worden in vitro vastgesteld en geïncubeerd met perifere bloed-afgeleide menselijke neutrofielen. De oxidatieve burst-respons van neutrofielen wordt gekwantificeerd en de neutrofiellokalisatie in de biofilm wordt bepaald door microscopie.

Gestandaardiseerde in vitro assays om interacties tussen menselijke neutrofielen en staphylococcus aureus biofilms te visualiseren en te kwantificeren

Leer een hoogdoorvoets colorimetrische methode om alkalische fosfatase-activiteit te kwantificeren in S. aureus biofilmculturen met behulp van een 96-putjesplaat. Dit gevoelige protocol vergemakkelijkt onderzoek naar biofilmvorming.

Colorimetrische analyse van alkalische fosfatase activiteit in S. aureus Biofilm

Meer video's verkennen